許海甲，李章華，侯煜東，方衛(wèi)軍，唐歡

武漢大學(xué) 人民醫(yī)院，湖北 武漢 430060

缺血性股骨頭壞死（ascular necrosis of femoral head，ANFH）是臨床上的常見多發(fā)病，主要見于中青年患者，其致殘率高，遠(yuǎn)期預(yù)后較差[1]。目前臨床上有多種治療ANFH的方法，包括物理治療、髓芯減壓、旋轉(zhuǎn)截骨、帶或不帶血管蒂的骨移植、介入治療等[2]，但上述方法的治療效果有限，最終難以避免股骨頭塌陷，須行髖關(guān)節(jié)置換術(shù)。近年來骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）移植治療ANFH的研究被廣泛開展，甚至用于臨床治療，取得了一定的治療效果[3]，然而在評價股骨頭壞死后病灶改變及治療修復(fù)程度上缺少成熟有效的方法，普通CT、MRI 檢測僅能觀察較大范圍的骨形態(tài)及骨性質(zhì)改變，常用的Harris 評分和目測類比評分等方法容易受主觀因素影響且無法用于實(shí)驗動物。Micro-CT作為一種新的影像學(xué)檢測技術(shù)，分辨率可達(dá)微米級，能清晰顯示出骨骼中骨小梁等微觀結(jié)構(gòu)，對ANFH標(biāo)本骨小梁等微結(jié)構(gòu)變化具有極高的敏感性[4]。在本研究中，我們通過Micro-CT 來評價Runx2基因修飾MSCs 靜脈移植促進(jìn)ANFH 的修復(fù)效果，為應(yīng)用Micro-CT觀察股骨頭壞死修復(fù)過程提供實(shí)驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

雄性大耳白兔24只，體重（1.5±0.25）kg，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗動物中心提供（SCXK（京）2007-0003），單籠飼養(yǎng)，自由飲水。24 只大耳白兔ANFH造模后隨機(jī)分為4 組，A 組為AdEasy/Runx2修飾的MSCs靜脈植入組，B組為Runx2siRNA修飾的MSCs靜脈植入組，C組為單純MSCs靜脈植入組，D組為生理鹽水植入組。

兔MSCs 由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗室提供；AdEasy/Runx2由前期實(shí)驗構(gòu)建成功[5]；Western印跡檢測用anti-Cbfa1多克隆抗體（LifeSpan BioSciences 公司），anti-GAPDH 多克隆抗體、羊抗兔二抗（康為世紀(jì)公司）；Real-time PCR 檢測試劑盒（Kapa 公司）；TRIzol 裂解液（Sigma公司）；蛋白抽提試劑（Fermentas 公司）；低糖型DMEM 培養(yǎng)基（L-DMEM）、胎牛血清（Gibico 公司）；青霉素、鏈霉素（華北制藥股份有限公司）；胰蛋白酶（Amresco 公司）；烏拉坦（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；兔Runx2反義核苷酸siRNA（上海吉瑪公司，正義鏈5'-CACGCUAUUAAAUCCAAAUTT-3'，反義鏈5'-AUUUGGAUUUAAUAGCGUGTT-3'）；PCR 引 物（北京生工公司）。

二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo Scientific 公司）；超凈工作臺（北京長城公司）；臺式高速離心機(jī)（Eppebdorf 公司）；實(shí)時熒光定量PCR 儀（Stratagene 公司）；免疫酶聯(lián)儀（Lab System公司）；蛋白電泳儀（BioRad公司）；紫外分光光度計（Pharmacia公司）；Micro-CT（Siemens公司）。

1.2 兔ANFH模型的建立

參考崔西龍等[6]的方法建立ANFH模型。用5%烏拉坦按1 mg/kg 的劑量行腹腔注射麻醉，先取俯臥位髖部外側(cè)切口，以大轉(zhuǎn)子處為中心切開皮膚約4 cm，分離臀部肌肉，顯露髖關(guān)節(jié)，切開關(guān)節(jié)囊，用液氮冷凍至股骨頭表面關(guān)節(jié)軟骨呈石膏色，冷凍結(jié)束后立即用37℃的生理鹽水將股骨頭復(fù)溫3 min，逐層縫合傷口，縫合皮下組織及皮膚。再取仰臥位，沿腹股溝做切口約2 cm，顯露旋股內(nèi)外側(cè)動脈，分離并結(jié)扎旋股內(nèi)外側(cè)動脈，縫合傷口。術(shù)后每天用碘酒消毒手術(shù)切口2 次，注射青霉素40 萬U/d，連續(xù)5 d。

1.3 MSCs體外Runx2基因修飾

取MSCs于25 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中傳代擴(kuò)增，至一定數(shù)量后，將細(xì)胞分為3 組：①轉(zhuǎn)染AdEasy/Runx2組；②轉(zhuǎn)染Runx2siRNA組；③單純細(xì)胞組。待細(xì)胞生長融合至70%～80%時，棄培養(yǎng)液，換為無血清LDMEM 培養(yǎng)液，第①組細(xì)胞轉(zhuǎn)入6×106IU AdEasy/Runx2，第②組細(xì)胞轉(zhuǎn)入250 pmolRunx2siRNA，第③組細(xì)胞不做處理，所有細(xì)胞在5% CO2、37℃孵箱中培養(yǎng)24 h后換完全培養(yǎng)液。

1.4 Western 印跡檢測基因修飾后Runx2 蛋白的表達(dá)水平

收集細(xì)胞于EP管，用80 μL蛋白提取液提取約1×106細(xì)胞總蛋白，冰浴裂解30 min，4℃、12 000 r/min離心15 min，取上清用BCA法定量蛋白，加蛋白上樣緩沖液煮沸5 min，取40 μg 蛋白行蛋白電泳，濃縮膠80 V 電壓、分離膠120 V 電壓，100 V 電壓60 min 電轉(zhuǎn)蛋白至PVDF 膜，用5%脫脂奶封閉60 min，加一抗1∶1000 稀釋后孵育60 min，用TBST 洗膜5 min×3 次，加二抗1∶8000 稀釋后孵育60 min，用TBST洗膜5 min×3次，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像。

1.5 Real-time PCR 檢測基因修飾后Runx2 mRNA的表達(dá)水平

收集細(xì)胞于EP 管，約1×106個細(xì)胞加1 mL TRIzol 裂解液，按Sigma 公司提供的說明書提取總RNA，紫外分光光度計定量RNA，取1 μg總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按PCR 試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗。GAPDH 上游引物為5'-TGGAATCCACTGGCGTCTT C-3'，下游引物為5'-GGTTCACGCCCATCACAAAC-3'；Runx2上游引物為5'-GACTGTGGTTACCGTCAT GGC-3'，下游引物為5'-ACTTGGTTTTTCATAACA GCGGA-3'。反應(yīng)體系：2×Kapa SYBR Fast qPCR Mix 10 μL，上、下游引物各400 nmol/L，cDNA 約50 ng，加ddH2O至總體積20 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性10 s，60℃退火15 s，72℃延伸10 s，40個循環(huán)。

1.6 MSCs收集及靜脈注射

兔ANFH 造模4 周后，收集體外Runx2修飾的MSCs，計數(shù)后用生理鹽水將細(xì)胞終濃度調(diào)至5×106/mL。于耳緣靜脈注射細(xì)胞懸液，A組每只兔注入1×107個AdEasy/Runx2轉(zhuǎn)染的MSCs，B 組兔注入1×107個Runx2siRNA 轉(zhuǎn)染的MSCs，C 組兔注入1×107個未處理組MSCs，D 組作為對照組，注入等體積生理鹽水。

1.7 股骨頭標(biāo)本采集及Micro-CT掃描

細(xì)胞植入后分別于2、4、6、8周后取出各組股骨頭標(biāo)本，浸泡在福爾馬林液里密封保存。于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗動物研究所完成Micro-CT 掃描，掃描部位取家兔股骨標(biāo)本近端股骨頸以上至股骨頭末端，保持股骨長軸與掃描室切面垂直，設(shè)定掃描參數(shù)為掃描層面厚度20 μm、球管電壓80 kV、電流500 μA。掃描完成后，選取股骨頭區(qū)域進(jìn)行分析、比較。觀察比較各組兔股骨頭形態(tài)、關(guān)節(jié)面有無變形塌陷，軟骨下骨密度、骨小梁分布及形態(tài)等。

2 結(jié)果

2.1 AdEasy1/Runx2轉(zhuǎn)染MSCs的效率及鑒定

AdEasy 載體攜帶GFP 標(biāo)簽，AdEasy1/Runx2轉(zhuǎn)染MSCs 培養(yǎng)約48 h 后，熒光顯微鏡下可見細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，當(dāng)MOI 為80 時，約80%的細(xì)胞可發(fā)熒光，AdEasy1/Runx2可有效感染MSCs（圖1）。一般情況下MSCs 表達(dá)的Runx2水平很低，但AdEasy1/Runx2轉(zhuǎn)染后MSCs 中Runx2mRNA 的表達(dá)水平明顯提高（圖2），蛋白水平也顯示Runx2的表達(dá)顯著增加（圖3），說明轉(zhuǎn)入的外源性Runx2極大地增強(qiáng)了MSCs表達(dá)Runx2mRNA及Runx2蛋白的能力。

2.2 Runx2 siRNA轉(zhuǎn)染MSCs效果鑒定

圖1 MSCs形態(tài)觀察

圖2 Real-time PCR檢測轉(zhuǎn)染AdEasy1/Runx2后Runx2 mRNA表達(dá)

Runx2反義核苷酸序列siRNA 轉(zhuǎn)染MSCs 后，對MSCs 的生長及形態(tài)無明顯影響。以不加siRNA 細(xì)胞為對照組，含50 nmol/L siRNA 的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h 后可明顯降低Runx2的mRNA 表達(dá)水平（圖4），Runx2蛋白表達(dá)水平也明顯被抑制（圖5）。

2.3 Micro-CT掃描結(jié)果

第2周Micro-CT掃描結(jié)果顯示各組股骨頭均有壞死，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)面邊緣模糊，軟骨面骨皮質(zhì)厚度變薄，關(guān)節(jié)面下骨密度分布不均勻，軟骨下出現(xiàn)囊性樣改變，骨小梁稀疏、出現(xiàn)斷裂不連續(xù)、結(jié)構(gòu)紊亂，骨小梁間隙變寬，但各組間差異不明顯。至第4周，A、B、C組骨壞死程度不再加劇，并出現(xiàn)輕度修復(fù)反應(yīng)；而D組無改善，骨小梁進(jìn)一步減少，骨小梁間隙進(jìn)一步增加，皮質(zhì)骨下部分區(qū)域出現(xiàn)骨缺損形成小空洞。第6周，A、B、C組出現(xiàn)更為明顯的修復(fù)反應(yīng)，骨皮質(zhì)厚度增加，骨小梁數(shù)目及厚度增大，其中以A組表現(xiàn)較為明顯，B 組相對較差；而D 組骨質(zhì)進(jìn)一步減少，骨皮質(zhì)邊緣不光滑，甚至有塌陷，皮質(zhì)骨下空洞較之前更為擴(kuò)大，骨小梁數(shù)目嚴(yán)重減少。至第8 周時各組表現(xiàn)出顯著差異，A組股骨頭關(guān)節(jié)面清晰、形態(tài)完整，軟骨下骨質(zhì)密度均勻，骨小梁致密，股骨頭形態(tài)基本接近正常；B組股骨頭形態(tài)較A組差，但較其第2 周時有明顯改善；C 組修復(fù)情況介于兩者之間；D組股骨頭壞死嚴(yán)重，關(guān)節(jié)面有塌陷，關(guān)節(jié)面下出現(xiàn)較大骨缺損空洞，骨小梁變薄變稀疏，骨密度也嚴(yán)重下降（圖6）。圖7 為A、D 組股骨頭在各時間點(diǎn)的Micro-CT掃描比較。

圖3 Western印跡檢測轉(zhuǎn)染AdEasy1/Runx2后Runx2蛋白的表達(dá)

圖4 Real-time PCR檢測轉(zhuǎn)染Runx2 siRNA后Runx2 mRNA的表達(dá)

圖5 Western印跡檢測轉(zhuǎn)染Runx2 siRNA后Runx2蛋白的表達(dá)

3 討論

圖6 8周時股骨頭Micro-CT檢測結(jié)果

ANFH主要的骨形態(tài)改變表現(xiàn)為骨質(zhì)連續(xù)性破壞和骨小梁形態(tài)異常，股骨頭壞死的生物應(yīng)力可改變骨小梁的立體結(jié)構(gòu)及空間排列，使其力學(xué)強(qiáng)度減弱，最終難以承重導(dǎo)致塌陷[7]。ANFH 發(fā)生后，成骨細(xì)胞介導(dǎo)的新生骨生長和破骨細(xì)胞介導(dǎo)的壞死骨吸收同時出現(xiàn)[8]。隨著兩種作用的進(jìn)展，骨內(nèi)微觀結(jié)構(gòu)尤其是骨小梁形態(tài)會發(fā)生不斷改變。檢測和觀察股骨頭壞死病灶局部微觀結(jié)構(gòu)動態(tài)變化的過程，是判斷病程進(jìn)展、評價修復(fù)程度的重要方法，過去因缺少有效檢測方法而難以評價。隨著影像學(xué)檢測技術(shù)的進(jìn)步，應(yīng)用Micro-CT 可對在體及離體骨組織微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行高清成像，其分辨率可達(dá)微米級別，而不破壞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，結(jié)合相關(guān)分析軟件可以對骨小梁相關(guān)參數(shù)和骨密度等指標(biāo)進(jìn)行定量分析[9]，此外結(jié)合血管灌注造影技術(shù)還可對股骨頭血供進(jìn)行立體觀察[10]，這提供了一種通過微觀結(jié)構(gòu)定性定量精確評價股骨頭的有效方法。

MSCs 移植治療ANFH 已被大量運(yùn)用于科研實(shí)驗及臨床治療之中，常見的方法包括髓芯鉆孔減壓聯(lián)合MSCs 注射移植、介入加MSCs 移植、基因轉(zhuǎn)染MSCs 靜脈移植等，均有一定的治療效果[11]。Runx2是一種成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子，體內(nèi)外研究均表明Runx2過表達(dá)可增強(qiáng)MSCs的成骨分化能力，促進(jìn)修復(fù)骨缺損及骨壞死[12]。而將Runx2基因轉(zhuǎn)染MSCs后靜脈移植治療ANFH，觀察其修復(fù)股骨頭壞死、預(yù)防股骨頭塌陷的相關(guān)研究尚未見報道。

本研究對各處理組兔細(xì)胞移植后2、4、6、8周不同時段取股骨頭標(biāo)本行Micro-CT 檢測，觀察股骨頭修復(fù)過程中微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)變化及計量學(xué)參數(shù)對比，不僅可以比較組間修復(fù)差異，還能動態(tài)評價病灶修復(fù)進(jìn)程。Micro-CT 檢測結(jié)果顯示MSCs 移植治療組自第2周開始股骨頭微觀結(jié)構(gòu)逐漸改善，至第8周時取得了較好的修復(fù)效果，股骨頭形態(tài)完整，但又以Runx2修飾組修復(fù)效果最明顯，Runx2抑制組修復(fù)效果相對較差。對照組自第2周起股骨頭微觀結(jié)構(gòu)逐漸破壞，至8 周后骨小梁形態(tài)嚴(yán)重異常，股骨頭塌陷，這可能與其力學(xué)強(qiáng)度喪失有關(guān)[7]。本研究肯定了MSCs 移植治療兔ANFH 的效果，且證明Runx2基因修飾后能進(jìn)一步提升MSCs移植后的治療效果。

本實(shí)驗雖然在腺病毒介導(dǎo)的Runx2轉(zhuǎn)染MSCs移植治療組取得了最佳療效，但腺病毒載體的生物安全性還有待進(jìn)一步檢測[13]。MSCs 可大量歸巢至骨壞死病灶，也有部分能歸巢至其他部位[14]，Runx2的高表達(dá)可能促成異位成骨或其他異常情況。實(shí)驗中僅僅檢測了短期修復(fù)效果，遠(yuǎn)期療效有待評估。此外，我們選取兔作為造模對象，其主要靠后肢承重，但仍為四足動物，這與人的生理結(jié)構(gòu)和承重機(jī)制仍有一定差異?？傊?，Runx2修飾MSCs后靜脈移植可作為ANFH 的一種新的治療方法，但將此方法應(yīng)用于人體的安全因素及治療效果仍須繼續(xù)探索。

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