郝建安，楊波，姜天翔，張愛(ài)君，張曉青，司曉光，杜瑾，張雨山，王靜

國(guó)家海洋局 天津海水淡化與綜合利用研究所，天津 300192

微生物絮凝劑（microbail flocculant）是一類由微生物產(chǎn)生的，可使液體中固體懸浮顆粒、菌體細(xì)胞及膠體凝集、沉淀的特殊高分子代謝物。其具有安全無(wú)毒、無(wú)二次污染，作用對(duì)象廣泛、凈化效果明顯，來(lái)源廣泛、預(yù)期成本低等優(yōu)點(diǎn)，已成為絮凝劑領(lǐng)域研究的新熱點(diǎn)[1]。

微生物絮凝現(xiàn)象的研究起步很早，1876年，Louis Pasteur 就發(fā)現(xiàn)酵母菌可產(chǎn)生絮凝現(xiàn)象[2]。1976年，Junji Nakamura 等分離到可產(chǎn)絮凝活性物質(zhì)的醬油曲 霉（Aspergillus sojae）AJ 7002[3]；1986 年，Ryuichiro Kurane 等采用從自然界分離出的紅平紅球菌制成絮凝劑NOC-1，并把它用于畜產(chǎn)廢水處理、膨脹污泥處理、磚場(chǎng)生產(chǎn)廢水處理及廢水的脫色處理，都取得了很好的處理效果，被認(rèn)為是目前發(fā)現(xiàn)的最好的生物絮凝劑[4]；1991 年，Kazuki Toeda 等發(fā)現(xiàn)一株可產(chǎn)微生物絮凝劑的協(xié)腹產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes cupidus）KT201[5]；2002年，Zhang Jianfa等自纖維堆囊菌（Sorangium cellulosum）NUST06 中分離到一種胞外多糖類絮凝劑[6]；2010年，Satish V.Patil等自印度固氮菌（Azotobacter indicus）ATCC 9540 中也發(fā)現(xiàn)了胞外多糖類絮凝劑[7]。截止目前，科學(xué)家已經(jīng)陸續(xù)從陸地、海洋與其他環(huán)境中分離出多種絮凝活性微生物，涵蓋數(shù)十個(gè)種屬[8-11]。

常壓室溫等離子體（atmospheric room-temperature plasma，ARTP），利用氦氣輝光放電產(chǎn)生的等離子體射流作用于微生物，引起微生物的突變。氦氣輝光放電的主要優(yōu)點(diǎn)包括：溫度低，射流的溫度可以維持在40℃以下；放電均勻；等離子體射流的活性粒子種類豐富，主要包括He*（氦的激發(fā)態(tài)），以及氮離子、氧離子等。等離子體射流的活性粒子可以作用于細(xì)胞內(nèi)的DNA 物質(zhì)上，引起DNA 物質(zhì)的損傷，并通過(guò)不完全的修復(fù)過(guò)程引起基因位點(diǎn)突變。該方法首次應(yīng)用在鏈霉菌（Streptomyces avermitilis）的選育中，獲得高產(chǎn)除蟲(chóng)菌素的突變株[12]，目前用于綠色糖單胞菌（Saccharomonospora viridis）[13]、茂源鏈輪絲菌（Streptoverticillium mobaraense）[14]、圓紅冬 孢酵母（Rhodosporidum toruloides）[15]等30 多種生物的誘變選育中。

目前，微生物絮凝劑在工業(yè)化中的應(yīng)用受到生產(chǎn)成本過(guò)高的制約[16]，因此，選育微生物絮凝劑的高產(chǎn)菌株，開(kāi)展適合工業(yè)生產(chǎn)的菌株誘變育種，提高微生物絮凝劑的產(chǎn)量是非常必要的。在本研究中，我們利用常壓室溫等離子體誘變系統(tǒng)對(duì)產(chǎn)絮凝劑的海洋地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）DHS-40 進(jìn)行誘變，篩選微生物絮凝劑高產(chǎn)菌株，并對(duì)突變株產(chǎn)微生物絮凝劑的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行研究，獲得了遺傳穩(wěn)定性良好的高產(chǎn)突變菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

產(chǎn)微生物絮凝劑菌株海洋地衣芽孢桿菌DHS-40 為本實(shí)驗(yàn)室從天津塘沽海河入?？诘奈勰嘀泻Y選并保存。

LB培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，pH7.0（固體培養(yǎng)基添加1.5%～2%瓊脂粉），121℃滅菌30 min。

1.2 菌懸液的制備

取斜面保存的菌種，接種于LB 固體培養(yǎng)基中，30℃恒溫培養(yǎng)2 d，挑取單菌落轉(zhuǎn)接到LB 液體培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)2 d，取10 mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液，4℃、6000 r/min 離心5 min，收集菌體，用10 mL 生理鹽水沖洗2～3 次，將菌體懸浮于無(wú)菌生理鹽水中制備菌懸液，并將菌懸液濃度調(diào)整到D600nm為0.5～0.7（106～108個(gè)/mL）。

1.3 ARTP誘變方法

采用北京思清源生物科技有限公司生產(chǎn)的ARTP-Ⅱ型常壓室溫等離子體誘變系統(tǒng)。吸取10 μL 制備好的菌懸液，涂布在已滅菌的金屬載片上，將載片置于載物臺(tái)上，調(diào)整載物臺(tái)高度，設(shè)定好處理時(shí)間后進(jìn)行照射。本實(shí)驗(yàn)以氦氣為載體，照射功率100 W，工作氣流量10 SLPM，照射距離2 mm。照射處理后將載片轉(zhuǎn)移到裝有1 mL 無(wú)菌生理鹽水的EP管中，振蕩1～2 min，使附著在載片上的菌體洗脫到生理鹽水中，形成新的菌懸液。將新的菌懸液稀釋至10-4、10-5、10-6共3個(gè)梯度，每個(gè)梯度涂布3塊平板，將涂布后的平板放置培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

分別考察照射時(shí)間為30、60、90、120、150、180、210、240、270、300 s時(shí)的活菌數(shù)，以未處理樣品為參照，通過(guò)菌落計(jì)數(shù)計(jì)算致死率，確定最佳照射時(shí)間。

1.4 絮凝活性篩選

取6個(gè)大燒杯，每個(gè)燒杯中加入1 L調(diào)好濁度的水，其中1 個(gè)為空白對(duì)照，另5 個(gè)燒杯添加絮凝劑樣品。絮凝攪拌分兩階段控制：第一階段為快速混合階段，攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min，持續(xù)2 min；第二階段為反應(yīng)階段，攪拌轉(zhuǎn)速30 r/min，持續(xù)25 min。絮凝過(guò)程結(jié)束后，停止攪拌，收起攪拌槳，靜置沉淀15 min，沉淀結(jié)束后于距離上清液頂部2 cm 處取部分上清液，測(cè)量剩余濁度。

1.5 篩選方法

1.5.1 突變株初篩 選取經(jīng)絮凝試驗(yàn)后，處理水樣剩余濁度＜25 NTU的誘變菌。

1.5.2 突變株復(fù)篩 選取經(jīng)絮凝試驗(yàn)后，處理水樣剩余濁度＜20 NTU的誘變菌。

1.5.3 突變株終篩 將突變株與原始菌株進(jìn)行同步培養(yǎng)，觀察同期絮凝活性變化，選取絮凝活性高于原始菌株的突變株。

1.6 遺傳穩(wěn)定性分析

為了檢驗(yàn)突變株的遺傳穩(wěn)定性，對(duì)篩選到的高產(chǎn)突變株進(jìn)行傳代培養(yǎng)，測(cè)定不同傳代次數(shù)下突變株發(fā)酵液的表面張力。

2 結(jié)果

2.1 ARTP誘變致死率曲線

在常壓室溫等離子體誘變育種中，影響菌株誘變效率的主要因素有照射距離、氣流量、放電功率和照射時(shí)間。為保證等離子體溫度低于40℃，設(shè)定照射功率100 W、工作氣流量10 SLPM、照射距離2 mm，在此條件下，等離子體誘變強(qiáng)度取決于照射時(shí)間的長(zhǎng)短[12,17]。當(dāng)照射時(shí)間從30 s上升到300 s時(shí)，菌株致死率如圖1 所示?？梢钥闯?，等離子體與海洋地衣芽孢桿菌DHS-40致死率之間有明顯的劑量累積效應(yīng)，隨著照射時(shí)間的增加，菌體的致死率不斷升高。照射時(shí)間＞60 s，DHS-40 致死率＞60%；照射時(shí)間＞240 s，致死率近100%。因此，選擇60～240 s為菌株DHS-40的最佳誘變照射時(shí)間。

等離子體誘變?yōu)榉嵌ㄏ?，具隨機(jī)性。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[18]，選擇菌株致死率在90%以上時(shí)，菌株突變率較高，且平板上菌落分散性較好，便于單菌落挑選。因此，選取致死率在90%以上平板的單菌株進(jìn)行高產(chǎn)菌株的篩選。

2.2 絮凝劑高產(chǎn)菌株的篩選

共分離得到396 株誘變株，經(jīng)過(guò)初篩、復(fù)篩，共計(jì)篩選得到8 株絮凝活性較高的誘變菌。將DHS-40突變菌株與原始菌株同步培養(yǎng)，其生長(zhǎng)狀態(tài)與絮凝活性同步曲線見(jiàn)圖2、3。

由圖2 可見(jiàn)，所有突變株的生長(zhǎng)都比原始菌株要好，生長(zhǎng)速率較快，尤其是90-102 與120-24 菌株的生長(zhǎng)最為迅速，同期生長(zhǎng)速率達(dá)到原始菌株的1.5倍以上。

由圖3 可見(jiàn)，除90-102 與120-24 株外，其他突變株同期絮凝活性低于原始菌株，這2 株突變菌株的同期絮凝活性達(dá)到原始菌株的1.5倍以上。

2.3 突變株遺傳穩(wěn)定性分析

誘變菌株遺傳穩(wěn)定性對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)非常重要，由于突變菌株在傳代過(guò)程中可能會(huì)出現(xiàn)表型延遲現(xiàn)象，導(dǎo)致高產(chǎn)菌株傳代后出現(xiàn)生產(chǎn)性衰退[19]，因此必須對(duì)菌株傳代過(guò)程中遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行研究。為驗(yàn)證突變株遺傳穩(wěn)定性，對(duì)突變株進(jìn)行6 代連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)，并檢測(cè)每一代發(fā)酵液絮凝活性，結(jié)果如圖4 所示。可以看出，突變株有較好的遺傳穩(wěn)定性，連續(xù)傳代6 次，突變株處理后水樣的剩余濁度一直在30 NTU左右。

3 討論

圖1 海洋地衣芽孢桿菌DHS-40在不同照射時(shí)間下的致死率曲線

圖2 原始菌和突變株同步生長(zhǎng)曲線

微生物絮凝劑是具有絮凝活性的生物大分子物質(zhì)，與化學(xué)絮凝劑相比，具有無(wú)毒、能生物降解等優(yōu)點(diǎn)，未來(lái)在環(huán)保、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景。目前微生物絮凝劑的主要問(wèn)題是產(chǎn)量太低，導(dǎo)致生產(chǎn)成本過(guò)高，限制了其應(yīng)用推廣。選育高產(chǎn)微生物絮凝劑菌株，是提高微生物絮凝劑產(chǎn)量的方法之一，在發(fā)酵工業(yè)中，大部分都采用誘變菌株作為生產(chǎn)菌株。

本研究采用一種新的誘變育種方法，該方法產(chǎn)生的等離子體射流活性粒子種類豐富、放電均勻，與傳統(tǒng)的誘變技術(shù)相比，具有操作簡(jiǎn)單、安全性高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于微生物誘變育種中。楊穎[13]等對(duì)綠色糖單胞菌進(jìn)行快速誘變，篩選出木聚糖酶高產(chǎn)菌株酶活比原始菌株提高17 倍；夏書(shū)琴[14]等利用ARTP 誘變茂原鏈輪絲菌（Streptoverticillium mobaraense），谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶酶活達(dá)2.73 U/mL，比原始菌株提高82%。等離子體作用于微生物，導(dǎo)致其DNA 物質(zhì)的損傷，但部分微生物會(huì)通過(guò)自身的修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)存活，使微生物基因序列和代謝網(wǎng)絡(luò)發(fā)生顯著變化，導(dǎo)致微生物的突變[20-21]。本實(shí)驗(yàn)中，菌株經(jīng)過(guò)等離子體誘變后，最終篩選出2 株高產(chǎn)的突變株90-102 與120-24。這2 株突變株生長(zhǎng)速率提高了近1.5倍，同期絮凝活性也提高了近1.5倍。因此，ARTP育種能有效提高菌株微生物絮凝劑產(chǎn)量，篩選出微生物絮凝劑的高產(chǎn)誘變株。

圖3 原始菌和突變株同步絮凝曲線

圖4 突變株遺傳穩(wěn)定性

綜上，我們利用常壓室溫等離子體誘變海洋地衣芽孢桿菌DHS-40，通過(guò)搖瓶篩選微生物絮凝劑的高產(chǎn)菌株，獲得2 株高產(chǎn)的突變株90-102 與120-24，與原始菌株相比，生長(zhǎng)速率提高了近1.5倍，同期絮凝活性也提高了近1.5倍，且傳代試驗(yàn)證實(shí)該突變株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

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