袁國強，李鶴，王翠，韓衛(wèi)強，任麗梅

石藥集團中諾藥業(yè)（石家莊）有限公司 酶工程研究所，河北 石家莊 050041

辛伐他汀是目前國內(nèi)外最暢銷的降脂藥之一，可用于控制血液中膽固醇含量及預防心血管疾病，其藥理作用是作為競爭性抑制劑，抑制膽固醇合成的限速酶——3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶的活性，從而降低膽固醇的生物合成[1]。在傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝中，主要利用化學方法以洛伐他汀為原料合成得到辛伐他汀[2-4]，但近年來逐步轉向能耗低、毒性低的酶法生產(chǎn)。專利WO2005/040107[5]報告了使用酯酶作為酯化劑合成辛伐他汀，但是由于區(qū)域選擇性酯化的要求使得必須進行其他醇基的保護，導致總產(chǎn)量的降低。因此，找到能夠選擇性?；强闪炙岬奶匦钢苿?，對于有效合成辛伐他汀將起到至關重要的作用。

土曲霉的洛伐他汀生物合成基因簇編碼的一個相對分子質(zhì)量約46 000 的蛋白即洛伐他汀?；D移酶（lovastatinacy transferase，LovD），可將酰基硫酯的?；鶊F區(qū)域選擇性酰基化莫那可林酸C8羥基，為生物合成辛伐他汀提供有效的酶制劑[6]。后來將LovD基因構建到大腸桿菌中，其工程菌應用到從莫那可林酸到辛伐他汀的合成過程中[7]。后續(xù)高雪研究了以大腸桿菌為宿主的LovD 的86、12、190、275、26、161 等位點的定點突變，其突變體有效改進了LovD的活性、溫度穩(wěn)定性及可溶性[8]。

本實驗室從LovD的原始序列出發(fā)，根據(jù)三維構像推測影響酶活的關鍵性位點，進行定點突變，獲得比原始序列酶活高出數(shù)倍的突變大腸桿菌菌株，但大腸桿菌工程菌容易受環(huán)境影響。目前LovD 的研究主要在大腸桿菌里進行表達發(fā)酵，國內(nèi)外尚無將此基因在畢赤酵母中表達的研究報道。巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)作為一種真核表達系統(tǒng)，具有培養(yǎng)條件簡單、易于操作、適應性強、便于高密度發(fā)酵培養(yǎng)和工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點[9]。已有多種蛋白在巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)中得以高效表達[10-11]。我們從經(jīng)過多次突變優(yōu)化的LovD基因出發(fā)，將其分別構建到胞外表達載體pPIC9K 和胞內(nèi)表達載體pAO815 中，篩選出合適的表達載體，實現(xiàn)了基因在宿主菌中的功能性表達，獲得了高效表達的基因工程菌，并初步進行了5L自動發(fā)酵罐放大試驗，以期為LovD的大規(guī)模生產(chǎn)奠定技術基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

巴斯德畢赤酵母GS115，質(zhì)粒pPIC9K、pAO815購自Invitrogen 公司；含有突變的LovD基因的質(zhì)粒pET-21d-LovD為本實驗室構建并保存[12]。

酵母提取物和蛋白胨購自OXOID公司；其他化學試劑均購自上海國藥集團化學試劑有限公司；rTaqDNA 酶、Probest高保真聚合酶、dNTP 混合物、T4DNA 連接酶均購自TaKaRa 公司；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、NotⅠ、SalⅠ均購自NEB 公司；溶壁酶（lyticase）購自Sigma 公司；質(zhì)粒小提試劑盒和瓊脂糖回收試劑盒購自北京天根有限公司；引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；LB、YPD、BMGY、MD 等培養(yǎng)基配方參考《分子克隆實驗指南》（第3版）[13]。

ZS01-0057 電泳儀、Gene PulserⅡ電穿孔儀（Bio-RAD公司）；瓊脂糖電泳儀（北京六一儀器廠）；5L 攪拌式發(fā)酵罐（上海保興生物設備工程有限公司）；LT低溫連接儀（珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司）。

1.2 LovD基因的畢赤酵母重組質(zhì)粒構建

根據(jù)突變的LovD基因序列及畢赤酵母載體的多克隆位點分別設計2 組引物，即引物L1（5'-CCT GAATTCATGGGTTCTAACATTGACGCAG-3'，下 劃線堿基為EcoRⅠ識別位點）、L2（5'-CCTGCGGCCG CTTAGCCCTGTTGGTATTGTGCA-3'，下劃線堿基為NotⅠ識別位點）、L3（5'-CCTGAATTCATGGGTTCT AACATTGACGCAG-3'，下劃線堿基為EcoRⅠ識別位點）、L4（5'-CCTGAATTCTTAGCCCTGTTGGTAT TGTGCA-3'，下劃線堿基為EcoRⅠ識別位點），以pET-21d-LovD（本實驗構建保存）為模板，擴增LovD基因，用回收試劑盒回收該PCR產(chǎn)物片段，將回收的PCR 產(chǎn)物與表達質(zhì)粒pPIC9K 和pAO815 分別用NotⅠ/EcoRⅠ雙酶切和EcoRⅠ單酶切，用T4DNA 連接酶將表達載體與酶切產(chǎn)物連接，轉化感受態(tài)大腸桿菌TOP10，然后在含氨芐西林（50 μg/mL）的LB平板培養(yǎng)基上篩選陽性克隆，利用相應引物進行菌落PCR 及酶切重組質(zhì)粒驗證，將正確的菌株送上海英駿生物技術公司測序，測序結果正確，即得到重組表達載體pPIC9K-LovD和pAO815-LovD。

1.3 LovD的畢赤酵母轉化及鑒定

將畢赤酵母GS115單菌落挑入YPD培養(yǎng)基中活化后，按0.5%的接種量接入50 mL YPD 培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期，離心獲得的菌體用20 mL 無菌水洗2 次，再用20 mL 無菌1 mol/L 山梨醇洗1 次，加入1 mL山梨醇重懸菌體獲得GS115感受態(tài)細胞。

將大腸桿菌TOP10（pPIC9K-LovD）和TOP10（pAO815-LovD）置于LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，提取重組質(zhì)粒，用SalⅠ內(nèi)切酶線性化重組質(zhì)粒。

將線性化pPIC9K-LovD和pAO815-LovD的重組質(zhì)粒加入80 μL GS115 感受態(tài)細胞中冰浴5 min，1500 V 電擊5 ms 轉化，加入800 μL 山梨醇將細胞洗至EP 管中，28℃溫育2 h，離心，涂MD 平板培養(yǎng)至長出菌落后，劃線分離出單菌落。

將單菌落挑入無菌水中，加入適量溶壁酶，37℃溫育1 h消化細胞壁，取部分消化產(chǎn)物為模板、片段引物為鑒定引物進行PCR，檢測陽性克隆。

1.4 重組畢赤酵母菌的搖瓶誘導表達

分別挑選8株陽性重組菌接入2 mL YPD 液體培養(yǎng)基活化2 d，以1%的接種量轉接30 mL BMGY（pH8.0）液體培養(yǎng)基中，200 r/min、28℃過夜培養(yǎng)，每隔24 h補加1%甲醇進行誘導，共誘導72 h，收集菌液，用于酶活測定。

1.5 酵母表達的LovD粗酶液的制備

1.5.1 pPIC9k-LovD胞外表達重組菌粗酶液制備取2 mL 發(fā)酵菌液，12 000 r/min 離心10 min，收集上清用于酶活測定。

1.5.2 pAO815-LovD胞內(nèi)表達重組菌粗酶液的制備 取2 mL 發(fā)酵菌液，離心收集菌體，用1 mL 0.05 mol/L 磷酸鈉緩沖液（pH8.5）重懸，加入適量酸洗玻璃珠振蕩破碎20 min，離心上清作為粗酶液。

1.6 LovD酶活測定

反應體系參考文獻[5,8]并改進?？偡磻w積為5 mL，內(nèi)含4 mg/mL 莫那可林酸、0.008% DMB-SMMP 及2 mL 菌液所得上清，以pH8.5 的400 mmol/L 三乙醇胺緩沖溶液補足。在25℃、磁力攪拌條件下反應30 min，然后取100 μL，加入900 μL磷酸二氫鉀-乙腈溶液，進行高效液相色譜（HPLC）檢測。

色譜柱為菲羅門公司的C18 柱（4.6 mm×33 mm，3 μm），流動相為0.1%醋酸水溶液∶乙腈（40∶60），等度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測波長238 nm，柱溫25℃，進樣量10 μL。以辛伐他汀銨鹽（97.6%）為標準品，以單點校正方法計算反應后辛伐他汀的含量。酶活定義：在25℃、pH8.5 條件下，每分鐘催化生成1 μmol辛伐他汀所需酶量為1個單位（U）。

1.7 重組畢赤酵母菌的發(fā)酵罐放大實驗及酶功效實驗

以篩選到的高酶活胞外表達重組子為出發(fā)菌株，接種到150 mL YPD液體培養(yǎng)基中，28℃過夜培養(yǎng)，制成種子液，以5%的接種量接入3 L BMGY 液體培養(yǎng)基（5L發(fā)酵罐）中，發(fā)酵過程中流加28%氨水控制pH值，以甘油為碳源。菌體生長階段溫度設定為28℃，pH 設定為5.0，待培養(yǎng)18 h 后甘油耗盡（溶氧陡然上升）后繼續(xù)補加約50%的甘油。誘導產(chǎn)酶階段溫度設定為25℃，pH設定為7.0，當溶氧再一次上升時，流加甲醇至發(fā)酵液中進行誘導，在發(fā)酵過程中適時調(diào)節(jié)甲醇流速使溶氧保持在20%以上，發(fā)酵過程中每隔12 h取樣測定?；D移酶活性。

收集發(fā)酵罐菌體，12 000 r/min離心10 min，收集上清，用10k 膜超濾濃縮，將濃縮后的上清凍干，制成凍干粉，用于辛伐他汀酸合成實驗。

將莫那可林酸溶于pH8.5的400 mmol/L三乙醇胺緩沖溶液中，終濃度為60 mg/mL，待其完全溶解后加入凍干粉，使酶濃度達到7 mg/mL，攪拌10 min后加入一定量的活性炭，攪拌5 min，加入側鏈DMB-S-MMP，其終濃度為0.044%，反應總體積為100 mL 左右，HPLC 檢測辛伐他汀的生成。反應結束，計算莫那可林酸轉化率：（初始投入反應時莫那可林酸的含量-莫那可林酸的剩余含量）/初始投入反應時莫那可林酸的含量。

2 結果

2.1 LovD基因的PCR擴增

根據(jù)LovD基因序列及畢赤酵母載體的多克隆位點分別設計了2 組引物進行PCR 擴增，PCR 產(chǎn)物經(jīng)8 g/L 瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖1，擴增到1200 bp左右的條帶，其大小與預測結果一致。

2.2 重組表達質(zhì)粒pPIC9K-LovD 和pAO815-LovD的鑒定

將重組質(zhì)粒pPIC9K-LovD用限制性內(nèi)切酶NotⅠ/EcoRⅠ雙酶切，將pAO815-LovD用EcoRⅠ單酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，前者可見含1200 bp 左右的基因條帶和約9900 bp 的載體條帶（圖2A），后者可見含1200 bp 左右的基因條帶和約7700 bp 的載體條帶（圖2B），說明目的基因已成功插入載體。測序結果證明插入位點正確且無突變。

2.3 重組畢赤酵母菌的搖瓶表達及活性測定

分別挑選8 株陽性重組酵母菌，在BMGY 培養(yǎng)基中進行搖瓶發(fā)酵，誘導72 h后測定其合成的辛伐他汀的活性。結果顯示，胞外表達菌和胞內(nèi)表達菌各重組子之間的酶活力無明顯差異，將各重組子的酶活取平均值如圖3 所示，胞外重組酵母菌的酶活是胞內(nèi)重組酵母菌的近3 倍，其合成的辛伐他汀的酶活可達52 U/L，說明畢赤酵母的胞外表達系統(tǒng)更適合LovD。

圖1 LovD的PCR結果

圖2 pPIC9K-LovD（A）和pAO815-LovD（B）的酶切鑒定

圖3 胞外重組酵母菌GS115/pPIC9K-LovD和胞內(nèi)重組酵母菌GS115/pAO815-LovD的酶活

2.4 胞外表達重組酵母菌株發(fā)酵罐放大實驗

以篩選到的高酶活胞外表達重組子為出發(fā)菌株，接種到150 mL YPD液體培養(yǎng)基中，28℃過夜培養(yǎng)，制成種子液，然后以5%的接種量接入3 L 的BMGY（pH8.0）液體培養(yǎng)基（5L發(fā)酵罐）中，誘導96 h時，發(fā)酵液中酶活達到了最大值，為609.3 U/L，隨著誘導時間的延長，酶活力趨于穩(wěn)定（圖4），因此確定96 h為搖瓶發(fā)酵最佳誘導時間。

2.5 LovD的功效實驗

圖4 5L發(fā)酵罐中生產(chǎn)LovD的酶活力過程變化曲線

重組酵母菌株菌液經(jīng)收集、濃縮、制成凍干粉，用于辛伐他汀合成，經(jīng)過45 h反應后，結果如圖5所示。反應結束時，莫那可林酸的轉化率可達96%，酵母表達的LovD 可很好地催化莫那可林酸生成辛伐他汀，反應物中的雜質(zhì)較少。

3 討論

圖5 HPLC檢測LovD催化莫那可林酸合成辛伐他汀

國內(nèi)外學者已對LovD 的原核異源表達進行了一些研究[7]，其出發(fā)基因序列均為土曲霉來源的?；D移酶氨基酸序列。在此基礎上，進行了突變等研究。2007 年，Xie 等[14]通過構建的大腸桿菌BL21（DE3）/pAW31表達菌株，進行了全細胞催化莫納克林酸生成辛伐他汀的實驗探索，底物濃度為5 g/L時轉化率達99%，產(chǎn)品濃度可達98%。但其僅為小試實驗，并無后期放大化實驗結果。2010 年，華東理工大學的朱麗平在該研究基礎上，從多個方面對發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行優(yōu)化，提高大腸桿菌BL21菌株中的?；D移酶LovD 的表達，最終酶活僅為250 U/L，辛伐他汀合成轉化率為90%[15]。本研究中LovD基因來源于實驗室進化保存，區(qū)別于上述學者的突變位點。本研究中底物濃度為60 g/L 時，轉化率達到了96%以上，具備工業(yè)化應用指標。研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌內(nèi)存在可降解側鏈DMB-S-MMP 的未知酶，因此產(chǎn)物中含有側鏈的分解產(chǎn)物DMB-SMPA，不利于后續(xù)分離。本研究所構建的畢赤酵母胞外工程菌株，由于其自身蛋白分泌較少，雜蛋白較少，用于催化辛伐他汀合成實驗不會造成對側鏈的降解，因此產(chǎn)物的雜質(zhì)較少，利用后續(xù)純化，且產(chǎn)物收率高，可克服大腸桿菌發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中存在自身蛋白表達多、后處理較為復雜，特別是在氣候條件、溫度濕度等方面也較為敏感，易被噬菌體感染等問題。在后續(xù)的工業(yè)化生產(chǎn)中，煙臺只楚藥業(yè)已利用本公司開發(fā)的相關酶進行了辛伐他汀工業(yè)化生產(chǎn)驗證，其產(chǎn)品純度達到了99%以上[16]。因此，本研究所構建的畢赤酵母工程菌，為LovD的表達提供了一條新途徑，為生物法合成辛伐他汀工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎。

[1]Plosker G L,McTavish D.Simvastatin:a reappraisal of its pharmacology and therapeutic efficacy in hypercholeste-rolaemia[J].Drugs,1995,50:334-363.

[2]Askin D,Verhoeven T R,Liu M H,et al.Synthesis of synvinolin:extremely high conversion alkylation of an ester enolate[J].J Org Chem,1991,56(16):4929-4932.

[3]任素梅,徐杰,孫明昆.辛伐他汀的半合成[J].中國藥物化學雜志,2003,13(1):38-39.

[4]李偉,彭俊,郝二軍,等.辛伐他汀的合成工藝改進[J].中國新藥雜志,2007,16(3):225-226.

[5]Morgan B,Burr M,Levin M,et al.Methods for making sinvastatin and intermediates:WHO,WO2005/040107[P].2005-05-06.

[6]Kenndy J,Auclair K,Kendrew S G,et al.Mondulation of polyketides synthase activity by accessory proteins during lovation biosythesis[J].Science,1999,284:1368-1372.

[7]Tang Y,Xie X K.Methods and materials for making sinvastatin and related compounds:US,US2007/012362[P].2007-05-24.

[8]Gao X,Xie X K,Pashkov I,et al.Directed evolution and structural characterization of a Simvastatin synthase[J].Chem Biol,2009,16:1064-1074.

[9]Cregg J M,Cereghino J L,Shi J,et al.Recombinant protein expression in Pichia pastoris[J].Mol Biotechnol,2000,16(1):23-52.

[10]袁彩,林琳,施巧琴,等.擴展青霉堿性脂肪酶基因在畢赤酵母中的高效表達[J].生物工程學報,2003,19(2):231-235.

[11]Cos O,Resina D,Ferrer P,et al.Heterologous production of Rhizopus oryzae lipase in Pichia pastoris using the alcohol oxidase and formaldehyde dehydrogenase promoters in batch and fed-batch cultures[J].Biochem Eng J,2005,26(2-3):86-94.

[12]李鶴,余允東,?？?等.含有一個或幾個點突變的洛伐他汀酰基轉移酶:中國,CN104342416A[P].2013-07-26.

[13]薩姆布魯克,拉塞爾.分子克隆實驗指南[M].3版.北京:科學出版社,2002.

[14]Xie X K,Yi T.Efficient synthesis of simvastatin by use of whole-cell biocatalysis[J].Appl Environ Microbiol,2007,73(7):2054-2060.

[15]朱麗平,任宇紅,孫常磊,等.生物法合成辛伐他汀[J].生物加工過程，2011,9(5):11-16.

[16]葛祥斌,李賢坤,楊俊發(fā),等.酶法合成辛伐他汀的制備方法:中國,CN103725726[P].2014-04-16.