亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        人乳頭瘤病毒18型L1蛋白在昆蟲(chóng)桿狀病毒系統(tǒng)中的表達(dá)

        2015-11-29 08:32:02麻粉蓮張騫鄭麗舒
        生物技術(shù)通訊 2015年6期

        麻粉蓮,張騫,鄭麗舒

        中國(guó)疾病預(yù)防控制中心 病毒病預(yù)防控制所,北京 100052

        人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)是一種閉環(huán)雙鏈DNA 病毒,16 和18 型HPV 與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)。全球每年約27萬(wàn)人死于宮頸癌,其中80%死亡病例發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家[1]。阻斷HPV感染是預(yù)防宮頸癌的重要途徑之一。目前,上市的HPV16/18型二價(jià)HPV疫苗和HPV6/11/16/18型四價(jià)HPV疫苗均在9~26歲女性中用于預(yù)防宮頸癌,但價(jià)格較貴,且只能預(yù)防2 種高危型HPV 型別[2]。因此,研發(fā)抗原譜廣、價(jià)格便宜、使用方便的新型HPV 疫苗具有重要意義。由于HPV具有多樣性、體外培養(yǎng)困難和潛在的致癌性等特征,HPV 疫苗研發(fā)難以采用減毒活疫苗或死疫苗技術(shù),只能進(jìn)行基因工程疫苗研發(fā)。L1 蛋白是HPV 疫苗研究的主要靶抗原。昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)具有磷酸化、糖基化和蛋白切割加工修飾等功能,表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)特性與天然產(chǎn)物相似,安全性較高,制備過(guò)程簡(jiǎn)單,適用于蛋白質(zhì)工程研發(fā)[3]。我們利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)L1蛋白,為進(jìn)一步研究新型HPV疫苗奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9和載體pFastBac1購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司;大腸桿菌DH5α和DH10Bac 由本科室保存;L1基因根據(jù)NCBI 提供的HPV18 野生型L1基因序列(NC_001357.1)人工合成,全長(zhǎng)1629 bp。

        PCR儀、限制性內(nèi)切酶和轉(zhuǎn)染試劑CellFectin購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;DNA凝膠回收試劑盒和PCR產(chǎn)物回收試劑盒購(gòu)自TaKaRa 公司;蛋白質(zhì)和DNA marker 購(gòu)自北京博邁德科技發(fā)展有限公司;鼠抗L1單克隆抗體購(gòu)自Fitzgerald 公司;昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)基Sf900ⅡSFM和Grace不完全培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司;HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

        1.2 HPV18 L1序列的優(yōu)化及TA克隆

        為提高桿狀病毒系統(tǒng)目的蛋白表達(dá)量,本實(shí)驗(yàn)根據(jù)Sf9 細(xì)胞密碼子使用偏性,參考GenBank 中HPV18L1基因組序列,在不改變氨基酸序列的前提下,將L1基因編碼區(qū)序列進(jìn)行優(yōu)化,并在基因起始密碼子區(qū)域添加Kozak 序列,在5'和3'端分別添加EcoRⅠ和XbaⅠ限制性酶切位點(diǎn),送Invitrogen 公司合成。將L1序列連接至pMD18-T 載體,轉(zhuǎn)化宿主菌,挑克隆進(jìn)行PCR和測(cè)序,鑒定正確的重組克隆質(zhì)粒命名為pMD18T-L1。

        1.3 重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFB1-L1的構(gòu)建

        將重組克隆質(zhì)粒pMD18T-L1和pFastBac1分別用EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切,回收L1基因片段和pFastBac1 載體片段,經(jīng)T4DNA 連接酶于16℃連接2 h,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α,提取質(zhì)粒,經(jīng)EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切鑒定,送Invitrogen 公司測(cè)序。鑒定正確的重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體命名為pFB1-L1。

        1.4 重組桿狀病毒穿梭質(zhì)粒rBacmid-L1的構(gòu)建

        將轉(zhuǎn)移載體pFB1-L1 轉(zhuǎn)化含Bacimd 和Helper質(zhì)粒的大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)50 μg/mL卡那霉素、7 μg/mL慶大霉素、10 μg/mL四環(huán)素和藍(lán)白斑篩選,挑取白色菌落并對(duì)其反復(fù)稀釋篩選,挑取克隆,采用通用引物M13F(5'-CCCAGTCACGACGT TGTAAAACG-3')、M13R(5'-AGCGGATAACAATT TCACACAGG-3')進(jìn)行PCR 鑒定(反應(yīng)條件:93℃預(yù)變性3 min;95℃變性45 s,55℃退火45 s,72℃延伸5 min,共30個(gè)循環(huán);72℃再延伸7 min),將PCR產(chǎn)物送Invitrogen公司測(cè)序,鑒定正確的重組桿狀病毒穿梭質(zhì)粒命名為rBacmid-L1。

        1.5 重組桿狀病毒rBacmid-L1的包裝

        按照Bac-to-Bac 說(shuō)明書(shū),使用CellfectinⅡ轉(zhuǎn)染試劑將重組質(zhì)粒rBacmid-L1 轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sf9細(xì)胞,以僅含脂質(zhì)體的等量轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞作為陰性對(duì)照,顯微鏡下觀察致細(xì)胞病變。轉(zhuǎn)染7 d后收集上清,即為第一代重組桿狀病毒,命名為rBac-L1-P1。將rBac-L1-P1 按MOI=0.1,細(xì)胞數(shù)為1×106傳代,感染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sf9 細(xì)胞,4 d 后出現(xiàn)細(xì)胞病變時(shí)收集上清,即為rBac-L1-P2,按此方法獲得rBac-L1-P3。

        1.6 重組桿狀病毒的鑒定

        1.6.1 PCR 鑒定 用DNA 提取試劑盒提取感染rBacmid-L1 的Sf9 細(xì)胞的病毒基因組,以其為模板、M13F 和M13R 為引物,PCR 擴(kuò)增L1基因,反應(yīng)條件同1.4,1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

        1.6.2 間接免疫熒光法鑒定 將重組桿狀病毒rBacmid-L1 感染96 孔板中培養(yǎng)的Sf9 細(xì)胞,以僅含脂質(zhì)體的等量轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞作為陰性對(duì)照,3 d 后移去培養(yǎng)上清,加入80%丙酮室溫固定細(xì)胞10 min;棄丙酮,加入HPV18 L1 抗體,置37℃孵育1 h;加入FITC 標(biāo)記的羊抗小鼠IgG 抗體,置37℃孵育1 h;加入60%甘油溶液封板,熒光顯微鏡下觀察。

        1.6.3 Western 印跡鑒定 重組桿狀病毒rBacmid-L1感染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞3 d后,離心收集上清和細(xì)胞沉淀。將上清用超濾管進(jìn)行濃縮,細(xì)胞沉淀用PBS 重懸,分別取20 μL樣品,經(jīng)12% SDS-PAGE分離,電轉(zhuǎn)移至NC膜上,5%脫脂奶封閉過(guò)夜;加入小鼠抗L1單克隆抗體,37℃孵育1 h;加入HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 抗體,37℃孵育0.5 h,加入TMB 顯色5 min。

        2 結(jié)果

        2.1 HPV18 L1序列的優(yōu)化及TA克隆

        按照Sf9 細(xì)胞密碼子嗜性優(yōu)化L1基因序列,氨基酸序列未發(fā)生改變。將重組克隆質(zhì)粒pMD18TL1進(jìn)行PCR,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析,可見(jiàn)1629 bp的L1基因片段(圖1)。測(cè)序結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pMD18-T-L1的序列正確。

        2.2 轉(zhuǎn)移載體pFB1-L1的鑒定

        轉(zhuǎn)移載體pFB1-L1的雙酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析,可見(jiàn)5238 bp 的載體片段和1629 bp 的L1基因片段,大小與預(yù)期相符(圖2)。測(cè)序結(jié)果表明,所獲得的基因序列與L1基因的序列同源性為100%。

        2.3 重組桿狀病毒穿梭質(zhì)粒rBacmid-L1的鑒定

        圖1 重組克隆質(zhì)粒pMD18T-L1的PCR鑒定

        重組桿狀病毒穿梭質(zhì)粒rBacmid-L1 的PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析,可見(jiàn)約3829 bp(1629+2300 bp)的基因片段,與預(yù)期相符(圖3)。測(cè)序結(jié)果表明,所獲得的基因序列與L1基因序列的同源性為100%,表明L1基因已整合到Bacmid質(zhì)粒上。

        2.4 重組桿狀病毒的包裝

        穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Sf9 細(xì)胞3 d 后,在顯微鏡下觀察。與陰性對(duì)照細(xì)胞相比,細(xì)胞變圓、變亮,間距變大,細(xì)胞出現(xiàn)破碎、脫落;轉(zhuǎn)染7 d后細(xì)胞大片脫落,有明顯細(xì)胞病變(圖略)。

        2.5 重組桿狀病毒的鑒定

        2.5.1 PCR 鑒定 提取感染rBacmid-L1 的Sf9 細(xì)胞的病毒基因組,以其為模板行PCR 擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠分析,可見(jiàn)約3829 bp(1629+2300 bp)的片段,與預(yù)期相符(圖4)。測(cè)序結(jié)果顯示重組質(zhì)粒rBacmid-L1的序列正確,表明重組桿狀病毒基因組中整合了L1基因。

        圖2 EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切pFB1-L1

        圖3 重組穿梭質(zhì)粒rBacmid-L1的PCR鑒定

        圖4 重組桿狀病毒基因組中L1基因的PCR鑒定

        2.5.2 間接免疫熒光法鑒定 間接免疫熒光結(jié)果顯示,感染rBacmid-L1的Sf9細(xì)胞可見(jiàn)綠色熒光,而僅含脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染的Sf9 細(xì)胞(陰性對(duì)照)無(wú)熒光(圖5),表明重組桿狀病毒的L1基因在Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞中獲得表達(dá)。

        2.5.3 Western 印跡鑒定 Western 印跡結(jié)果顯示,rBacmid-L1感染的Sf9細(xì)胞的上清中無(wú)特異性條帶,而細(xì)胞沉淀可與鼠抗L1 單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng),在相對(duì)分子質(zhì)量約60 000 處可見(jiàn)特異性條帶,大小與L1蛋白相符,僅含脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染的Sf9 細(xì)胞無(wú)特異性條帶產(chǎn)生(圖6)。表明L1基因已在rBacmid-L1感染的Sf9細(xì)胞中得到表達(dá)。

        3 討論

        昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(baculovirus expression vector system,BEVS)是繼大腸桿菌、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)后建立的另一個(gè)高效表達(dá)系統(tǒng)。BEVS主要由轉(zhuǎn)移載體、桿狀病毒載體和昆蟲(chóng)細(xì)胞系三個(gè)部分組成。構(gòu)建重組桿狀病毒時(shí),先將外源基因克隆至轉(zhuǎn)移載體,構(gòu)建成重組轉(zhuǎn)移載體;然后重組轉(zhuǎn)移載體和桿狀病毒骨架共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞,將外源片段插入病毒基因組中;再通過(guò)特定的篩選標(biāo)記和方法獲得重組病毒,在昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)復(fù)制,外源基因得以表達(dá)[4]。本研究中,我們將L1基因克隆至pFastBac1質(zhì)粒中,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化攜帶桿狀病毒基因組的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH10Bac,篩選轉(zhuǎn)座后的陽(yáng)性重組桿狀病毒rBacmid-L1,轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞后獲得攜帶L1基因的重組桿狀病毒顆粒,經(jīng)擴(kuò)增后感染昆蟲(chóng)細(xì)胞,收獲L1蛋白。結(jié)果表明,HPV18 L1蛋白在昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中獲得成功表達(dá)。

        圖6 Western印跡檢測(cè)L1蛋白的表達(dá)

        HPV L1蛋白占病毒外殼主要組成的90%左右,是病毒誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性中和抗體的主要刺激物,體外表達(dá)的L1 蛋白具有組裝成病毒樣顆粒(VLP)的能力[5]。目前上市的HPV疫苗均以L1蛋白為靶抗原。HPV16/18 型二價(jià)HPV 疫苗的L1 VLP通過(guò)啤酒酵母細(xì)胞產(chǎn)生,酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白水平高,但其糖基化修飾具有局限性。HPV L1蛋白亦可在大腸桿菌中表達(dá),但其缺乏蛋白翻譯后的糖基化等修飾加工過(guò)程,多數(shù)形成包涵體。HPV6/11/16/18 型四價(jià)HPV 疫苗的L1 VLP 利用昆蟲(chóng)細(xì)胞產(chǎn)生,昆蟲(chóng)細(xì)胞不僅培養(yǎng)條件與大腸桿菌及酵母細(xì)胞接近,而且細(xì)胞易破碎,表達(dá)外源蛋白的水平較高,可以進(jìn)行蛋白翻譯后的加工修飾。酵母細(xì)胞表達(dá)的L1 VLP 大小不一,而昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)的Ll VLP 顆粒相對(duì)均一,活性較好[6-7]。不同于HPV 二價(jià)疫苗使用的粉紋夜蛾Hi-5 昆蟲(chóng)細(xì)胞,本研究采用Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞,密碼子優(yōu)化后的HPV18L1基因在Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了高水平表達(dá)。本研究中,我們以感染rBacmid-L1的Sf9細(xì)胞的病毒基因組為模板進(jìn)行PCR鑒定,證明獲得了重組桿狀病毒rBacmid-L1;將感染rBacmid-L1 的Sf9 細(xì)胞行免疫熒光檢測(cè),可見(jiàn)特異性綠色熒光;Western 印跡鑒定在60 000 處可見(jiàn)特異性條帶,并且僅在細(xì)胞沉淀中檢測(cè)到L1 蛋白。因此,利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng),我們成功表達(dá)了HPV18 L1 蛋白,對(duì)新型HPV 疫苗的研發(fā)具有現(xiàn)實(shí)意義。

        [1]Rautava J,Syrj?nen S.Human papillomavirus infections in the oral mucosa[J].Am Dent Asmc,2011,142(8):905-914.

        [2]Hildesheim A,Hcrrero R,Wacholder S,et al.Effect of human papillomavirus 16/18 L1 virus like particle vaccine among young women with preexisting infection:a randomized trial[J].JAMA,2007,298(7):743-753.

        [3]李衛(wèi)國(guó),王厚偉,牟志美,等.昆蟲(chóng)重組桿狀病毒獲得技術(shù)研究展望[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2003,34(1):134-138.

        [4]于永利.昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)與疫苗研制的30 年回顧[J].微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展,2015,43(4):1-15.

        [5]Janine T B.Developing an HPV vaccine to prevent cervical cancer and genital warts[J].Vaccine,2007,25(16):3001-3006.

        [6]Parkin D M,Bray F.Chapter 2:the burden of HPV-related cancers[J].Vaccine,2006,24(S3):S11-S25.

        [7]WHO/ICO Information Centre on HPV and Cervical Cancer.HPV and cervical cancer in the 2007 report[J].Vaccine,2007,25(S3):Cl-C230.

        日本老熟妇毛茸茸| 免费国产一区二区视频| 久久综合九色欧美综合狠狠 | 国产一精品一av一免费| 亚洲一区二区三区日本久久九| 中国女人a毛片免费全部播放 | 成年人观看视频在线播放| 国产成+人欧美+综合在线观看 | 亚洲人午夜射精精品日韩| 男人天堂免费视频| 一区二区亚洲精美视频| 亚洲免费观看视频| 先锋影音av最新资源| 亚洲国产成人久久综合一区77 | 国产亚洲av看码精品永久| а√资源新版在线天堂| 国产一级毛片卡| 久久亚洲精品中文字幕蜜潮| 国产欧美日韩一区二区加勒比| 在线观看午夜亚洲一区| 久久99久久99精品免观看不卡| 日本av不卡一区二区三区| 国产精品毛片无遮挡| 国产免费破外女真实出血视频| 亚洲中文字幕有综合久久| 新中文字幕一区二区三区| 天堂aⅴ无码一区二区三区| 一本大道久久东京热无码av| 免费av一区男人的天堂| 99久久99久久久精品齐齐| av网站免费线看| 九色精品国产亚洲av麻豆一| 蜜桃视频在线免费观看| 少妇高清精品毛片在线视频| 啪啪网站免费观看| 在线观看一区二区中文字幕| 风流老熟女一区二区三区| 国产精品偷伦免费观看的| 精品久久中文字幕一区 | 国产91在线精品福利| 日本不卡一区二区三区久久精品|