麻粉蓮，張騫，鄭麗舒

中國(guó)疾病預(yù)防控制中心 病毒病預(yù)防控制所，北京 100052

人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是一種閉環(huán)雙鏈DNA 病毒，16 和18 型HPV 與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)。全球每年約27萬(wàn)人死于宮頸癌，其中80%死亡病例發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家[1]。阻斷HPV感染是預(yù)防宮頸癌的重要途徑之一。目前，上市的HPV16/18型二價(jià)HPV疫苗和HPV6/11/16/18型四價(jià)HPV疫苗均在9～26歲女性中用于預(yù)防宮頸癌，但價(jià)格較貴，且只能預(yù)防2 種高危型HPV 型別[2]。因此，研發(fā)抗原譜廣、價(jià)格便宜、使用方便的新型HPV 疫苗具有重要意義。由于HPV具有多樣性、體外培養(yǎng)困難和潛在的致癌性等特征，HPV 疫苗研發(fā)難以采用減毒活疫苗或死疫苗技術(shù)，只能進(jìn)行基因工程疫苗研發(fā)。L1 蛋白是HPV 疫苗研究的主要靶抗原。昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)具有磷酸化、糖基化和蛋白切割加工修飾等功能，表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)特性與天然產(chǎn)物相似，安全性較高，制備過(guò)程簡(jiǎn)單，適用于蛋白質(zhì)工程研發(fā)[3]。我們利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)L1蛋白，為進(jìn)一步研究新型HPV疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9和載體pFastBac1購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；大腸桿菌DH5α和DH10Bac 由本科室保存；L1基因根據(jù)NCBI 提供的HPV18 野生型L1基因序列（NC_001357.1）人工合成，全長(zhǎng)1629 bp。

PCR儀、限制性內(nèi)切酶和轉(zhuǎn)染試劑CellFectin購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；DNA凝膠回收試劑盒和PCR產(chǎn)物回收試劑盒購(gòu)自TaKaRa 公司；蛋白質(zhì)和DNA marker 購(gòu)自北京博邁德科技發(fā)展有限公司；鼠抗L1單克隆抗體購(gòu)自Fitzgerald 公司；昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)基Sf900ⅡSFM和Grace不完全培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 HPV18 L1序列的優(yōu)化及TA克隆

為提高桿狀病毒系統(tǒng)目的蛋白表達(dá)量，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)Sf9 細(xì)胞密碼子使用偏性，參考GenBank 中HPV18L1基因組序列，在不改變氨基酸序列的前提下，將L1基因編碼區(qū)序列進(jìn)行優(yōu)化，并在基因起始密碼子區(qū)域添加Kozak 序列，在5'和3'端分別添加EcoRⅠ和XbaⅠ限制性酶切位點(diǎn)，送Invitrogen 公司合成。將L1序列連接至pMD18-T 載體，轉(zhuǎn)化宿主菌，挑克隆進(jìn)行PCR和測(cè)序，鑒定正確的重組克隆質(zhì)粒命名為pMD18T-L1。

1.3 重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFB1-L1的構(gòu)建

將重組克隆質(zhì)粒pMD18T-L1和pFastBac1分別用EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切，回收L1基因片段和pFastBac1 載體片段，經(jīng)T4DNA 連接酶于16℃連接2 h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒，經(jīng)EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切鑒定，送Invitrogen 公司測(cè)序。鑒定正確的重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體命名為pFB1-L1。

1.4 重組桿狀病毒穿梭質(zhì)粒rBacmid-L1的構(gòu)建

將轉(zhuǎn)移載體pFB1-L1 轉(zhuǎn)化含Bacimd 和Helper質(zhì)粒的大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)50 μg/mL卡那霉素、7 μg/mL慶大霉素、10 μg/mL四環(huán)素和藍(lán)白斑篩選，挑取白色菌落并對(duì)其反復(fù)稀釋篩選，挑取克隆，采用通用引物M13F（5'-CCCAGTCACGACGT TGTAAAACG-3'）、M13R（5'-AGCGGATAACAATT TCACACAGG-3'）進(jìn)行PCR 鑒定（反應(yīng)條件：93℃預(yù)變性3 min；95℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸5 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸7 min），將PCR產(chǎn)物送Invitrogen公司測(cè)序，鑒定正確的重組桿狀病毒穿梭質(zhì)粒命名為rBacmid-L1。

1.5 重組桿狀病毒rBacmid-L1的包裝

按照Bac-to-Bac 說(shuō)明書(shū)，使用CellfectinⅡ轉(zhuǎn)染試劑將重組質(zhì)粒rBacmid-L1 轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sf9細(xì)胞，以僅含脂質(zhì)體的等量轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞作為陰性對(duì)照，顯微鏡下觀察致細(xì)胞病變。轉(zhuǎn)染7 d后收集上清，即為第一代重組桿狀病毒，命名為rBac-L1-P1。將rBac-L1-P1 按MOI=0.1，細(xì)胞數(shù)為1×106傳代，感染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sf9 細(xì)胞，4 d 后出現(xiàn)細(xì)胞病變時(shí)收集上清，即為rBac-L1-P2，按此方法獲得rBac-L1-P3。

1.6 重組桿狀病毒的鑒定

1.6.1 PCR 鑒定 用DNA 提取試劑盒提取感染rBacmid-L1 的Sf9 細(xì)胞的病毒基因組，以其為模板、M13F 和M13R 為引物，PCR 擴(kuò)增L1基因，反應(yīng)條件同1.4，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.6.2 間接免疫熒光法鑒定 將重組桿狀病毒rBacmid-L1 感染96 孔板中培養(yǎng)的Sf9 細(xì)胞，以僅含脂質(zhì)體的等量轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞作為陰性對(duì)照，3 d 后移去培養(yǎng)上清，加入80%丙酮室溫固定細(xì)胞10 min；棄丙酮，加入HPV18 L1 抗體，置37℃孵育1 h；加入FITC 標(biāo)記的羊抗小鼠IgG 抗體，置37℃孵育1 h；加入60%甘油溶液封板，熒光顯微鏡下觀察。

1.6.3 Western 印跡鑒定 重組桿狀病毒rBacmid-L1感染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞3 d后，離心收集上清和細(xì)胞沉淀。將上清用超濾管進(jìn)行濃縮，細(xì)胞沉淀用PBS 重懸，分別取20 μL樣品，經(jīng)12% SDS-PAGE分離，電轉(zhuǎn)移至NC膜上，5%脫脂奶封閉過(guò)夜；加入小鼠抗L1單克隆抗體，37℃孵育1 h；加入HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 抗體，37℃孵育0.5 h，加入TMB 顯色5 min。

2 結(jié)果

2.1 HPV18 L1序列的優(yōu)化及TA克隆

按照Sf9 細(xì)胞密碼子嗜性優(yōu)化L1基因序列，氨基酸序列未發(fā)生改變。將重組克隆質(zhì)粒pMD18TL1進(jìn)行PCR，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，可見(jiàn)1629 bp的L1基因片段（圖1）。測(cè)序結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pMD18-T-L1的序列正確。

2.2 轉(zhuǎn)移載體pFB1-L1的鑒定

轉(zhuǎn)移載體pFB1-L1的雙酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，可見(jiàn)5238 bp 的載體片段和1629 bp 的L1基因片段，大小與預(yù)期相符（圖2）。測(cè)序結(jié)果表明，所獲得的基因序列與L1基因的序列同源性為100%。

2.3 重組桿狀病毒穿梭質(zhì)粒rBacmid-L1的鑒定

圖1 重組克隆質(zhì)粒pMD18T-L1的PCR鑒定

重組桿狀病毒穿梭質(zhì)粒rBacmid-L1 的PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，可見(jiàn)約3829 bp（1629+2300 bp）的基因片段，與預(yù)期相符（圖3）。測(cè)序結(jié)果表明，所獲得的基因序列與L1基因序列的同源性為100%，表明L1基因已整合到Bacmid質(zhì)粒上。

2.4 重組桿狀病毒的包裝

穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Sf9 細(xì)胞3 d 后，在顯微鏡下觀察。與陰性對(duì)照細(xì)胞相比，細(xì)胞變圓、變亮，間距變大，細(xì)胞出現(xiàn)破碎、脫落；轉(zhuǎn)染7 d后細(xì)胞大片脫落，有明顯細(xì)胞病變（圖略）。

2.5 重組桿狀病毒的鑒定

2.5.1 PCR 鑒定 提取感染rBacmid-L1 的Sf9 細(xì)胞的病毒基因組，以其為模板行PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠分析，可見(jiàn)約3829 bp（1629+2300 bp）的片段，與預(yù)期相符（圖4）。測(cè)序結(jié)果顯示重組質(zhì)粒rBacmid-L1的序列正確，表明重組桿狀病毒基因組中整合了L1基因。

圖2 EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切pFB1-L1

圖3 重組穿梭質(zhì)粒rBacmid-L1的PCR鑒定

圖4 重組桿狀病毒基因組中L1基因的PCR鑒定

2.5.2 間接免疫熒光法鑒定 間接免疫熒光結(jié)果顯示，感染rBacmid-L1的Sf9細(xì)胞可見(jiàn)綠色熒光，而僅含脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染的Sf9 細(xì)胞（陰性對(duì)照）無(wú)熒光（圖5），表明重組桿狀病毒的L1基因在Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞中獲得表達(dá)。

2.5.3 Western 印跡鑒定 Western 印跡結(jié)果顯示，rBacmid-L1感染的Sf9細(xì)胞的上清中無(wú)特異性條帶，而細(xì)胞沉淀可與鼠抗L1 單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，在相對(duì)分子質(zhì)量約60 000 處可見(jiàn)特異性條帶，大小與L1蛋白相符，僅含脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染的Sf9 細(xì)胞無(wú)特異性條帶產(chǎn)生（圖6）。表明L1基因已在rBacmid-L1感染的Sf9細(xì)胞中得到表達(dá)。

3 討論

昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)（baculovirus expression vector system，BEVS）是繼大腸桿菌、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)后建立的另一個(gè)高效表達(dá)系統(tǒng)。BEVS主要由轉(zhuǎn)移載體、桿狀病毒載體和昆蟲(chóng)細(xì)胞系三個(gè)部分組成。構(gòu)建重組桿狀病毒時(shí)，先將外源基因克隆至轉(zhuǎn)移載體，構(gòu)建成重組轉(zhuǎn)移載體；然后重組轉(zhuǎn)移載體和桿狀病毒骨架共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，將外源片段插入病毒基因組中；再通過(guò)特定的篩選標(biāo)記和方法獲得重組病毒，在昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，外源基因得以表達(dá)[4]。本研究中，我們將L1基因克隆至pFastBac1質(zhì)粒中，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化攜帶桿狀病毒基因組的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH10Bac，篩選轉(zhuǎn)座后的陽(yáng)性重組桿狀病毒rBacmid-L1，轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞后獲得攜帶L1基因的重組桿狀病毒顆粒，經(jīng)擴(kuò)增后感染昆蟲(chóng)細(xì)胞，收獲L1蛋白。結(jié)果表明，HPV18 L1蛋白在昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中獲得成功表達(dá)。

圖6 Western印跡檢測(cè)L1蛋白的表達(dá)

HPV L1蛋白占病毒外殼主要組成的90%左右，是病毒誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性中和抗體的主要刺激物，體外表達(dá)的L1 蛋白具有組裝成病毒樣顆粒（VLP）的能力[5]。目前上市的HPV疫苗均以L1蛋白為靶抗原。HPV16/18 型二價(jià)HPV 疫苗的L1 VLP通過(guò)啤酒酵母細(xì)胞產(chǎn)生，酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白水平高，但其糖基化修飾具有局限性。HPV L1蛋白亦可在大腸桿菌中表達(dá)，但其缺乏蛋白翻譯后的糖基化等修飾加工過(guò)程，多數(shù)形成包涵體。HPV6/11/16/18 型四價(jià)HPV 疫苗的L1 VLP 利用昆蟲(chóng)細(xì)胞產(chǎn)生，昆蟲(chóng)細(xì)胞不僅培養(yǎng)條件與大腸桿菌及酵母細(xì)胞接近，而且細(xì)胞易破碎，表達(dá)外源蛋白的水平較高，可以進(jìn)行蛋白翻譯后的加工修飾。酵母細(xì)胞表達(dá)的L1 VLP 大小不一，而昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)的Ll VLP 顆粒相對(duì)均一，活性較好[6-7]。不同于HPV 二價(jià)疫苗使用的粉紋夜蛾Hi-5 昆蟲(chóng)細(xì)胞，本研究采用Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞，密碼子優(yōu)化后的HPV18L1基因在Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了高水平表達(dá)。本研究中，我們以感染rBacmid-L1的Sf9細(xì)胞的病毒基因組為模板進(jìn)行PCR鑒定，證明獲得了重組桿狀病毒rBacmid-L1；將感染rBacmid-L1 的Sf9 細(xì)胞行免疫熒光檢測(cè)，可見(jiàn)特異性綠色熒光；Western 印跡鑒定在60 000 處可見(jiàn)特異性條帶，并且僅在細(xì)胞沉淀中檢測(cè)到L1 蛋白。因此，利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，我們成功表達(dá)了HPV18 L1 蛋白，對(duì)新型HPV 疫苗的研發(fā)具有現(xiàn)實(shí)意義。

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