楊舒 ,張靜,王思涵,范增,王靜雪,韓毅,田宇,何麗娟,陳琳,岳文,李艷華,裴雪濤
1.廣西醫(yī)科大學,廣西 南寧 530021;2.軍事醫(yī)學科學院 野戰(zhàn)輸血研究所干細胞與再生醫(yī)學研究室,北京 100850;3.軍事醫(yī)學科學院 華南干細胞與再生醫(yī)學研究中心,廣東 廣州 510005
造血干/祖細胞(hematopoietic stem and progenitor cells,HSPCs)是一群具有長期自我更新及定向分化成各系血細胞能力的細胞[1]。臨床上,常采用造血干/祖細胞移植重建骨髓損傷患者的造血系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)[2]。長期以來,造血干/祖細胞移植被用于治療多種疾病,例如白血病等惡性血液病、重型再生障礙性貧血、自身免疫性疾病、急性放射病等[3]。
移植的造血干/祖細胞能否成功重建受者的造血及免疫系統(tǒng)取決于多方面的因素,如移植的造血干/祖細胞的數(shù)量、造血干/祖細胞的歸巢效率、免疫排斥反應等[3-4]。目前,臨床上主要采集外周血中的造血干/祖細胞作為移植細胞來源。在正常情況下,外周血中的造血干/祖細胞數(shù)量有限,為獲得足夠數(shù)量的造血干細胞,需要使用動員劑如粒細胞集落刺激因子(G-CSF)將骨髓中的造血干/祖細胞動員至外周血循環(huán)中[5]。我們新發(fā)現(xiàn)的小分子化合物Me6TREN(以下簡稱Me6)也具有將骨髓造血干/祖細胞動員至外周血的能力,有望成為一類新型的造血干/祖細胞動員劑候選藥物[6]。近年來,臍帶血造血干細胞移植在臨床上的應用逐年增多[7-8]。但臍帶血中的造血干/祖細胞數(shù)量較少,一份臍帶血不能滿足成年病人的治療細胞量,因此需要對其進行擴增來獲得足夠數(shù)量的造血干/祖細胞[9],目前已有研究團隊開展體外擴增的造血干/祖細胞移植病人的臨床試驗[10]。優(yōu)化造血干細胞擴增的培養(yǎng)體系,有助于進一步推動臍帶血來源的造血干/祖細胞的臨床應用。
Me6 是一類飽和胺類化合物,屬于一類新型醫(yī)藥中間體,可用于制備遠螯聚合物的原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)配體。我們在前期工作中發(fā)現(xiàn),單次皮下注射Me6 能將小鼠骨髓中的造血干/祖細胞快速有效地動員至外周血中[6]。傳統(tǒng)的造血干/祖細胞動員劑G-CSF在動員造血干/祖細胞的同時,能促進造血干/祖細胞的擴增[11],而化合物Me6 是否也能夠促進造血干/祖細胞的擴增尚不明了。為此,我們檢測了皮下注射Me6 的小鼠骨髓內(nèi)造血干/祖細胞數(shù)量及比例的變化,并利用體外培養(yǎng)體系進一步考察了該化合物是否影響造血干/祖細胞的增殖。
雄性C57BL/6 小鼠,體重18~20 g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,生產(chǎn)許可證:SCXK-(京)2012-0001;飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學科學院SPF級實驗動物房。將雄性C57BL/6小鼠隨機分為對照組(Con組)和Me6組。檢測前12 h,對Me6組C57BL/6小鼠皮下注射Me6,劑量為5 mg/kg;對照組注射PBS。
Me6TREN 購自Sigma 公司;紅細胞裂解液購自BD公司;小鼠淋巴細胞分離液購自灝洋生物制品科技有限責任公司;流式抗體Lineage APC-Cy7(CD3,CD11b,Ter-119,B220,Ly-6G)、Sca-1 PE-Cy7、c-Kit Alexa Fluor 700 均購自eBioscience 公司;α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司;干細胞生長因子(SCF)、重組人血小板生成素(TPO)、白細胞介素3(IL-3)、白細胞介素6(IL-6)均購自Peprotech公司;半固體集落培養(yǎng)基M3434購自StemCell公司。
用頸椎脫臼法處死小鼠后,置于75%酒精中消毒,在無菌環(huán)境下分離小鼠股骨,用1 mL 注射器吸取培養(yǎng)液,將骨髓細胞沖出至離心管中,2000 r/min離心5 min,得到細胞沉淀,用5 mL PBS重懸細胞,加到等體積的淋巴細胞分離液上層,2000 r/min 離心20 min(離心機調(diào)至慢升慢降),收集中間層細胞,用PBS洗滌2次,得到單個核細胞。將細胞種于含有500 μL 培養(yǎng)基(α-MEM 培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清,SCF 50 ng/mL,TPO 10 ng/mL,IL-3 10 ng/mL,IL-6 10 ng/mL)的24 孔低吸附板,放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
將小鼠半固體集落培養(yǎng)基(M3434)加入24孔低吸附板中,避免產(chǎn)生氣泡,然后將細胞以5×103/孔的密度接種到24孔板,放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);7 d后,在顯微鏡下對形成的造血集落形成單位(colony-forming unit,CFU)進行計數(shù);14 d 后,對高增殖潛能集落形成單位(high-proliferative-potential CFU,HPP-CFU)進行計數(shù)。
將分離得到的小鼠骨髓細胞用紅細胞裂解液處理后,取2×106細胞,用100 μL PBS 重懸至1.5 mL EP管中,加入抗體(Lineage、Sca-1、c-Kit),充分混勻后置于旋轉(zhuǎn)混合器上,4℃避光孵育30 min,然后用PBS 洗滌細胞2 次,800 r/min 離心5 min,用300 μL PBS重懸細胞,轉(zhuǎn)移至流式管中,用BD流式細胞儀檢測。
C57BL/6 小鼠皮下注射Me6,劑量為5 mg/kg,12 h后分離小鼠骨髓單個核細胞,進行集落形成能力的檢測。7 d后,對2組骨髓細胞的造血CFU進行計數(shù)比較,由結(jié)果(圖1A)看出,與Con 組小鼠(87.67±4.096)相比,Me6 組小鼠(108.0±2.646)骨髓單個核細胞所形成的集落數(shù)顯著增加(P=0.014);14 d后,對HPP-CFU進行計數(shù)比較,由結(jié)果(圖1B)看出,Me6組(18.75±1.109)小鼠HPP-CFU的數(shù)量較Con 組(14.33±0.667)也明顯增加(P=0.0269)。這組結(jié)果表明Me6 能增加小鼠骨髓中造血祖細胞的數(shù)量。
圖1 Me6能增加小鼠骨髓中造血祖細胞的數(shù)量
將分離得到的Con組和Me6組小鼠骨髓單個核細胞進行流式細胞術分析,考察造血干/祖細胞的表面標志lin-Sca-1+c-Kit+(LSK)的表達情況。檢測結(jié)果(圖2)顯示,與Con組(0.1412±0.01535)小鼠相比,Me6 組(0.2451±0.04030)小鼠骨髓中造血干/祖細胞的比例顯著增加(P=0.0337)。
體外分離小鼠骨髓單個核細胞,在培養(yǎng)體系中添加小分子化合物Me6,培養(yǎng)4 d 后,對Con 組和Me6組細胞總數(shù)進行比較。結(jié)果(圖3)顯示,2組細胞的細胞總數(shù)沒有顯著差別(P=0.3769)。
圖2 Me6能增加小鼠骨髓中造血干/祖細胞的比例
圖3 培養(yǎng)4 d的骨髓單個核細胞的數(shù)量
將在體外分離培養(yǎng)的小鼠骨髓單個核細胞分為Con組和Me6培養(yǎng)組,取培養(yǎng)4 d的細胞進行集落形成能力的檢測。7 d后,對Con和Me6兩組細胞的造血CFU 進行計數(shù)比較,由結(jié)果(圖4A)看出,與Con組(81.75±3.568)相比,Me6 組(120.8±5.023)所形成的集落數(shù)增加(P=0.0007);14 d 后,對HPP-CFU 進行計數(shù)比較,由結(jié)果(圖4B)看出,Me6 組(19.67±1.202)HPP-CFU的數(shù)量較Con組(14.25±1.436)也明顯增加(P=0.0406)。這組結(jié)果表明化合物Me6能增加體外培養(yǎng)的骨髓單個核細胞中造血祖細胞的數(shù)量。
將在體外分離培養(yǎng)的小鼠骨髓單個核細胞分為Con 組和Me6 組,進行流式細胞術分析造血干/祖細胞(lin-Sca-1+c-Kit+)的增殖情況。檢測結(jié)果(圖5)顯示,與Con 組(0.009625±0.001216)相比,Me6 組(0.01515±0.0007304)造血干/祖細胞中Ki-67的比例增加(P=0.0176)。這說明化合物Me6能促進體外培養(yǎng)的骨髓單個核細胞中造血干/祖細胞的增殖。
造血干/祖細胞是研究最為深入的成體干細胞,它具有自我更新以及分化成各系成熟血細胞的能力。在成體內(nèi),造血干/祖細胞主要定居于骨髓中。骨髓中的造血干/祖細胞不斷地增殖分化形成各種血細胞,并和各種血細胞不斷地在骨髓和外周血之間循環(huán)[1-2]。如今,造血干/祖細胞移植可以用來治療多種血液疾病,但由于獲得的造血干/祖細胞數(shù)量有限(如臍帶血中的造血干/祖細胞數(shù)量較少),直接影響了移植的效率,因此需要對造血干/祖細胞進行擴增[4]。當前用于造血干/祖細胞擴增的方法很多,包括細胞因子、高通量篩選得到的小分子化合物、基質(zhì)細胞等[7,12]。體外擴增使細胞脫離了體內(nèi)的微環(huán)境,可能會增加細胞的凋亡;此外,擴增可以使細胞數(shù)量增多,但有可能增加的是成熟細胞而不是干細胞,擴增后造血干/祖細胞的長期植入能力可能并未得到提高[13]。因此,對造血干/祖細胞的擴增,需要的不僅僅是表型,還有功能性的提高,使其移植后能快速有效地重建患者的造血和免疫系統(tǒng)。
圖4 培養(yǎng)4 d的骨髓單個核細胞中造血祖細胞的數(shù)量
圖5 培養(yǎng)4 d的骨髓單個核細胞中造血干/祖細胞的Ki-67+比例
我們的前期研究表明Me6 具有很好的動員作用,能將骨髓中造血干/祖細胞動員至外周血中,增加外周血中造血干/祖細胞的比例及數(shù)量[6]。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)Me6還能促進小鼠骨髓造血干/祖細胞的增殖。對實驗小鼠皮下注射Me6,12 h 后檢測小鼠的骨髓,可發(fā)現(xiàn)骨髓細胞的集落形成能力增強,并且造血干/祖細胞的比例及數(shù)量也有所增加。這些結(jié)果提示該化合物在動員造血干/祖細胞的同時,可能促進了骨髓造血干/祖細胞的擴增。我們的芯片檢測結(jié)果也提示化合物可能調(diào)節(jié)了Notch 信號通路,文獻報道該通路具有促進造血干/祖細胞擴增的能力[14-16]。為進一步確定化合物Me6 是否具有體外促進造血干/祖細胞擴增的能力,我們在體外分離培養(yǎng)了小鼠骨髓單個核細胞,向培養(yǎng)體系中加入化合物Me6,培養(yǎng)4 d后Me6組細胞的集落形成能力及增殖的造血干/祖細胞的比例都增加了,這些結(jié)果提示Me6 具有體外促進造血干/祖細胞擴增的能力。對于小分子化合物Me6 是否能促進造血干/祖細胞的長期擴增及其可能的機制仍須進行深入的研究。
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