孫琰，劉超，毛赟赟，王璽

1.天津醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，天津 300070；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100071

成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）是細(xì)菌的一種獲得性免疫系統(tǒng)，用以保護(hù)細(xì)菌和古細(xì)菌不受病毒侵害。細(xì)菌被病毒侵染后，CRISPR關(guān)聯(lián)蛋白（CRISPR-associated proteins，Cas）位點會編碼多個核酸酶和解旋酶，形成Cas 蛋白復(fù)合物，對入侵的病毒DNA 進(jìn)行切割，產(chǎn)生的新片段會整合到CRISPR重復(fù)序列中，從而對該病毒產(chǎn)生特異性免疫記憶[1-2]。當(dāng)細(xì)菌再次遭到該病毒入侵時，便會轉(zhuǎn)錄出與入侵病毒DNA 序列相匹配的小分子RNA，Cas 蛋白復(fù)合物利用這些RNA 去切割外源病毒DNA，導(dǎo)致病毒不能在細(xì)菌內(nèi)進(jìn)行復(fù)制。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)是基于細(xì)菌和古細(xì)菌的這種免疫防御機制而改造的一種基因組編輯技術(shù)[3]，利用人工設(shè)計的單向?qū)NA（single-guide RNA，sgRNA）介導(dǎo)外源Cas9 蛋白與靶基因結(jié)合，切割帶有5'-NGG 的間隔相鄰基序（protospacer adjacent motifs，PAM），從而實現(xiàn)對靶基因DNA的特異性切割[4]。

表觀遺傳在癌癥發(fā)生發(fā)展中有重要作用，染色質(zhì)重塑是表觀遺傳的重要機制之一，染色質(zhì)重塑復(fù)合物通過水解ATP 產(chǎn)生的能量來改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而調(diào)節(jié)基因表達(dá)。染色質(zhì)重塑復(fù)合物是較大的多亞基復(fù)合物，已知有SWI/SNF、ISWI、CHD 和IN080四大類。其中SWI/SNF是目前研究最多的，SNF5是SWI/SNF 染色質(zhì)重塑復(fù)合物的核心組分之一，高度保守。研究發(fā)現(xiàn)SNF5是一個強抑癌基因，在許多惡性腫瘤中突變或缺失，如橫紋肌樣瘤、神經(jīng)鞘瘤、淋巴瘤、乳腺癌、上皮樣肉瘤及其他軟組織的惡性腫瘤等[5-12]。目前有關(guān)SNF5的抗腫瘤機制研究不多。我們設(shè)計了針對SNF5基因的sgRNA，構(gòu)建了SNF5基因的CRISPR/Cas9n 表達(dá)載體，旨在通過敲除SNF5基因為深入研究SNF5的抗腫瘤機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人胚腎293T 細(xì)胞、大腸桿菌DH5α、pX461 和pX462 質(zhì)粒（本研究室保存）；BbsⅠ、磷酸酯酶（Fermentas 公司）；T4DNA 連接酶、T4多聚核苷酸激酶（NEB公司）；膠回收試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒（天根生化科技有限公司）；DMEM 高糖培養(yǎng)基（Gibco 公 司）；胎牛血 清（PAN 公 司）；LipofectAMINE 2000（Invitrogen 公 司）；抗SNF5 抗 體（Abcam 公司）；β-actin 抗體、辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠IgG（Santa Cruz公司）。

1.2 sgRNA靶點選擇及其寡核苷酸鏈設(shè)計

應(yīng)用CRISPR 在線設(shè)計工具（http://crispr.mit.edu/），在人源SNF5基因外顯子1 處設(shè)計了一對sgRNA。設(shè)計過程如下：①從SNF5基因起始密碼子處開始尋找長度約200 bp、富含NGG且位于同一外顯子上的序列，將序列提交至該網(wǎng)站；②根據(jù)提交后網(wǎng)站顯示的結(jié)果，選擇分?jǐn)?shù)較高的一對序列，自動生成的靶序列都是5'到3'共23 bp；③去掉序列3'端的NGG，并在5'端加上酶切位點CACC，其反向互補序列的5'端添加酶切位點AAAC，以便2條互補的寡核苷酸序列退火后，能夠與經(jīng)BbsⅠ酶切的質(zhì)粒的粘性末端互補；如果靶序列5'端第一個堿基不是G，那么應(yīng)先在5'端添加一個G，再加上酶切位點CACC，相應(yīng)地其反向互補序列的3'端再增加一個C。

1.3 SNF5sgRNA表達(dá)載體的構(gòu)建

首先用T4多聚核苷酸激酶對合成的2組引物分別進(jìn)行磷酸化和退火，退火后的sgRNA 分別插入經(jīng)BbsⅠ酶切的表達(dá)載體pSpCas9n（BB）-2A-GFP（簡稱pX461）和pSpCas9n（BB）-2A-Puro（簡稱pX462）中，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌落進(jìn)行測序鑒定（由北京六合華大基因科技股份有限公司完成），測序引物為5'-ATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATA-3'。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)293T細(xì)胞，將處于對數(shù)期生長的細(xì)胞接種于12 孔板，接種量以轉(zhuǎn)染時細(xì)胞密度達(dá)到90%為宜，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染過程按照LipofectAMINE 2000的說明書進(jìn)行。

1.5 Westen印跡分析

轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞后24～48 h 收集細(xì)胞，加入SDS上樣緩沖液，煮沸10 min，離心后取上清液進(jìn)行SDS-PAGE；電泳完畢轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，然后加入用5%脫脂奶粉稀釋的SNF5 抗體，4℃過夜，TBST 洗膜3 次，每次7 min；加入用5%脫脂奶粉稀釋的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠IgG，室溫輕搖1 h，TBST洗膜3次，每次7 min；顯色后壓片顯影。

2 結(jié)果

2.1 sgRNA靶點及寡核苷酸序列設(shè)計

將選擇的人源SNF5基因序列在線提交上述網(wǎng)站后，在外顯子1 處設(shè)計了一對sgRNA（圖1），網(wǎng)站生成的序列為5'-GACGGCGAGTTCTACATGATCG G-3'和5'-CTTCACGGGCTTCTGCCCGAAGG-3'。根據(jù)生成的靶序列，設(shè)計了4 條寡核苷酸序列（表1）。將合成的2 組寡核苷酸序列分別退火，退火后插入經(jīng)BbsⅠ酶切的表達(dá)載體pX461和pX462，構(gòu)建的表達(dá)載體分別為pX461-hSNF5sgRNA1、pX461-hSNF5sgRNA2、pX462-hSNF5sgRNA1 和pX462-hSNF5sgRNA2。

2.2 SNF5sgRNA表達(dá)載體構(gòu)建的測序結(jié)果

將構(gòu)建的4 個表達(dá)載體分別測序，結(jié)果顯示sgRNA 靶序列均正確插入pX461 和pX462，證明SNF5sgRNA表達(dá)載體構(gòu)建成功（圖2）。

2.3 sgRNA對SNF5表達(dá)的影響

表1 合成的寡核苷酸序列

圖1 一對靶向SNF5第1個外顯子的sgRNA

將pX461、pX461-hSNF5sgRNA1 和pX461-hSNF5sgRNA2、pX462、pX462-hSNF5sgRNA1 和pX462-hSNF5sgRNA2 分別轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24、48 h 收集細(xì)胞裂解液進(jìn)行Western 印跡。結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染pX461 空載體組比，轉(zhuǎn)染pX461-hSNF5sgRNA1 和pX461-hSNF5sgRNA2 后24 h，SNF5表達(dá)水平明顯降低，轉(zhuǎn)染后48 h，SNF5表達(dá)水平開始恢復(fù)；與轉(zhuǎn)染pX462 空載體組比，轉(zhuǎn)染pX462-hSNF5sgRNA1 和pX462-hSNF5sgRNA2 后24 h，SNF5 表達(dá)水平?jīng)]有明顯改變，轉(zhuǎn)染后48 h，SNF5 表達(dá)水平顯著降低（圖3）。此現(xiàn)象表明，不同標(biāo)簽載體表達(dá)的sgRNA 起效時間并不一致，需要根據(jù)實驗的具體情況進(jìn)行摸索。實驗結(jié)果表明，我們構(gòu)建的針對人源SNF5基因的CRISPR/Cas9n系統(tǒng)能夠敲除細(xì)胞中SNF5基因的表達(dá)。

3 討論

Cas9 核酸內(nèi)切酶有HNH 和RuvC 兩個活性位點，切割后產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂。基因組DNA通過啟動同源重組和非同源末端連接機制進(jìn)行修復(fù)，可能產(chǎn)生基因突變、插入或缺失[13]。CRISPR/Cas9的特異性與跟sgRNA 配對且靠近PAM 處的7～12 個堿基有關(guān)，因此CRISPR/Cas9 的靶向特異性非常低[14]，會造成研究結(jié)果的不確定性及工作量的大量增加，這種脫靶效應(yīng)會導(dǎo)致基因組中癌基因激活、其他序列突變等不良后果，給臨床應(yīng)用帶來風(fēng)險。張峰課題組將Cas9 的RuvC 催化位點進(jìn)行突變，形成產(chǎn)生單鏈切口的核酸酶Cas9 nickase（Cas9n），通過一對sgRNA 引導(dǎo)來實現(xiàn)靶向雙鏈切割，此方法能顯著降低（約1/50～1/1500）CRISPR/Cas9系統(tǒng)在細(xì)胞系中的脫靶效應(yīng)[15]。

本研究采用的即為上述CRISPR-Cas9n系統(tǒng)，本系統(tǒng)所用質(zhì)粒是CRISPR 與Cas9n 的共質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)，可以提高基因敲除效率。在設(shè)計sgRNA 靶序列時應(yīng)注意：靶序列應(yīng)位于基因同一個外顯子內(nèi)，不能在外顯子與內(nèi)含子交界處，且靶序列應(yīng)位于基因的CDS 區(qū)；如果外顯子內(nèi)CDS 序列少于60 bp，則沒必要再進(jìn)行設(shè)計，即使設(shè)計了效果也不佳；選擇的靶序列離ATG 越近越好。在線提交所選基因序列后，得出的評分結(jié)果是針對脫靶效應(yīng)的，分值越高脫靶效應(yīng)越小。

圖2 構(gòu)建的SNF5sgRNA表達(dá)載體測序峰圖

圖3 Westren印跡檢測SNF5蛋白表達(dá)水平

我們發(fā)現(xiàn)，293T 細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)入SNF5sgRNA 后，與轉(zhuǎn)染空載體組比，SNF5 表達(dá)水平顯著降低。這種SNF5表達(dá)水平改變反映的是SNF5在細(xì)胞群體水平敲除后的變化，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)切割基因組DNA后，細(xì)胞會啟動同源重組和非同源末端連接機制進(jìn)行修復(fù)，這些修復(fù)是隨機的，不同細(xì)胞個體突變修復(fù)后的基因型各不相同。本實驗中我們選擇了表達(dá)綠色熒光蛋白的pX461和表達(dá)嘌呤霉素的pX462兩種載體，可以借助綠色熒光蛋白進(jìn)行流式分選或借助嘌呤霉素進(jìn)行抗性篩選，實現(xiàn)目的細(xì)胞的聚集，便于通過有限稀釋法獲取SNF5基因穩(wěn)定敲除的單克隆細(xì)胞，通過測序即可得到基因型確定的敲除細(xì)胞株。

研究發(fā)現(xiàn)，SNF5基因的缺失是非典型畸胎瘤、橫紋肌樣瘤、黑色素瘤患者診斷的一個很好的標(biāo)記物[16-18]。Roberts 等發(fā)現(xiàn)，SNF5條件性失活小鼠在平均11周內(nèi)發(fā)生T細(xì)胞淋巴瘤，明顯快于p53、RB等重要腫瘤抑制基因[19]。然而SNF5突變后如何導(dǎo)致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，如何影響基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而如何導(dǎo)致癌癥的具體機制在很大程度上仍然不清楚。

綜上，我們利用CRISPR/Cas9 技術(shù)建立了SNF5基因靶向敲除系統(tǒng)，通過敲除細(xì)胞株中SNF5基因，為研究其在疾病中的功能和具體作用機制提供了很好的工具。

[1]Chylinski K,Le Rhun A,Charpentier E.The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPRCas immunity systems[J].RNA Biol,2013,10(5):726-737.

[2]Jinek M,Chylinski K,Fonfara I,et al.A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity[J].Science,2012,337(6096):816-821.

[3]Sapranauskas R,Gasiunas G,Fremaux C,et al.The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in Escherichia coli[J].Nucleic Acids Res,2011,39(21):9275-9282.

[4]Mali P,Esvelt K M,Church G M.Cas9 as a versatile tool for engineering biology[J].Nat Methods,2013,10(10):957-963.

[5]Brenca M,Rossi S,Lorenzetto E,et al.SMARCB1/INI1 genetic inactivation is responsible for tumorigenic properties of epithelioid sarcoma cell line VAESBJ[J].Mol Cancer Ther,2013,12(6):1060-1072.

[6]Carter J M,O'Hara C,Dundas G,et al.Epithelioid malig-nant peripheral nerve sheath tumor arising in a schwannoma,in a patient with“neuroblastoma-like”schwannomatosis and a novel germline SMARCB1 mutation[J].Am J Surg Pathol,2012,36(1):154-160.

[7]Hulsebos T J,Plomp A S,Wolterman R A,et al.Germline mutation of INI1/SMARCB1 in familial schwannomatosis[J].Am J Hum Genet,2007,80(4):805-810.

[8]Kohashi K,Oda Y,Yamamoto H,et al.SMARCB1/INI1 protein expression in round cell soft tissue sarcomas associated with chromosomal translocations involving EWS:a special reference to SMARCB1/INI1 negative variant extraskeletal myxoid chondrosarcoma[J].Am J Surg Pathol,2008,32(8):1168-1174.

[9]Mimori K,Inoue H,Shiraishi T,et al.A single-nucleotide polymorphism of SMARCB1 in human breast cancers[J].Genomics,2002,80(3):254-258.

[10]Rizzo D,Freneaux P,Brisse H,et al.SMARCB1 deficiency in tumors from the peripheral nervous system:a link between schwannomas and rhabdoid tumors[J]? Am J Surg Pathol,2012,36(7):964-972.

[11]Sullivan L M,Folpe A L,Pawel B R,et al.Epithelioid sarcoma is associated with a high percentage of SMARCB1 deletions[J].Mod Pathol,2013,26(3):385-392.

[12]Yuge M,Nagai H,Uchida T,et al.HSNF5/INI1 gene mutations in lymphoid malignancy[J].Cancer Genet Cytogenet,2000,122(1):37-42.

[13]Jinek M,Chylinski K,Fonfara I,et al.A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity[J].Science,2012,337(6096):816-821.

[14]Pattanayak V,Lin S,Guilinger J P,et al.High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity[J].Nat Biotechnol,2013,31(9):839-843.

[15]Ran F A,Hsu P D,Lin C Y,et al.Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity[J].Cell,2013,154(6):1380-1389.

[16]Vu-Han T L,Fruhwald M C,Hasselblatt M,et al.Identifying molecular markers for the sensitive detection of residual atypical teratoid rhabdoid tumor cells[J].Cancer Genet,2014,207(9):390-397.

[17]Kerl K,Oyen F,Leuschner I,et al.Detection of SMARCB1 loss in ascites cells in the diagnosis of an abdominal rhabdoid tumor[J].Pediatr Blood Cancer,2015,62(5):897-900.

[18]Stockman D L,Curry J L,Torres-Cabala C A,et al.Use of clinical next-generation sequencing to identified melanomas harboring SMARCB1 mutations[J].J Cutan Pathol,2015,42(5):308-317.

[19]Roberts C W,Leroux M M,Fleming M D,et al.Highly penetrant,rapid tumorigenesis through conditional inversion of the tumor suppressor gene Snf5[J].Cancer Cell,2002,2(5):415-425.