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        利用CRISPR/Cas9n系統(tǒng)敲除人源SNF5基因

        2015-11-29 08:31:48孫琰劉超毛赟赟王璽
        生物技術(shù)通訊 2015年6期
        關(guān)鍵詞:設(shè)計

        孫琰,劉超,毛赟赟,王璽

        1.天津醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,天津 300070;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所,北京 100071

        成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)是細(xì)菌的一種獲得性免疫系統(tǒng),用以保護(hù)細(xì)菌和古細(xì)菌不受病毒侵害。細(xì)菌被病毒侵染后,CRISPR關(guān)聯(lián)蛋白(CRISPR-associated proteins,Cas)位點會編碼多個核酸酶和解旋酶,形成Cas 蛋白復(fù)合物,對入侵的病毒DNA 進(jìn)行切割,產(chǎn)生的新片段會整合到CRISPR重復(fù)序列中,從而對該病毒產(chǎn)生特異性免疫記憶[1-2]。當(dāng)細(xì)菌再次遭到該病毒入侵時,便會轉(zhuǎn)錄出與入侵病毒DNA 序列相匹配的小分子RNA,Cas 蛋白復(fù)合物利用這些RNA 去切割外源病毒DNA,導(dǎo)致病毒不能在細(xì)菌內(nèi)進(jìn)行復(fù)制。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)是基于細(xì)菌和古細(xì)菌的這種免疫防御機制而改造的一種基因組編輯技術(shù)[3],利用人工設(shè)計的單向?qū)NA(single-guide RNA,sgRNA)介導(dǎo)外源Cas9 蛋白與靶基因結(jié)合,切割帶有5'-NGG 的間隔相鄰基序(protospacer adjacent motifs,PAM),從而實現(xiàn)對靶基因DNA的特異性切割[4]。

        表觀遺傳在癌癥發(fā)生發(fā)展中有重要作用,染色質(zhì)重塑是表觀遺傳的重要機制之一,染色質(zhì)重塑復(fù)合物通過水解ATP 產(chǎn)生的能量來改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu),進(jìn)而調(diào)節(jié)基因表達(dá)。染色質(zhì)重塑復(fù)合物是較大的多亞基復(fù)合物,已知有SWI/SNF、ISWI、CHD 和IN080四大類。其中SWI/SNF是目前研究最多的,SNF5是SWI/SNF 染色質(zhì)重塑復(fù)合物的核心組分之一,高度保守。研究發(fā)現(xiàn)SNF5是一個強抑癌基因,在許多惡性腫瘤中突變或缺失,如橫紋肌樣瘤、神經(jīng)鞘瘤、淋巴瘤、乳腺癌、上皮樣肉瘤及其他軟組織的惡性腫瘤等[5-12]。目前有關(guān)SNF5的抗腫瘤機制研究不多。我們設(shè)計了針對SNF5基因的sgRNA,構(gòu)建了SNF5基因的CRISPR/Cas9n 表達(dá)載體,旨在通過敲除SNF5基因為深入研究SNF5的抗腫瘤機制奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        人胚腎293T 細(xì)胞、大腸桿菌DH5α、pX461 和pX462 質(zhì)粒(本研究室保存);BbsⅠ、磷酸酯酶(Fermentas 公司);T4DNA 連接酶、T4多聚核苷酸激酶(NEB公司);膠回收試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒(天根生化科技有限公司);DMEM 高糖培養(yǎng)基(Gibco 公 司);胎牛血 清(PAN 公 司);LipofectAMINE 2000(Invitrogen 公 司);抗SNF5 抗 體(Abcam 公司);β-actin 抗體、辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠IgG(Santa Cruz公司)。

        1.2 sgRNA靶點選擇及其寡核苷酸鏈設(shè)計

        應(yīng)用CRISPR 在線設(shè)計工具(http://crispr.mit.edu/),在人源SNF5基因外顯子1 處設(shè)計了一對sgRNA。設(shè)計過程如下:①從SNF5基因起始密碼子處開始尋找長度約200 bp、富含NGG且位于同一外顯子上的序列,將序列提交至該網(wǎng)站;②根據(jù)提交后網(wǎng)站顯示的結(jié)果,選擇分?jǐn)?shù)較高的一對序列,自動生成的靶序列都是5'到3'共23 bp;③去掉序列3'端的NGG,并在5'端加上酶切位點CACC,其反向互補序列的5'端添加酶切位點AAAC,以便2條互補的寡核苷酸序列退火后,能夠與經(jīng)BbsⅠ酶切的質(zhì)粒的粘性末端互補;如果靶序列5'端第一個堿基不是G,那么應(yīng)先在5'端添加一個G,再加上酶切位點CACC,相應(yīng)地其反向互補序列的3'端再增加一個C。

        1.3 SNF5sgRNA表達(dá)載體的構(gòu)建

        首先用T4多聚核苷酸激酶對合成的2組引物分別進(jìn)行磷酸化和退火,退火后的sgRNA 分別插入經(jīng)BbsⅠ酶切的表達(dá)載體pSpCas9n(BB)-2A-GFP(簡稱pX461)和pSpCas9n(BB)-2A-Puro(簡稱pX462)中,然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,挑取單克隆菌落進(jìn)行測序鑒定(由北京六合華大基因科技股份有限公司完成),測序引物為5'-ATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATA-3'。

        1.4 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

        用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)293T細(xì)胞,將處于對數(shù)期生長的細(xì)胞接種于12 孔板,接種量以轉(zhuǎn)染時細(xì)胞密度達(dá)到90%為宜,培養(yǎng)24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染過程按照LipofectAMINE 2000的說明書進(jìn)行。

        1.5 Westen印跡分析

        轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞后24~48 h 收集細(xì)胞,加入SDS上樣緩沖液,煮沸10 min,離心后取上清液進(jìn)行SDS-PAGE;電泳完畢轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,然后加入用5%脫脂奶粉稀釋的SNF5 抗體,4℃過夜,TBST 洗膜3 次,每次7 min;加入用5%脫脂奶粉稀釋的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠IgG,室溫輕搖1 h,TBST洗膜3次,每次7 min;顯色后壓片顯影。

        2 結(jié)果

        2.1 sgRNA靶點及寡核苷酸序列設(shè)計

        將選擇的人源SNF5基因序列在線提交上述網(wǎng)站后,在外顯子1 處設(shè)計了一對sgRNA(圖1),網(wǎng)站生成的序列為5'-GACGGCGAGTTCTACATGATCG G-3'和5'-CTTCACGGGCTTCTGCCCGAAGG-3'。根據(jù)生成的靶序列,設(shè)計了4 條寡核苷酸序列(表1)。將合成的2 組寡核苷酸序列分別退火,退火后插入經(jīng)BbsⅠ酶切的表達(dá)載體pX461和pX462,構(gòu)建的表達(dá)載體分別為pX461-hSNF5sgRNA1、pX461-hSNF5sgRNA2、pX462-hSNF5sgRNA1 和pX462-hSNF5sgRNA2。

        2.2 SNF5sgRNA表達(dá)載體構(gòu)建的測序結(jié)果

        將構(gòu)建的4 個表達(dá)載體分別測序,結(jié)果顯示sgRNA 靶序列均正確插入pX461 和pX462,證明SNF5sgRNA表達(dá)載體構(gòu)建成功(圖2)。

        2.3 sgRNA對SNF5表達(dá)的影響

        表1 合成的寡核苷酸序列

        圖1 一對靶向SNF5第1個外顯子的sgRNA

        將pX461、pX461-hSNF5sgRNA1 和pX461-hSNF5sgRNA2、pX462、pX462-hSNF5sgRNA1 和pX462-hSNF5sgRNA2 分別轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后24、48 h 收集細(xì)胞裂解液進(jìn)行Western 印跡。結(jié)果顯示,與轉(zhuǎn)染pX461 空載體組比,轉(zhuǎn)染pX461-hSNF5sgRNA1 和pX461-hSNF5sgRNA2 后24 h,SNF5表達(dá)水平明顯降低,轉(zhuǎn)染后48 h,SNF5表達(dá)水平開始恢復(fù);與轉(zhuǎn)染pX462 空載體組比,轉(zhuǎn)染pX462-hSNF5sgRNA1 和pX462-hSNF5sgRNA2 后24 h,SNF5 表達(dá)水平?jīng)]有明顯改變,轉(zhuǎn)染后48 h,SNF5 表達(dá)水平顯著降低(圖3)。此現(xiàn)象表明,不同標(biāo)簽載體表達(dá)的sgRNA 起效時間并不一致,需要根據(jù)實驗的具體情況進(jìn)行摸索。實驗結(jié)果表明,我們構(gòu)建的針對人源SNF5基因的CRISPR/Cas9n系統(tǒng)能夠敲除細(xì)胞中SNF5基因的表達(dá)。

        3 討論

        Cas9 核酸內(nèi)切酶有HNH 和RuvC 兩個活性位點,切割后產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂。基因組DNA通過啟動同源重組和非同源末端連接機制進(jìn)行修復(fù),可能產(chǎn)生基因突變、插入或缺失[13]。CRISPR/Cas9的特異性與跟sgRNA 配對且靠近PAM 處的7~12 個堿基有關(guān),因此CRISPR/Cas9 的靶向特異性非常低[14],會造成研究結(jié)果的不確定性及工作量的大量增加,這種脫靶效應(yīng)會導(dǎo)致基因組中癌基因激活、其他序列突變等不良后果,給臨床應(yīng)用帶來風(fēng)險。張峰課題組將Cas9 的RuvC 催化位點進(jìn)行突變,形成產(chǎn)生單鏈切口的核酸酶Cas9 nickase(Cas9n),通過一對sgRNA 引導(dǎo)來實現(xiàn)靶向雙鏈切割,此方法能顯著降低(約1/50~1/1500)CRISPR/Cas9系統(tǒng)在細(xì)胞系中的脫靶效應(yīng)[15]。

        本研究采用的即為上述CRISPR-Cas9n系統(tǒng),本系統(tǒng)所用質(zhì)粒是CRISPR 與Cas9n 的共質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng),可以提高基因敲除效率。在設(shè)計sgRNA 靶序列時應(yīng)注意:靶序列應(yīng)位于基因同一個外顯子內(nèi),不能在外顯子與內(nèi)含子交界處,且靶序列應(yīng)位于基因的CDS 區(qū);如果外顯子內(nèi)CDS 序列少于60 bp,則沒必要再進(jìn)行設(shè)計,即使設(shè)計了效果也不佳;選擇的靶序列離ATG 越近越好。在線提交所選基因序列后,得出的評分結(jié)果是針對脫靶效應(yīng)的,分值越高脫靶效應(yīng)越小。

        圖2 構(gòu)建的SNF5sgRNA表達(dá)載體測序峰圖

        圖3 Westren印跡檢測SNF5蛋白表達(dá)水平

        我們發(fā)現(xiàn),293T 細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)入SNF5sgRNA 后,與轉(zhuǎn)染空載體組比,SNF5 表達(dá)水平顯著降低。這種SNF5表達(dá)水平改變反映的是SNF5在細(xì)胞群體水平敲除后的變化,CRISPR/Cas9 系統(tǒng)切割基因組DNA后,細(xì)胞會啟動同源重組和非同源末端連接機制進(jìn)行修復(fù),這些修復(fù)是隨機的,不同細(xì)胞個體突變修復(fù)后的基因型各不相同。本實驗中我們選擇了表達(dá)綠色熒光蛋白的pX461和表達(dá)嘌呤霉素的pX462兩種載體,可以借助綠色熒光蛋白進(jìn)行流式分選或借助嘌呤霉素進(jìn)行抗性篩選,實現(xiàn)目的細(xì)胞的聚集,便于通過有限稀釋法獲取SNF5基因穩(wěn)定敲除的單克隆細(xì)胞,通過測序即可得到基因型確定的敲除細(xì)胞株。

        研究發(fā)現(xiàn),SNF5基因的缺失是非典型畸胎瘤、橫紋肌樣瘤、黑色素瘤患者診斷的一個很好的標(biāo)記物[16-18]。Roberts 等發(fā)現(xiàn),SNF5條件性失活小鼠在平均11周內(nèi)發(fā)生T細(xì)胞淋巴瘤,明顯快于p53、RB等重要腫瘤抑制基因[19]。然而SNF5突變后如何導(dǎo)致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變,如何影響基因的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而如何導(dǎo)致癌癥的具體機制在很大程度上仍然不清楚。

        綜上,我們利用CRISPR/Cas9 技術(shù)建立了SNF5基因靶向敲除系統(tǒng),通過敲除細(xì)胞株中SNF5基因,為研究其在疾病中的功能和具體作用機制提供了很好的工具。

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