張 棋 吳志新 李 景 胡 明 石 焱 任雨薇 陳孝煊

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中華鱉腸道益生菌的篩選、鑒定與生長特性研究

張 棋 吳志新 李 景 胡 明 石 焱 任雨薇 陳孝煊

(華中農業(yè)大學水產(chǎn)學院, 農業(yè)部淡水生物繁育重點實驗室, 淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心, 武漢 430070)

通過點種法初篩和牛津杯法復篩, 從中華鱉腸道篩選到1株對嗜水氣單胞菌()、溫和氣單胞菌()以及豚鼠氣單胞菌()具有拮抗作用的益生菌株Dec-43。對該菌株進行形態(tài)、生理生化特征分析, 結果與《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》中屎腸球菌()的生理生化特征一致。提取細菌基因組DNA, 通過16S rRNA基因通用引物進行PCR擴增, 從該菌株的16S rRNA基因中克隆到了一個長度1448 bp的片段, 經(jīng)測序和序列比對, 該片段與Genbank中屎腸球菌的序列相似性達99%, 因此, 該菌株確定為屎腸球菌。通過單因素試驗確定了該菌株的最佳生長溫度、鹽度、初始pH、接種量等參數(shù)分別為: 36℃、鹽度0.6%、培養(yǎng)基初始pH 7、接種量10%; 通過正交試驗, 確定了該菌株培養(yǎng)基中碳源(葡萄糖)、氮源(蛋白胨)最適含量分別為15和10 g/L。研究發(fā)現(xiàn)了一株中華鱉腸道潛在益生菌, 并研究了其生長特性, 為中華鱉養(yǎng)殖行業(yè)益生菌的應用提供了基礎。

中華鱉腸道; 益生菌; 拮抗作用; 屎腸球菌; 生長特性

中華鱉()是我國重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種, 在我國水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)占據(jù)著重要地位。但是, 在中華鱉的養(yǎng)殖過程中, 嗜水氣單胞菌()、溫和氣單胞菌()以及豚鼠氣單胞菌()等病原菌可引起多種疾病[1—4], 造成巨大的經(jīng)濟損失。目前, 對于中華鱉細菌性疾病防治主要依賴抗生素等藥物, 但隨著抗生素的大量使用, 也帶來了越來越多的問題: 如病原菌的抗藥性、養(yǎng)殖水體的菌群失調, 以及藥物殘留問題[5]。益生菌能有效提高宿主生長性能、消化能力[6], 增加宿主特定生長率, 抑制病原細菌的生長, 提高飼料利用率[7]。益生菌通過促進宿主血清溶菌酶活性、補體旁路活性以及頭腎吞噬細胞的吞噬活性和呼吸暴發(fā)活性, 能顯著提高宿主免疫力, 使得宿主對病原菌的抗病能力顯著提高[8]。同時益生菌也能有效降低水體硝酸鹽、亞硝酸鹽、氨氮含量, 凈化水質, 改善水產(chǎn)養(yǎng)殖動物生存環(huán)境[9]。目前報道的中華鱉益生菌主要為芽孢桿菌, 如枯草芽孢桿菌[6]。本項研究從中華鱉腸道菌群中分離到一株對嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌具有拮抗作用的益生菌, 并對其生長特性和培養(yǎng)條件等進行研究, 為中華鱉益生菌的研究與開發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康的中華鱉,購自江西金龜王實業(yè)有限責任公司, 用于篩選益生菌。

實驗菌株嗜水氣單胞菌CCAM050021菌株、溫和氣單胞菌CCAM050055菌株, 由本實驗室保存; 豚鼠氣單胞菌由福建省農科院提供。

培養(yǎng)基肉湯培養(yǎng)基(牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基): 牛肉膏 5.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、NaCl 5 g/L、瓊脂 2%, pH 7.2—7.4。

實驗試劑細菌基因組DNA提取試劑盒(康為世紀), 2×PCR Master Mix(Sinobio), 膠回收試劑盒(Gel Extraction Kit, Biomiga)。

1.2 實驗方法

中華鱉腸道細菌的分離在無菌條件下, 解剖健康中華鱉, 取出腸道, 刮取中華鱉的腸道內容物0.2 g, 分別按1∶10 (/) 的比例加入滅菌生理鹽水稀釋, 樣品設為10–1, 再用滅菌生理鹽水對10–1樣品進行10倍稀釋至10–7, 各稀釋度樣品均置于渦旋振蕩儀上振蕩均勻。取10–3、10–4和10–53個稀釋度各0.1 mL涂布于牛肉膏蛋白胨平板, 每個稀釋度涂布3個平板, 28℃恒溫培養(yǎng)24—28h。然后選取菌落清晰、分散且菌落數(shù)在30—300個之間的平板, 隨機挑取30—50個菌落, 編號, 作為待測菌株。將純化后的待測菌株接種到牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上, 28℃培養(yǎng)24—28h后置4℃冰箱中備用。

益生菌的初篩采用點種法進行初篩, 調整指示菌(嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌以及豚鼠氣單胞菌)菌液濃度為106cfu/mL, 吸取0.1 mL涂布于牛肉膏蛋白胨平板上。然后挑取一環(huán)篩選的菌株點種于平板上。28℃培養(yǎng)24h, 觀察抑菌圈。

益生菌的復篩采用牛津杯法進行復篩, 選取初篩中抑菌效果明顯的細菌, 活化24h后調整濃度為106cfu/mL。將指示菌菌液濃度調整為106cfu/mL, 吸取0.1 mL涂布于牛肉膏蛋白胨平板上。用無菌鑷子取滅菌后的牛津杯置于涂有指示菌的平板上, 輕壓, 使杯底緊貼于培養(yǎng)基上。每個牛津杯加入0.2 mL初篩的益生菌菌液。然后將平皿放入28℃的恒溫箱培養(yǎng)24h, 測抑菌圈大小。

益生菌的酸耐受實驗將益生菌活化后, 調整菌濃度為1×108cfu/mL, 按5%的接種量分別接種到pH為2.0、3.0、4.0、5.0的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基, 36℃、200 r/min震蕩培養(yǎng), 1h、2h后取菌液進行涂平板計數(shù), 計算存活率。

益生菌的生理生化鑒定以及16S rRNA基因序列分析 參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[10], 依據(jù)形態(tài)及生理生化特征對分離的益生菌進行鑒定。利用試劑盒提取益生菌的DNA, 用引物27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′, 1492R: 5′-TAC GGYTACCTTGTTACGACTT-3′進行PCR擴增, PCR反應體系組成: 2×PCR Master Mix 12.5 μL, 引物27F和1492R各1 μL, 模板DNA 1 μL, 最后用滅菌雙蒸水補充至25 μL。反應程序為: 95℃ 3min; 90℃ 30s, 55℃ 1min, 72℃ 1.5min, 共30個循環(huán); 最后72℃ 10min, 4℃結束反應。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1% (/)瓊脂糖凝膠電泳, 產(chǎn)物經(jīng)切膠回收后送上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。序列在Genbank上進行Blast比對, 選擇與比對序列相似度高的菌株。

擬選菌株生長曲線的測定將益生菌菌株按5%的接種量接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中, 36℃轉速200 r/min震蕩培養(yǎng), 每2h測定培養(yǎng)基在600 nm的OD值(Optical Density), 以未接種的培養(yǎng)基作為對照。確定細菌進入穩(wěn)定期所需時間, 實驗重復3次。

益生菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化按5%的接種量, 將益生菌接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中, 分別放在16℃、20℃、24℃、28℃、32℃、36℃、40℃、44℃恒溫搖床中培養(yǎng), 轉速為200 r/min, 在600 nm處測OD值, 確定最適生長溫度。在最適生長溫度下, 分別按2%、4%、6%、8%、10%、12%的接種量接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基, 測定最佳接種量; 設置牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基初始pH (分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)、不同鹽度(分別為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%), 按5%的接種量, 最適溫度下200 r/min震蕩培養(yǎng), 600 nm處測OD值。以上實驗均重復3次。

不同碳氮比對益生菌生長的影響以培養(yǎng)基蛋白胨濃度分別為5.0%、7.5%、10.0%、12.5%、15.0%, 葡萄糖濃度分別為5.0%、7.5%、10.0%、12.5%、15.0%設計正交試驗, 培養(yǎng)條件為前述確定的最佳培養(yǎng)條件, 轉速200 r/min震蕩培養(yǎng)。

2 結果

2.1 益生菌的初篩

本實驗從腸道中分離純化出400株菌株, 初篩發(fā)現(xiàn)5株對三種病原菌均具有拮抗的菌株, 菌株編號分別為Oct-44、Oct-72、Dec-31、Dec-43、Dec-62。

2.2 益生菌的復篩

上述5株細菌對三株病原菌的抑菌圈見表1, 表明菌株Dec-43對三株病原菌均具有較好的拮抗作用。

2.3 益生菌的酸耐受實驗

菌株Dec-43在不同pH耐受實驗的存活率如表2。菌株Dec-43對低pH耐受性較強, 在pH為2時,處理1h后, 存活率為68.4%, 處理2h后, 存活率為50.2%, 在pH為3—5時, 1h后的存活率為97%以上, 2h后的存活率也達到88%以上。

2.4 菌株生理生化結果分析以及16S rRNA基因序列分析結果

菌株Dec-43生理生化特性見表3。所測項目與《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[10]中屎腸球菌()的描述一致。測序得到Dec-43 16S rRNA基因序列長度為1448 bp, 在GenBank數(shù)據(jù)庫進行Blast比對, 結果顯示Dec-43與屎腸球菌的序列相似性達99%。根據(jù)Dec-43及與其相似的細菌序列, 利用ClustalX 1.83和Mega 5.10軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹, 結果顯示Dec-43與屎腸球菌的親緣關系最近(圖1)。根據(jù)菌株Dec-43的生理生化特性與16S rRNA分子鑒定結果, 確認該菌株為屎腸球菌。

2.5 Dec-43的生長曲線

由圖2可知, 當培養(yǎng)時間達到16h之后, 菌液OD值變動的幅度不大, 說明細菌生長緩慢, 已進入穩(wěn)定期, 選擇24h作為后期實驗測定菌液600的時間點。

2.6 不同培養(yǎng)條件對Dec-43生長的影響

由圖3可知, 隨著培養(yǎng)溫度的升高, 培養(yǎng)基中細菌數(shù)量逐漸增多, 當溫度在36℃時, 培養(yǎng)24h后菌液OD值最大。隨著接種量的增加, 培養(yǎng)基中細菌數(shù)量逐漸增多, 但接種量達到一定量后, 反而會不利細菌的生長, 當接種量為10%時, 培養(yǎng)24h后菌液OD值最大。隨著培養(yǎng)鹽度的升高, 培養(yǎng)基中細菌數(shù)量逐漸增多, 但鹽度達到一定濃度后, 反而會不利細菌的生長, 當鹽度為0.6%時, 培養(yǎng)24h后菌液OD值最大。由圖可知, Dec-43在培養(yǎng)基pH較低和較高的情況下均具有一定的生長能力。當初始pH為7時, 培養(yǎng)24h后菌液OD值最大。

表1 分離株對指示菌株的拮抗作用

注: 表中的數(shù)字為抑菌圈的直徑, 單位為“cm”; “－”表示沒有抑制作用

Note: The data in the table was processed diameter of inhibition zone. The unit “cm” and “－” means there was no inhibiting effect

表2 不同pH條件和處理時間下Dec-43的存活率

注: 數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示

Note: Data are presented as mean±standard deviations

表3 菌株Dec-43的生理生化特征

注: +為陽性, –為陰性

Note: + means positive, – means negative

2.7 不同碳氮比對Dec-43生長的影響

正交試驗結果如表4所示, 結果表明, 葡萄糖含量為15 g/L, 蛋白胨含量為10 g/L是最佳的碳氮比。在最佳培養(yǎng)條件下, 該菌在培養(yǎng)24h后菌液中菌濃度可達到3.6×109cfu/mL。

表4 碳氮比對菌株Dec-43生長影響的正交實驗

3 討論

動物腸道具有特定的微生態(tài)環(huán)境, 腸道內固有菌群對宿主腸道微生態(tài)環(huán)境具有較強適應性, 因此選定腸道內固有菌群作為益生菌篩選的來源有利于益生菌的定植[11], 許多益生菌的篩選都是從腸道菌群中進行篩選的[12, 13]。益生菌篩選的一種比較普遍的方法是體外拮抗實驗, 選出能夠在固體培養(yǎng)基中對指示菌株生長具有抑制現(xiàn)象的益生菌菌株[14]。本實驗通過點種法初篩和牛津杯法復篩得出的菌株Dec-43對指示菌株均具有良好的體外拮抗作用, 具有益生菌潛在作用。

研究表明, 中華鱉胃液中蛋白酶最適pH為2.2, 該酶在胃內也可能處于最適pH狀態(tài)[15], 說明中華鱉胃液pH偏酸性。而益生菌需要通過消化道進入機體定植后才能發(fā)揮作用, Satish Kumar等[16]從鯔腸道內篩選出了一株屎腸球菌, 該菌株能在pH為2.0的腸液處理2h后仍然具有一定的存活率, 說明該菌株耐酸能力強。本實驗篩選出的菌株能夠耐受較高的酸性條件, 在pH為2時, 處理2h后, 存活率仍然有50%左右, 這對于菌株Dec-43順利通過胃到達腸道提供了條件。

屎腸球菌是目前應用比較廣泛的一種腸道益生菌, 1984年美國食品藥品管理局(FDA)及美國飼料監(jiān)察協(xié)會(AAFCO)已經(jīng)允許屎腸球菌和糞腸球菌作為飼料安全菌種使用, 我國《飼料添加劑品種目錄(2008)》允許使用的飼料級微生物菌種也包括屎腸球菌。屎腸球菌可作為多種動物的益生菌, 宿主包括豬[17]、鼠[18]、雞[19]、牛[20]、歐洲鰻鱺[21]等。有研究表明, 通過投喂屎腸球菌, 仔豬生長性能、免疫和抗氧化功能都有了相應的提高[22]; 通過對小牛投喂該菌, 發(fā)現(xiàn)該菌亦對宿主免疫功能有調節(jié)作用[23]; 通過實驗證實屎腸球菌能有效增強鯉抵抗嗜水氣單胞菌感染[24]。但是目前用于中華鱉腸道益生菌的屎腸球菌還沒有報道。本實驗從健康中華鱉腸道內篩選出對嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌和豚鼠氣單胞菌具有拮抗作用的益生菌株Dec-43, 并通過生理生化反應以及16S rRNA基因序列分析鑒定確認為屎腸球菌, 具有潛在的應用前景。此外, 本實驗還確定了菌株Dec-43最佳生長溫度、鹽度、初始pH、接種量以及培養(yǎng)基中碳源(葡萄糖)、氮源(蛋白胨)最適含量等技術參數(shù), 為該菌株應用于生產(chǎn)實踐提供了一定的理論依據(jù)。

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THE SELECTION, IDENTIFICATION, AND CHARACTERIZATION OF THE GROWTH OF PROBIOTICS FROM INTESTINAL TRACT OF CHINESE SOFTSHELL TURTLE ()

ZHANG Qi, WU Zhi-xin, LI Jing, HU Ming, SHI Yan, REN Yu-wei and CHEN Xiao-xuan

(College of Fisheries, Huazhong Agricultural University/Key Lab of Freshwater Animal Breeding, Ministry of Agriculture/Freshwater Aquaculture Collaborative Innovation Center of Hubei Province, Wuhan 430070, China)

The aim of this study was to isolate the potential probiotics and to identify their effects. Using spot inoculation as the first screening and the Oxford cup method as the second screening, we isolated a strain of bacterium, namely Dec-43, from the intestinal tract of Chinese softshell turtle (). This strain had antagonistic effects on bacterial strains including,and. The analysis in bacterial morphology, physiology, and biochemistry indicated that Dec-43 shared the same physiological and biochemical properties with. We used universal primers to amplify the 16S rRNA gene with PCR, and obtained a segment of 1448 bp from the total genomic DNA of Dec-43. After the sequencing and the BLAST analysis of this segment we found that the homology between Dec-43 andwas 99%. These results suggested that the Dec-43 should be. By conducting the single factor test we determined that the optimal growth temperature of Dec-43 was 36℃; the optimal salinity was 0.6%; the optimal initial pH was 7; the optimal growth inoculum size was 10%. Through the orthogonal experiment we also determined the proper carbon (glucose) and nitrogen (peptone) contents should be 15 and 10 g/L respectively.

Intestinal tract of Chinese softshell turtle (); Probiotics; Antagonism;; Growth characteristics

10.7541/2015.39

Q939.1

A

1000-3207(2015)02-0294-07

2014-04-21;

2014-07-25

國家科技支撐計劃(2012BAD25B00); 淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心課題(2013PY070); 國家自然科學基金(31472310)資助

張棋(1989—), 男, 湖北松滋人; 碩士研究生; 主要研究方向為水產(chǎn)微生物學。E-mail: zhangqi1989@webmail.hzau.edu.cn

陳孝煊(1962—), 男, 福建連江人; 教授; 主要從事水生動物病害研究。E-mail: chenxx@mail.hzau.edu.cn