姜麗娟 劉文生 林齊鵬 饒飛翔 楊惠暖 王 娟 王 濤 付晶晶

?

黃顙魚重組生長激素的制備及對其魚苗生長的影響

姜麗娟1劉文生1林齊鵬2饒飛翔1楊惠暖1王 娟1王 濤1付晶晶1

(1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院, 廣州 510642; 2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)公共基礎(chǔ)課實驗教學(xué)中心, 廣州 510642)

生長激素在漁業(yè)生產(chǎn)中具有重要的應(yīng)用價值, 通過制備黃顙魚()同源重組生長激素并用于促生長實驗, 從而為建立魚苗快速培育方法提供理論依據(jù)。根據(jù)已知黃顙魚生長激素(PfGH)基因cDNA序列, 利用IPTG誘導(dǎo)和SDS-PAGE分析方法, Western印跡表明在IPTG終濃度1.0 mmol/L、溫度17℃和培養(yǎng)時間14h的條件下, 黃顙魚生長激素基因在大腸桿菌中大量表達, 獲得重組生長激素蛋白。然后, 隨機選取黃顙魚分為4組放入室內(nèi)水族箱中進行養(yǎng)殖, 每箱35尾, 體質(zhì)量為(0.85±0.01) g, 每組設(shè)3個平行, 水體循環(huán)凈化。用制備的重組生長激素濃度分別為0、1、5和10 mg/L對黃顙魚進行浸泡處理, 每周一次, 0為對照組。在養(yǎng)殖4周后, 對各組增重率和特定生長率進行比較, 結(jié)果表明1 mg/L組增重率和特定生長率分別比對照組提高了29.67% (<0.05)和11.90% (<0.05), 5 mg/L組增重率和特定生長率分別比對照組提高了21.32% (<0.05)和8.83% (<0.05), 各組間體成分等均無明顯差異。停用生長激素4周后, 各組黃顙魚的生長性能、體成分等均無顯著差異。研究表明通過原核表達可以獲得黃顙魚重組生長激素, 用于促進魚苗生長培育的最佳浸泡濃度為1 mg/L。

黃顙魚; 生長激素; 原核表達; 浸泡; 增重率

魚類生長激素(Growth hormone, GH)在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用已經(jīng)成為研究熱點, 外源生長激素能被魚類消化道吸收, 硬骨魚類小腸上皮細胞可以通過胞飲作用吸收大分子, 并以具有免疫活性和生物活性的形式進入血液[1—3]。利用自身的GH促進魚類生長, 具有同源性強、效用劑量低等優(yōu)點[4]。應(yīng)用基因工程技術(shù)合成魚類重組GH(rGH), 不僅解決了魚體內(nèi)GH量少且提取繁瑣等問題, 而且具有與天然GH相同的生物活性。通過注射[5, 6]、埋植、浸泡[7, 8]、灌喂和投喂[9, 10]等方式將外源GH引入魚體內(nèi), 均能引起魚體血漿GH水平升高[11, 12], 促進魚類生長[13—16]。如每2周一次對鯔注射重組黃鰭鯛生長激素, 16周后試驗組的體重和體長增長分別比對照組快65%和22%[17]; 用重組鮭生長激素作為飼料添加劑投喂羅非魚, 具有很強的促進魚體生長作用[10]; 通過注射、灌喂和投喂三種方式將金槍魚基因重組生長激素導(dǎo)入草魚體內(nèi), 均能提高草魚魚種的相對體重和相對體長生長率[18]; 用重組鰻生長激素溶液定期浸泡真鯛仔魚, 4周后就能看出明顯的增長效果[7]。另外, 研究表明, 外源GH在魚體半衰期短, 不會產(chǎn)生積累[3], 不會影響魚體組成成分[19]。

黃顙魚()隸屬于鲇形目(Siluri-formes), 鲿科(Bagridae), 黃顙魚屬(), 主要產(chǎn)于長江及支流[20], 我國大部分地區(qū)都有分布。因其味道鮮美, 肉質(zhì)細嫩, 無肌間刺, 且蛋白質(zhì)豐富, 深受廣大消費者的青睞[21], 是我國重要的經(jīng)濟魚類之一[22]。由于濫捕及水域環(huán)境問題等原因, 野生黃顙魚資源數(shù)量銳減, 而市場需求越來越大。然而, 黃顙魚生長速度慢, 1齡可達: 5.6 cm/5.7 g , 2齡: 9.8 cm/20.6 g , 3齡: 13.5 cm/36 g , 4齡: 16 cm/58.2 g , 5齡: 17.8 cm/81.3 g , 最大個體30 cm , (500—750) g[23], 商品魚市場出現(xiàn)供不應(yīng)求。因此, 本研究選擇原核表達方法制備黃顙魚生長激素重組蛋白, 并用于對黃顙魚魚苗進行浸泡處理, 然后觀察在不同濃度重組生長激素作用下, 幼魚的生長、形態(tài)性狀及魚體組成分的變化, 確定最適的浸泡濃度, 為建立黃顙魚魚苗的快速培育技術(shù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 GH的原核表達

根據(jù)已報道的黃顙魚生長激素cDNA ORF序列[24], 去掉20個氨基酸的信號肽序列后, 將成熟肽基因片段定向插入融合表達載體pET-28a(+), 命名為pET-PfGH。根據(jù)黃顙魚GH成熟肽cDNA編碼序列設(shè)計一對引物, 通過PCR擴增得到黃顙魚生長激素cDNA片段, 上游引物F: 5′-CTGGCTGCCAAGA TGATGGA-3′, R: 5′-TCTCCACCTTGTGCATGTCC- 3′, 由上海捷瑞生物工程有限公司合成。用PCR方法篩選陽性克隆, 上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行測序, 獲得重組質(zhì)粒pET-PfGH轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。培養(yǎng)重組質(zhì)粒單菌落, 誘導(dǎo)表達, 收集菌體, 裂解菌體。取全菌液、超聲破碎后上清和沉淀分別制樣, 12%的SDS-PAGE進行電泳分析。

1.2 GH的純化回收

將菌體裂解液上清用0.22 μm 過濾器過濾后, 用北京康為世紀生物科技有限公司的5 mL預(yù)裝柱, 采用Ni-瓊脂糖凝膠親和層析分離帶His標簽的重組蛋白, 用Binding Buffer (20 mmol/L Tris-HCl, 10 mmol/L咪唑, 0.5 mol/L NaCl, pH 7.9)等倍稀釋后負載上柱, 流速為10倍柱體積/h, 收集流穿液; 使用15倍柱體積的Binding Buffer沖洗柱子, 洗去雜蛋白; 依次用含咪唑濃度為5、10、25、50、150、300、400和500 mmol/L 的Elution Buffer (20 mmol/L Tris-HCl, 0.5 mol/L NaCl, pH 7.9)洗脫, 收集洗脫峰, 進行 SDS-PAGE 分析。將洗脫后的蛋白溶液加入到10 kD的Millipore超濾管中, 4℃、4000 r/min離心10min, 棄下部液體, 同時加入與棄液相同體積的生理鹽水, 離心并重復(fù)三次, 收集上部液體。

將全菌液、超聲裂解液上清、沉淀和純化后的蛋白Western 印跡分析, 一抗為抗His標簽鼠單克隆抗體, 二抗為HRP標記山羊抗小鼠IgG (H+L), 使用康為世紀BCA蛋白定量試劑盒測定目的蛋白濃度。

1.3 黃顙魚魚苗養(yǎng)殖

實驗魚購自本地養(yǎng)殖場同批全雄黃顙魚魚苗, 隨機選取體質(zhì)量為(0.85±0.0078) g的魚苗放入80 cm × 60 cm × 50 cm的水族箱中飼養(yǎng), 每箱35尾。實驗分為4組, 其中對照組1個組, 試驗組3個組, 各組間無差異性, 每組3個平行, 養(yǎng)殖水體保持循環(huán)凈化, 連續(xù)充氧, 每天換水一次(約1/3), 投餌分上、下午各一次, 日投餌量為魚體重的4%—6%, 飼料購自奧特飼料有限公司。養(yǎng)殖時間從2013年7月6日至2013年8月31日。分別配制黃顙魚重組生長激素溶液濃度為: 0、1、5和10 mg/L, 每周分別對4組魚苗進行浸泡一次, 每次浸泡45min (保持增氧), 飼養(yǎng)4周, 共浸泡4次后, 對照組和試驗組均不作任何處理, 再續(xù)養(yǎng)4周。

1.4 采樣及測定

在飼養(yǎng)4周和8周后各采樣一次(采樣前魚禁食24h), 每次每箱隨機選取15尾魚, 隨機取5尾魚測量體長、體重以及肝胰臟等內(nèi)臟重量, 5尾魚用于全魚體成分分析, 5尾魚用于分子生物學(xué)分析, 取肝胰臟于凍存管中, 并迅速放入液氮中, –80℃冰箱保存。

全魚粗蛋白測定采用凱氏微量定氮法, 粗脂肪采用索氏抽提法測定; 粗灰分采用燒灼法(550℃), 水分的測定采用105℃恒溫烘干失重法。

1.5 數(shù)據(jù)處理

存活率(Survival rate,, %) =100×成活魚尾數(shù)/投放魚尾數(shù)

增重率(Weight gain rate,, %)=100×(W–0)/0

特定生長率(Special growth rate,,%/d) = 100×(Ln W– Ln0)/

肥滿度(Condition factor,, %)=100×體重/體長3

臟體比(Viscerasomatic index,, %) = 100×內(nèi)臟重/體重

肝體比(Hepaticsomatic index,, %) = 100×肝重/體重

其中,W、0分別為黃顙魚養(yǎng)殖末均重和養(yǎng)殖初均重,為養(yǎng)殖天數(shù)。

數(shù)據(jù)采用SPSS(V20)軟件進行單因素方差分析 (One-way ANOVA), 差異顯著時(0.05)通過Duncan’s方法進行多重比較, 實驗數(shù)據(jù)用“平均值±標準誤(Mean± SE)”表示。

2 結(jié)果

2.1 黃顙魚GH的制備純化

獲得重組質(zhì)粒pET-PfGH轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)后, 涂布在含卡那霉素LB 平板上, 挑取單菌落進行PCR鑒定得到大約424 bp 的片段, 電泳圖譜帶符合預(yù)期結(jié)果。對獲得的陽性重組子進行 DNA 測序, 結(jié)果表明, 黃顙魚GH成熟肽cDNA編碼序列已插入到pET-28a上, 并成功轉(zhuǎn)移到大腸桿菌BL21中, 將它命名為pET-PfGH-BL21。

pET-PfGH-BL21宿主菌在IPTG誘導(dǎo)前無GH融合蛋白表達, 而誘導(dǎo)后可見一明顯的蛋白帶, 分子量約為21 kD。37℃誘導(dǎo)4h后超聲裂解, 目的蛋白主要存在于沉淀部分, 表明誘導(dǎo)表達的重組GH主要以包涵體形式存在于細胞內(nèi)。而17℃誘導(dǎo)的目的蛋白在上清和沉淀中均出現(xiàn), 表明降低溫度可以減少包涵體, 增加可溶性蛋白的產(chǎn)生。

重組生長激素融合多肽采用Ni-瓊脂糖凝膠親和層析。分離純化后的重組GH在SDS-PAGE上表現(xiàn)為單一條帶, 分子量約為21 kD。通過Western Blot檢測, 發(fā)現(xiàn)有陽性條帶出現(xiàn), 其大小與SDS- PAGE中的特異性條帶相符合, 表明在17℃誘導(dǎo)表達全菌液、超聲裂解液上清、沉淀和純化后的蛋白都含有黃顙魚重組GH, 且都具有免疫活性, 經(jīng)蛋白定量試劑盒檢測獲得蛋白濃度為8.02 mg/mL。經(jīng)制備純化后的GH蛋白供后續(xù)實驗使用。

2.2 重組GH處理對幼魚生長性能的影響

用本實驗制備的重組生長激素浸泡處理黃顙魚魚苗, 養(yǎng)殖4周后, 實驗組魚苗的增重率、特定生長率均比對照組高(表1)。從表1可知, 1 mg/L組、5 mg/L組與對照組之間差異顯著(<0.05), 1 mg/L組最高, 其增重率、特定生長率比對照組分別高出29.67%、11.90%, 各組之間存活率則無顯著差異。停用生長激素4周后, 各組的魚種增重率、特定生長率和存活率均無顯著差異(表2)。

2.3 重組GH對幼魚形態(tài)發(fā)育的影響

黃顙魚幼魚通過GH浸泡處理并養(yǎng)殖4周后, 對其形態(tài)性狀進行測定, 獲得了肥滿度、肝體比、臟體比等指標(表3)。由表3可知, 實驗組的肥滿度與對照組相比沒有顯著差異; 與對照組比較, 試驗組的肝體比均出現(xiàn)下降, 10 mg/L組肝體比顯著低于對照組; 各組之間臟體比沒有顯著差異。而在生長激素停用4周后, 所有各組幼魚的肥滿度、肝體比、臟體比均無顯著差異(表4)。

2.4 重組GH對黃顙魚幼魚體成分的影響

不同GH濃度浸泡對黃顙魚幼魚的水分、粗蛋白、粗脂肪和灰分均未產(chǎn)生顯著影響(表5)。停用生長激素后各組之間也無明顯差異(表6)。

表1 不同濃度GH浸泡對黃顙魚幼魚增重率、特定生長率和存活率的影響

注: 表中數(shù)據(jù)為3個重復(fù)的平均值。表中同一列標有不同字母的數(shù)據(jù)表示差異顯著(<0.05); 下同

Note: Data are the means of triplicate. Values with different superscripts have significant differences (<0.05); the same applies bellow

表2 生長激素停用后對黃顙魚幼魚增重率、特定生長率和存活率的影響

表3 不同濃度GH浸泡對黃顙魚幼魚形態(tài)發(fā)育的影響

表4 生長激素停用后對黃顙魚幼魚形態(tài)發(fā)育的影響

表5 不同GH浸泡濃度對黃顙魚幼魚體成分的影響

表6 不同GH浸泡濃度對黃顙魚幼魚體成分的影響

3 討論

利用大腸桿菌表達系統(tǒng)進行功能基因的原核表達具有操作簡單, 成本低, 純化工藝成熟等優(yōu)點[25]。已知黃顙魚cDNA序列的開放閱讀框為603 bp, 編碼長度為200氨基酸的多肽, 其中信號肽為20氨基酸, 成熟肽為180氨基酸。由于魚類GH的信號肽序列不能被大腸桿菌所識別, 因此, 大腸桿菌作為原核表達宿主菌, 在合成基因時應(yīng)去除編碼GH成熟肽以外的信號肽序列。本研究采用原核融合表達載體pET-28a, 其在外源蛋白兩翼各融合表達1個6×His的標簽, 可用于目的蛋白的純化與鑒定[26], 融合多肽理論估計分子量為21.27 kD, 與SDS-PAGE電泳結(jié)果相當。經(jīng)大腸桿菌表達的魚類GH往往形成包涵體, 通常要進行比較復(fù)雜的變性復(fù)性處理, 結(jié)果可能使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變, 活性及產(chǎn)量降低。通過摸索誘導(dǎo)溫度, 發(fā)現(xiàn)37℃誘導(dǎo)出來的黃顙魚重組蛋白主要是以不溶性的包涵體出現(xiàn)在超聲裂解后的沉淀中, 而17℃誘導(dǎo)的重組蛋白很大部分出現(xiàn)在菌體破碎液上清層, 為可溶性蛋白。利用Ni-瓊脂糖凝膠親和層析、咪唑梯度洗脫、電泳, 獲得了高純度帶His標簽的重組蛋白, 并最終制備了具有生物活性的重組黃顙魚GH。通過浸泡, 外源生長激素可由魚類的口腔、鰓、腸道、皮膚等途徑進入血液, 血漿中的生長激素與肝細胞和腸道的受體結(jié)合以后才能發(fā)揮促生長生理效應(yīng)[27—29]。本研究中黃顙魚幼魚1 mg/L組的增重率優(yōu)于5 mg/L組和10 mg/L組, 1 mg/L外源生長激素的浸泡效果最好, 該組的增重率和特定生長率均最高, 說明外源生長激素用量不是越多越好, 這是因為生長激素的受體數(shù)量受限制, 若使用過量的外源生長激素會造成部分激素沒有受體可結(jié)合, 反而會反饋性地促進下丘腦分泌生長激素抑制因子, 從而抑制垂體合成釋放生長激素。高劑量的外源生長激素引起的負反應(yīng), 從而降低了它可以替補內(nèi)源生長激素不足進而促進魚體生長的作用。Kayes[30]也曾報道過這種現(xiàn)象和負反應(yīng)。只有外源生長激素使用適當, 才能取得較好的促生長效果。張慶[18]對草魚、施兆鴻和周一紅[8]對黑鯛稚魚、Agellon等[19]對虹鱒的研究也有相似的報道。因此, 在生產(chǎn)實踐中黃顙魚外源生長激素浸泡用量為1 mg/L較合適。由于通過原核表達獲得大量生長激素的成本高, 而真核表達系統(tǒng)較之大腸桿菌表達系統(tǒng), 具有表達量高, 外源基因不易丟失、安全性好的優(yōu)點, 因此, 在實際生產(chǎn)中, 可以采用真核表達方式進行大規(guī)模生產(chǎn)生長激素, 使生產(chǎn)成本進一步降低。

有關(guān)黃顙魚幼魚體成分的變化, 結(jié)果表明實驗組與對照組的水分、粗蛋白、粗脂肪、灰分等物質(zhì)均無明顯差異, 說明浸泡外源生長激素對黃顙魚粗蛋白、粗脂肪等物質(zhì)含量沒有影響, Wilson[31]也報道過外源生長激素能促進生長主要表現(xiàn)在刺激脂肪細胞的生長。從本實驗黃顙魚的肥滿度變化結(jié)果來看, 外源生長激素對體重和體長的影響同樣明顯, 體長的增長即是骨組織生長, 而體重增加是否包含脂肪成分的變化需要進一步的研究。

[1] Mclean E, Donaldson E M. Absorption of bioactive proteins by the gastrointestinal tract of fish: A review [J]., 1990, 2(1): 1—11

[2] Lebail P Y, Sire M F, Vernier J M. Intestinal transfer of growth hormone into the circulatory system of the rainbow trout: interference by granule cells [J]., 1989, 251(1): 101—107

[3] Moriyama S, Yamamoto H, Sugimoto S,. Oral administration of recombinant salmon growth hormone to rainbow trout () [J]., 1993, 112(1): 99—106

[4] Lin T. Study on cloning, prokaryotic expression and biological activity of growth hormone gene of[D]. Thesis for Master of Science. Sichuan Agricultural University, Ya’an. 2008 [林濤. 齊口裂腹魚生長激素基因的克隆、原核表達及生物活性初步研究. 碩士學(xué)位論文. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué), 雅安. 2008]

[5] Ma X L, Zhang Y, Zhou L B,. Effects of LHRH-A on the growth and expressions of the growth axis in Nile tilapia[J]., 2013, 40(1): 42—47 [馬細蘭, 張勇, 周立斌, 等. LHRH-A 對尼羅羅非魚生長及生長軸相關(guān)基因表達的影響. 水生生物學(xué)報, 2013, 40(1): 42—47]

[6] Jiang S G, Zhang D C, Su T F,. Molecular cloning of growth hormone (GH) cDNA from mud carp and the growth-promoting effects of the recombinant mcGH [J]., 2004, 14(6): 23—27 [江世貴, 張殿昌, 蘇天鳳, 等. 鯪生長激素cDNA的克隆及其重組表達產(chǎn)物的促生長活性. 高技術(shù)通訊, 2004, 14(6): 23—27]

[7] Xu B. The growth-promoting effects of the recombinant eel growth hormone, methyl testosterone and thyroxine to pagrosomus major [C]. Shanghai: Tongji University Press. 1995, 372—385 [徐斌. 重組鰻魚生長激素,甲基睪酮和甲狀腺素對真鯛促生長作用的研究. 上海: 同濟大學(xué)出版社. 1995, 372—385]

[8] Shi Z H, Zhou Y H. The effect of fish growth hormone on growth of black porgy,(Bleeker) larva [J]., 1996, 11(11): 13—16 [施兆鴻, 周一紅. 魚生長素對黑鯛稚魚生長的影響. 現(xiàn)代漁業(yè)信息, 1996, 11(11): 13—16]

[9] Chen R Z, Shuang B, Zhang R,. Recombinant fish growth hormone ofas a feedstuff supplement [J]., 2003, 22(2): 180—186 [陳榮忠, 雙寶, 張銳, 等. 重組鱸魚生長激素酵母飼料添加劑及對網(wǎng)箱喂養(yǎng)海水魚的促長效應(yīng). 臺灣海峽, 2003, 22(2): 180—186]

[10] Jian Q, Bai J J, Ma J,. Research of enhancement of Tilapia growth by adding recombinant fGH in forage [J]., 1999, 29(3): 3—5 [簡清, 白俊杰, 馬進, 等. 飼料中添加重組魚生長激素對羅非魚魚種的促生長作用研究. 淡水漁業(yè), 1999, 29(3): 3—5]

[11] Donaldson E M, Fagerlund U H M, Higgs D A,. Hormonal Enhancement of Growth [M]. Fish Physiology. New York: Academic Press. 1979, 455—597

[12] Mclean E, Donaldson E M. The endocrinology of growth, development and metabolism in vertebrates [C]. SanDiego: Academic Press. 1993, 43—71

[13] Kawauchi H, Moriyama S, Yasuda A,. Isolation and characterization of chum salmon growth hormone [J]., 1986, 244(2): 542–552

[14] Acosta J, Morales R, Morales A,.expressing recombinant tilapia growth hormone accelerates the growth of tilapia [J]., 2007, 29(11): 1671—1676

[15] Li Y H, Bai J J, Jian Q,. Expression of common carp growth hormone in the yeastand growth stimulation of juvenile tilapia () [J]., 2003, 216(1—4): 329—341

[16] Jeh H S, Kim C H, Lee H K,. Recombinant flounder growth hormone from: overexpression, efficient recovery, and growth-promoting effect on juvenile flounder by oral administration [J]., 1998, 60(3): 183—193

[17] Tsai H J, Lin K L, Kuo J C,. Highly efficient expression of fish growth hormone by Escherichia coli cells [J]., 1995, 61(11): 4116—4119

[18] Zhang Q. Effects of recombinant-tuna growth hormone (R-TGH) on growth of Grass carp fingerling [J]., 1993, 17(3): 230—234 [張慶. 基因重組金槍魚生長激素對草魚魚種生長的促進作用. 水產(chǎn)學(xué)報, 1993, 17(3): 230—234]

[19] Agellon L B, Emery C J, Jones J M,. Promotion of rapid growth of rainbow trout () by a recombinant fish growth hormone [J]., 1988, 45: 146—15l

[20] Bai Y Q, Wang X, Liu D F,. The preferable light intensity and color for darkbarbel catfish and silver carp [J]., 2014, 38(2): 216—221 [白艷勤, 王雪, 劉德富, 等. 瓦氏黃顙魚和鰱對光照強度和顏色的選擇. 水生生物學(xué)報, 2014, 38(2): 216—221]

[21] Zhen H H, Zhu X M, Han D,Effects of dietary lipid level on growth and lipoprotein lipase gene expression in[J]., 2010, 34(4): 815—821 [鄭珂珂, 朱曉鳴, 韓冬, 等. 飼料脂肪水平對瓦氏黃顙魚生長及脂蛋白脂酶基因表達的影響. 水生生物學(xué)報, 2010, 34(4): 815—821]

[22] Dan C, Wang D, Gui J F. Chromosomal localization of sex-linked markerin yellow catfish [J]., 2014, 38(1): 184—186 [丹成, 王達, 桂建芳. 黃顙魚性別連鎖標記的染色體定位. 水生生物學(xué)報, 2014, 38(1): 184—186]

[23] Zhang Z H. The biological characteristics ofand its breeding and breeding technology [J]., 2000, (4): 21—23 [張志華. 黃顙魚的生物學(xué)及繁殖和養(yǎng)殖技術(shù). 漁業(yè)經(jīng)濟研究, 2000, (4): 21—23]

[24] Sun Y H, Xie C X.growth hormone cDNA sequence cloning and sequence analysis [J]., 2006, 26(3): 10—13 [孫玉華, 謝從新. 黃顙魚生長激素cDNA序列克隆及其序列分析. 水利漁業(yè), 2006, 26(3): 10—13]

[25] Chen L. Analysis of the gene ofgrowth hormone and its expression in the[D]. Thesis for Master of Science. Fuzhou University, Fuzhou. 2004 [陳莉. 大黃魚生長激素基因的分析及其在大腸桿菌中的表達. 碩士學(xué)位論文. 福州大學(xué), 福州. 2004]

[26] Ribas A V, Ho P L, Tanizaki M M,. High-level expression of tetanus toxin fragment C-thioredoxin fusion protein in[J]., 2000, 31(2): 91—94

[27] Collie N L, Stevens J J. Hormonal effects on L-proline transport in[J]., 1985, 59(3): 399—409

[28] Sun L Z, Farmanfarmamian A. Biphasic action of growth hormone on intestinal amino acid absorption in striped bass bybrids [J]., 1992, 103(2): 381—390

[29] Fine M, Sakal E, Vashdi D,. Recombinant carp () growth hormone: expression, purification, and deter-mination of biological activity in vitro and[J]., 1993, 89(1): 51—61

[30] Kayes T. Effects of hypophysectomy, beef growth hormone replacement therapy, pituitary autotransplantation, and environmental salinity on growth in the black bullhead () [J]., 1977, (33): 371—381

[31] Wilson R P. Effect of recombinant bovine growth hormone administration on growth and body composition of channel catfish [J]., 1988, 73(1—4): 229—236

THE PREPARATION OF RECOMBINANT GROWTH HORMONE AND ITS EFFECTS ON THE GROWTH OF JUVENILE IN

JIANG Li-Juan1, LIU Wen-Sheng1, LIN Qi-Peng2, RAO Fei-Xiang1, YANG Hui-Nuan1, WANG Juan1, WANG Tao1and FU Jing-Jing1

(1. College of Animal Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China; 2. Public Basic Course and Experimental Teaching Center, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

In this study, the mature peptide-encoding cDNA sequence of the growth hormone of(PfGH) was inserted into the prokaryote expression vector pET-28a (+). The recombinant plasmid of pET-PfGH was then transfected intoBL21 (DE3) and was induced by IPTG. The SDS-PAGE results showed thatBL21 (DE3) with pET-PfGH expressed a specific fusion protein with a molecular weight of 21 KD. The western blot test revealed that the protein contained a 6-His tag. PfGH was abundantly expressed incultured at 17℃ for 14 hours with the final IPTG concentration of 1.0 mmol/L. After ultrasonic disruption the soluble recombinant protein was reco-vered and purified, and was then applied to juvenile. The subjects with the average weight of (0.85±0.01) g were randomly divided into four groups and were raised in an indoor aquarium. Every group had three repeats with 35 fish in each. The experiments were conducted in the interior circulation water purification system. During the 4-week feeding trial, four groups were soaked in liquid containing the recombinant GH at different concentrations of 0 (the control), 1 (group 1), 5 (group 2) and 10 mg/L (group 3) respectively, and the soaking frequency was once a week. At the end of the trial, our results showed that compared to the control group, the weight gain rate () and the specific growth rate () of group 1 increased by 29.67% (<0.05) and 11.90% (<0.05) respectively; theandof group 2 increased by 21.32% (<0.05) and 8.83% (<0.05) respectively. However, the body composition was not significantly different between the four groups. Furthermore, no significant difference was detected in the growth performance and the body composition between the four groups in 4 weeks after the cease of growth hormone treatment.

; Growth hormone; Prokaryotic expression; Immersion; Weight gain rate

10.7541/2015.36

S961.6

A

1000-3207(2015)02-0275-06

2014-05-09;

2014-09-15

廣東省海洋漁業(yè)科技推廣專項(A201101G02, A201301F03); 廣州市農(nóng)業(yè)科技項目(2011)資助

姜麗娟(1986—), 湖北黃石人; 碩士研究生; 研究方向水生生物學(xué)。E-mail: 364613168@qq.com

劉文生(1965—), 教授, 博士; E-mail: wsliu@scau.edu.cn