賈康杰 ，馬昆鵬，高麗華，邵勇，方均建，董芳霆，胡顯文

1.山西康寶生物制品股份有限公司，山西 長(zhǎng)治 046000；2.國(guó)家生物醫(yī)學(xué)分析中心，北京 100850；3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100071

雪蓮屬菊科鳳毛菊屬草本植物，主要分布于我國(guó)青藏高原及其毗鄰地區(qū)，屬于藏藥中的名貴藥材，八世紀(jì)藏族古代藥物文獻(xiàn)《月王藥診》中記載其具有散寒除濕、活血通絡(luò)、抗癌、抗炎及抗疲勞等功效，可治療婦女月經(jīng)不調(diào)、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、癰瘡腫毒和高山不適應(yīng)等多種疾病[1]。然而，由于野生雪蓮獨(dú)特的生長(zhǎng)環(huán)境，人工栽培困難，加之近年采挖過(guò)度，導(dǎo)致該物種瀕臨滅絕。為解決珍稀瀕危藥用植物的資源問(wèn)題，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所胡顯文課題組經(jīng)過(guò)多年探索，獲得了穩(wěn)定高產(chǎn)黃酮的水母雪蓮細(xì)胞系，并建立了大規(guī)模植物細(xì)胞培養(yǎng)方法[2-3]，目前該項(xiàng)目已成功進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。我們采用高效液相色譜（HPLC）研究了10 個(gè)批次的雪蓮培養(yǎng)物的指紋圖譜，并利用相對(duì)保留值和相對(duì)面積研究雪蓮培養(yǎng)物樣品之間的異同，為雪蓮培養(yǎng)物的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

11 批雪蓮培養(yǎng)物均由山西康寶生物制品股份有限公司提供；刺五加苷B（紫丁香苷）對(duì)照品（國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)信息中心，批號(hào)：20110824）；綠原酸對(duì)照品（國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)信息中心，批號(hào)：20120314）；乙腈、三氟乙酸（色譜純，美國(guó)Fisher 公司）；其余試劑均為分析純。

HP1100高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司），包括HP Degasser（在線脫氣機(jī)）、HP QUAT PUMP（四元梯度泵）、HP ALS（自動(dòng)進(jìn)樣器）、HP COLCOMP（柱溫箱）、HP DAD（二極管陣列檢測(cè)器）。

1.2 色譜條件

色譜柱為CAPCELL PAK C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相A 為0.1% TFA/水，流動(dòng)相B 為0.1% TFA/乙腈，梯度洗脫，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm，柱溫40℃，進(jìn)樣量20 μL。理論塔板數(shù)以紫丁香苷峰計(jì)，應(yīng)不低于2500。紫丁香苷、綠原酸色譜峰的分離度應(yīng)大于1.5。洗脫條件：0～1 min，0～0B%；1～16 min，0～10B%；16～41 min，10～25B%；41～56 min，25～60B%；56～65 min，60～100B%。

1.3 對(duì)照品溶液的制備

分別取紫丁香苷、綠原酸對(duì)照品適量，精密稱定，加水溶解并稀釋至20 μg/mL 的對(duì)照溶液，搖勻，備用。

1.4 供試品溶液的制備

取本品0.2 g，精密稱定，置于10 mL 容量瓶中，加水約8 mL 超聲波處理30 min，降至室溫，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，備用。

1.5 測(cè)定法及數(shù)據(jù)處理

分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各20 μL 注入液相色譜儀，記錄60 min 的色譜圖。數(shù)據(jù)處理采用中國(guó)藥典委員會(huì)推薦的“中藥指紋圖譜計(jì)算機(jī)輔助相似度評(píng)價(jià)軟件”（版本2004A），將10個(gè)批次的色譜圖進(jìn)行比較，得到可全面反映多個(gè)色譜圖特征的雪蓮培養(yǎng)物的對(duì)照指紋圖譜，計(jì)算每個(gè)色譜圖與之相比較的相似度。

2 結(jié)果

2.1 供試品提取條件

2.1.1 提取溶劑 稱取雪蓮培養(yǎng)物（批號(hào)20111121）樣品5 份，每份0.2 g，分別置于10 mL 玻璃離心管中，分別加入100%甲醇、75%甲醇、50%甲醇、25%甲醇、水各8 mL，超聲波提取20 min 后濾過(guò)，取濾液置于10 mL容量瓶中，加入各溶劑至刻度，分別取上述溶液各20 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖。根據(jù)液相色譜圖顯示，水作為提取溶劑的色譜峰比例適中，信息豐富，所以選擇純水作為提取溶劑。

2.1.2 提取方式 稱取雪蓮培養(yǎng)物（批號(hào)20111121）樣品3 份，每份0.2 g，分別置于10 mL 玻璃離心管中，加入水8 mL，分別采用室溫浸提24 h、加熱回流1 h、超聲提取30 min等3種方式提取后，濾過(guò)，取濾液置于10 mL容量瓶中，加入水至刻度，分別取上述溶液各20 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖。比較各色譜圖，結(jié)果顯示超聲波提取效果最好，方法簡(jiǎn)單，重現(xiàn)性好，色譜峰較多。

2.1.3 提取時(shí)間 稱取雪蓮培養(yǎng)物（批號(hào)20111121）樣品2 份，每份0.2 g，分別置于10 mL 玻璃離心管中，分別加入水8 mL，分別采用超聲波提取30 和60 min 后，濾過(guò)，取濾液置于10 mL 容量瓶中，加入水至刻度，分別取上述溶液各20 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖。比較各色譜圖，結(jié)果顯示提取30 min 和60 min 的色譜峰數(shù)量和強(qiáng)度差別不明顯，所以選擇提取時(shí)間為30 min。

2.2 色譜條件

2.2.1 檢測(cè)波長(zhǎng) 參照文獻(xiàn)[5]，比較了檢測(cè)波長(zhǎng)分別為220、260、280、320、360 nm 時(shí)的檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)提取液在220 nm波長(zhǎng)有較好的色譜信息，但基線噪音較高，不利于分析。提取液在260 nm波長(zhǎng)下各色譜峰均有較好的紫外吸收，色譜信息豐富、適中，特征峰之間分離良好，因此選擇260 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2.2 流動(dòng)相 分別采用0.1%甲酸/水-0.1%甲酸/乙腈、0.1%乙酸/水-0.1%乙酸/乙腈、0.1%磷酸/水-0.1%磷酸/乙腈、0.1% TFA/水-0.1% TFA/乙腈等流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，記錄色譜圖。根據(jù)圖譜對(duì)比，發(fā)現(xiàn)以0.1% TFA/水-0.1% TFA/乙腈為流動(dòng)相時(shí)，在線性梯度下各組分得到較好的分離。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取同一批雪蓮培養(yǎng)物樣品（批號(hào)20111121）制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，以紫丁香苷的保留時(shí)間和峰面積為對(duì)照，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和峰面積，結(jié)果相對(duì)保留時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于3%，占總峰面積百分比5%以上的共有峰的相對(duì)峰面積RSD均小于3%，表明儀器的精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一批雪蓮培養(yǎng)物樣品（批號(hào)20111121）5 份制備供試品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定。以紫丁香苷的保留時(shí)間和峰面積為對(duì)照，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于3%，占總峰面積百分比5%以上的共有峰的相對(duì)峰面積RSD均小于3%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批雪蓮培養(yǎng)物樣品（批號(hào)20111121）制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、10 h 進(jìn)樣測(cè)定。以紫丁香苷的保留時(shí)間和峰面積為對(duì)照，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和峰面積比值，結(jié)果相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于3%，占總峰面積百分比5%以上的共有峰的峰面積比值RSD均小于5%，結(jié)果表明樣品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 雪蓮培養(yǎng)物HPLC指紋圖譜的建立

采用相對(duì)保留時(shí)間標(biāo)定共有指紋峰，記錄60 min 的色譜圖，以圖譜中紫丁香苷為參照物，各指紋峰保留時(shí)間與同一圖譜中參照物峰的保留時(shí)間的比值為各指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間，計(jì)算10 批雪蓮培養(yǎng)物指紋圖譜中各指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間，以此確定共有指紋峰，各共有指紋峰的平均相對(duì)保留時(shí)間見(jiàn)表1，共標(biāo)定出雪蓮培養(yǎng)物的共有指紋峰9個(gè)。具有代表性的圖譜見(jiàn)圖1。采集對(duì)照品紫丁香苷和綠原酸的UV 光譜圖及水母雪蓮培養(yǎng)物7 號(hào)和8 號(hào)峰的UV 光譜圖進(jìn)行比較，確定其中7 號(hào)峰為紫丁香苷，8號(hào)峰為綠原酸（圖2）。分別統(tǒng)計(jì)10批各共有峰面積與基準(zhǔn)峰面積的比值，結(jié)果各共有峰的面積比值相對(duì)固定，單峰面積占總峰面積大于或等于10%，而小于20%的共有峰有4 個(gè)，分別為1、4、5、9 號(hào)，其差值小于±25%；單峰面積占總峰面積≥20%的共有峰有1個(gè)，為7 號(hào)峰，即紫丁香苷色譜峰。單峰面積占總峰面積＜10%的共有峰，不作要求。10批共有指紋峰面積的比值均符合中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求（暫行）[4]。10 批雪蓮培養(yǎng)物指紋圖譜共有峰的峰面積比值結(jié)果見(jiàn)表2。

圖1 雪蓮培養(yǎng)物和對(duì)照品的HPLC圖

2.5 樣品相似度評(píng)價(jià)

按照建立的HPLC 方法，分別測(cè)定了10 批雪蓮培養(yǎng)物的指紋圖譜，利用“中藥指紋圖譜計(jì)算機(jī)輔助相似度評(píng)價(jià)軟件”（版本2004A）對(duì)10 批樣品圖譜進(jìn)行處理（圖3），并進(jìn)行共有譜峰擬合和相似度評(píng)價(jià)，以?shī)A角余弦法（全圖譜）計(jì)算的相似度評(píng)價(jià)結(jié)果為判斷標(biāo)準(zhǔn)，10 批樣品的相似度均大于0.9，相似度良好。表明樣品的化學(xué)組成和含量基本一致，質(zhì)量穩(wěn)定。結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

色譜指紋圖譜作為一種綜合的、可量化的質(zhì)量控制方法，可對(duì)中藥產(chǎn)品的真實(shí)性、質(zhì)量的一致性及穩(wěn)定性進(jìn)行有效檢測(cè)和控制[6]，也可作為植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)珍稀瀕危野生中藥材的有效質(zhì)量控制方法。

圖2 雪蓮培養(yǎng)物和對(duì)照品的UV圖

圖3 10批雪蓮培養(yǎng)物樣品指紋圖譜

表1 10批雪蓮培養(yǎng)物指紋圖譜共有峰的相對(duì)保留時(shí)間

表2 10批雪蓮培養(yǎng)物指紋圖譜共有峰的峰面積比值

表3 10批雪蓮培養(yǎng)物相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

我們采用HPLC 法對(duì)雪蓮培養(yǎng)物的特征成分進(jìn)行了分析，考察了儀器的精密度，方法的重復(fù)性、精密度和樣品的穩(wěn)定性，同時(shí)對(duì)10 批雪蓮培養(yǎng)物進(jìn)行了指紋圖譜檢測(cè)。結(jié)果表明，本研究建立的雪蓮培養(yǎng)物HPLC 指紋圖譜檢測(cè)方法穩(wěn)定、可靠、專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好，采用相似度評(píng)價(jià)軟件對(duì)指紋圖譜結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)，操作簡(jiǎn)便，不需大量復(fù)雜的計(jì)算，且數(shù)據(jù)的采集和處理更為全面和客觀，可用于雪蓮培養(yǎng)物產(chǎn)品的質(zhì)量控制。

[1]楊永昌.藏藥志[M].西寧:青海人民出版社,1992.

[2]胡顯文,高麗華,趙德修,等.用于大規(guī)模植物細(xì)胞培養(yǎng)的穩(wěn)定高產(chǎn)黃酮的雪蓮細(xì)胞系及其建立方法[P].中國(guó)專利,CN1424395,2003-06-18.

[3]胡顯文,高麗華,李佐虎,等.穩(wěn)定高產(chǎn)黃酮的雪蓮細(xì)胞系TUIP-8 的大規(guī)模高密度培養(yǎng)方法[P].中國(guó)專利,CN1556199,2004-12-22.

[4]國(guó)家藥品監(jiān)督管理局.中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求（暫行）[S].北京:國(guó)家藥品監(jiān)督管理局,2000.

[5]苗愛(ài)東,孫殿甲,彭燕,等.HPLC 法建立新疆雪蓮指紋圖譜研究[J].中成藥,2003,(9):3-5.

[6]謝培山.色譜指紋圖譜分析是中草藥質(zhì)量控制的可行策略[J].中藥新藥與臨床藥理,2001,(5):141-151.