賈康杰 ,馬昆鵬,高麗華,邵勇,方均建,董芳霆,胡顯文
1.山西康寶生物制品股份有限公司,山西 長(zhǎng)治 046000;2.國(guó)家生物醫(yī)學(xué)分析中心,北京 100850;3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所,北京 100071
雪蓮屬菊科鳳毛菊屬草本植物,主要分布于我國(guó)青藏高原及其毗鄰地區(qū),屬于藏藥中的名貴藥材,八世紀(jì)藏族古代藥物文獻(xiàn)《月王藥診》中記載其具有散寒除濕、活血通絡(luò)、抗癌、抗炎及抗疲勞等功效,可治療婦女月經(jīng)不調(diào)、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、癰瘡腫毒和高山不適應(yīng)等多種疾病[1]。然而,由于野生雪蓮獨(dú)特的生長(zhǎng)環(huán)境,人工栽培困難,加之近年采挖過(guò)度,導(dǎo)致該物種瀕臨滅絕。為解決珍稀瀕危藥用植物的資源問(wèn)題,軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所胡顯文課題組經(jīng)過(guò)多年探索,獲得了穩(wěn)定高產(chǎn)黃酮的水母雪蓮細(xì)胞系,并建立了大規(guī)模植物細(xì)胞培養(yǎng)方法[2-3],目前該項(xiàng)目已成功進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。我們采用高效液相色譜(HPLC)研究了10 個(gè)批次的雪蓮培養(yǎng)物的指紋圖譜,并利用相對(duì)保留值和相對(duì)面積研究雪蓮培養(yǎng)物樣品之間的異同,為雪蓮培養(yǎng)物的質(zhì)量控制提供依據(jù)。
11 批雪蓮培養(yǎng)物均由山西康寶生物制品股份有限公司提供;刺五加苷B(紫丁香苷)對(duì)照品(國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)信息中心,批號(hào):20110824);綠原酸對(duì)照品(國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)信息中心,批號(hào):20120314);乙腈、三氟乙酸(色譜純,美國(guó)Fisher 公司);其余試劑均為分析純。
HP1100高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司),包括HP Degasser(在線脫氣機(jī))、HP QUAT PUMP(四元梯度泵)、HP ALS(自動(dòng)進(jìn)樣器)、HP COLCOMP(柱溫箱)、HP DAD(二極管陣列檢測(cè)器)。
色譜柱為CAPCELL PAK C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動(dòng)相A 為0.1% TFA/水,流動(dòng)相B 為0.1% TFA/乙腈,梯度洗脫,流速1 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm,柱溫40℃,進(jìn)樣量20 μL。理論塔板數(shù)以紫丁香苷峰計(jì),應(yīng)不低于2500。紫丁香苷、綠原酸色譜峰的分離度應(yīng)大于1.5。洗脫條件:0~1 min,0~0B%;1~16 min,0~10B%;16~41 min,10~25B%;41~56 min,25~60B%;56~65 min,60~100B%。
分別取紫丁香苷、綠原酸對(duì)照品適量,精密稱定,加水溶解并稀釋至20 μg/mL 的對(duì)照溶液,搖勻,備用。
取本品0.2 g,精密稱定,置于10 mL 容量瓶中,加水約8 mL 超聲波處理30 min,降至室溫,加水稀釋至刻度,搖勻,濾過(guò),備用。
分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各20 μL 注入液相色譜儀,記錄60 min 的色譜圖。數(shù)據(jù)處理采用中國(guó)藥典委員會(huì)推薦的“中藥指紋圖譜計(jì)算機(jī)輔助相似度評(píng)價(jià)軟件”(版本2004A),將10個(gè)批次的色譜圖進(jìn)行比較,得到可全面反映多個(gè)色譜圖特征的雪蓮培養(yǎng)物的對(duì)照指紋圖譜,計(jì)算每個(gè)色譜圖與之相比較的相似度。
2.1.1 提取溶劑 稱取雪蓮培養(yǎng)物(批號(hào)20111121)樣品5 份,每份0.2 g,分別置于10 mL 玻璃離心管中,分別加入100%甲醇、75%甲醇、50%甲醇、25%甲醇、水各8 mL,超聲波提取20 min 后濾過(guò),取濾液置于10 mL容量瓶中,加入各溶劑至刻度,分別取上述溶液各20 μL 注入液相色譜儀,記錄色譜圖。根據(jù)液相色譜圖顯示,水作為提取溶劑的色譜峰比例適中,信息豐富,所以選擇純水作為提取溶劑。
2.1.2 提取方式 稱取雪蓮培養(yǎng)物(批號(hào)20111121)樣品3 份,每份0.2 g,分別置于10 mL 玻璃離心管中,加入水8 mL,分別采用室溫浸提24 h、加熱回流1 h、超聲提取30 min等3種方式提取后,濾過(guò),取濾液置于10 mL容量瓶中,加入水至刻度,分別取上述溶液各20 μL 注入液相色譜儀,記錄色譜圖。比較各色譜圖,結(jié)果顯示超聲波提取效果最好,方法簡(jiǎn)單,重現(xiàn)性好,色譜峰較多。
2.1.3 提取時(shí)間 稱取雪蓮培養(yǎng)物(批號(hào)20111121)樣品2 份,每份0.2 g,分別置于10 mL 玻璃離心管中,分別加入水8 mL,分別采用超聲波提取30 和60 min 后,濾過(guò),取濾液置于10 mL 容量瓶中,加入水至刻度,分別取上述溶液各20 μL 注入液相色譜儀,記錄色譜圖。比較各色譜圖,結(jié)果顯示提取30 min 和60 min 的色譜峰數(shù)量和強(qiáng)度差別不明顯,所以選擇提取時(shí)間為30 min。
2.2.1 檢測(cè)波長(zhǎng) 參照文獻(xiàn)[5],比較了檢測(cè)波長(zhǎng)分別為220、260、280、320、360 nm 時(shí)的檢測(cè)結(jié)果,發(fā)現(xiàn)提取液在220 nm波長(zhǎng)有較好的色譜信息,但基線噪音較高,不利于分析。提取液在260 nm波長(zhǎng)下各色譜峰均有較好的紫外吸收,色譜信息豐富、適中,特征峰之間分離良好,因此選擇260 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。
2.2.2 流動(dòng)相 分別采用0.1%甲酸/水-0.1%甲酸/乙腈、0.1%乙酸/水-0.1%乙酸/乙腈、0.1%磷酸/水-0.1%磷酸/乙腈、0.1% TFA/水-0.1% TFA/乙腈等流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫,記錄色譜圖。根據(jù)圖譜對(duì)比,發(fā)現(xiàn)以0.1% TFA/水-0.1% TFA/乙腈為流動(dòng)相時(shí),在線性梯度下各組分得到較好的分離。
2.3.1 精密度試驗(yàn) 取同一批雪蓮培養(yǎng)物樣品(批號(hào)20111121)制備供試品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6 次,以紫丁香苷的保留時(shí)間和峰面積為對(duì)照,計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和峰面積,結(jié)果相對(duì)保留時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于3%,占總峰面積百分比5%以上的共有峰的相對(duì)峰面積RSD均小于3%,表明儀器的精密度良好。
2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一批雪蓮培養(yǎng)物樣品(批號(hào)20111121)5 份制備供試品溶液,分別進(jìn)樣測(cè)定。以紫丁香苷的保留時(shí)間和峰面積為對(duì)照,計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積,結(jié)果相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于3%,占總峰面積百分比5%以上的共有峰的相對(duì)峰面積RSD均小于3%,表明本方法重復(fù)性良好。
2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批雪蓮培養(yǎng)物樣品(批號(hào)20111121)制備供試品溶液,分別于0、2、4、6、10 h 進(jìn)樣測(cè)定。以紫丁香苷的保留時(shí)間和峰面積為對(duì)照,計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和峰面積比值,結(jié)果相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于3%,占總峰面積百分比5%以上的共有峰的峰面積比值RSD均小于5%,結(jié)果表明樣品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。
采用相對(duì)保留時(shí)間標(biāo)定共有指紋峰,記錄60 min 的色譜圖,以圖譜中紫丁香苷為參照物,各指紋峰保留時(shí)間與同一圖譜中參照物峰的保留時(shí)間的比值為各指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間,計(jì)算10 批雪蓮培養(yǎng)物指紋圖譜中各指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間,以此確定共有指紋峰,各共有指紋峰的平均相對(duì)保留時(shí)間見(jiàn)表1,共標(biāo)定出雪蓮培養(yǎng)物的共有指紋峰9個(gè)。具有代表性的圖譜見(jiàn)圖1。采集對(duì)照品紫丁香苷和綠原酸的UV 光譜圖及水母雪蓮培養(yǎng)物7 號(hào)和8 號(hào)峰的UV 光譜圖進(jìn)行比較,確定其中7 號(hào)峰為紫丁香苷,8號(hào)峰為綠原酸(圖2)。分別統(tǒng)計(jì)10批各共有峰面積與基準(zhǔn)峰面積的比值,結(jié)果各共有峰的面積比值相對(duì)固定,單峰面積占總峰面積大于或等于10%,而小于20%的共有峰有4 個(gè),分別為1、4、5、9 號(hào),其差值小于±25%;單峰面積占總峰面積≥20%的共有峰有1個(gè),為7 號(hào)峰,即紫丁香苷色譜峰。單峰面積占總峰面積<10%的共有峰,不作要求。10批共有指紋峰面積的比值均符合中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)[4]。10 批雪蓮培養(yǎng)物指紋圖譜共有峰的峰面積比值結(jié)果見(jiàn)表2。
圖1 雪蓮培養(yǎng)物和對(duì)照品的HPLC圖
按照建立的HPLC 方法,分別測(cè)定了10 批雪蓮培養(yǎng)物的指紋圖譜,利用“中藥指紋圖譜計(jì)算機(jī)輔助相似度評(píng)價(jià)軟件”(版本2004A)對(duì)10 批樣品圖譜進(jìn)行處理(圖3),并進(jìn)行共有譜峰擬合和相似度評(píng)價(jià),以?shī)A角余弦法(全圖譜)計(jì)算的相似度評(píng)價(jià)結(jié)果為判斷標(biāo)準(zhǔn),10 批樣品的相似度均大于0.9,相似度良好。表明樣品的化學(xué)組成和含量基本一致,質(zhì)量穩(wěn)定。結(jié)果見(jiàn)表3。
色譜指紋圖譜作為一種綜合的、可量化的質(zhì)量控制方法,可對(duì)中藥產(chǎn)品的真實(shí)性、質(zhì)量的一致性及穩(wěn)定性進(jìn)行有效檢測(cè)和控制[6],也可作為植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)珍稀瀕危野生中藥材的有效質(zhì)量控制方法。
圖2 雪蓮培養(yǎng)物和對(duì)照品的UV圖
圖3 10批雪蓮培養(yǎng)物樣品指紋圖譜
表1 10批雪蓮培養(yǎng)物指紋圖譜共有峰的相對(duì)保留時(shí)間
表2 10批雪蓮培養(yǎng)物指紋圖譜共有峰的峰面積比值
表3 10批雪蓮培養(yǎng)物相似度評(píng)價(jià)結(jié)果
我們采用HPLC 法對(duì)雪蓮培養(yǎng)物的特征成分進(jìn)行了分析,考察了儀器的精密度,方法的重復(fù)性、精密度和樣品的穩(wěn)定性,同時(shí)對(duì)10 批雪蓮培養(yǎng)物進(jìn)行了指紋圖譜檢測(cè)。結(jié)果表明,本研究建立的雪蓮培養(yǎng)物HPLC 指紋圖譜檢測(cè)方法穩(wěn)定、可靠、專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好,采用相似度評(píng)價(jià)軟件對(duì)指紋圖譜結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià),操作簡(jiǎn)便,不需大量復(fù)雜的計(jì)算,且數(shù)據(jù)的采集和處理更為全面和客觀,可用于雪蓮培養(yǎng)物產(chǎn)品的質(zhì)量控制。
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[3]胡顯文,高麗華,李佐虎,等.穩(wěn)定高產(chǎn)黃酮的雪蓮細(xì)胞系TUIP-8 的大規(guī)模高密度培養(yǎng)方法[P].中國(guó)專利,CN1556199,2004-12-22.
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