蔣紓芳 ，郭蘭芹，宗克亮，楊錫琴，劉志強(qiáng)，趙照，修冰水，段翠密，陳堃，張旭輝，張嶸，馮曉燕，張賀秋

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850；2.沈陽(yáng)藥科大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110016；3.華北石油總醫(yī)院，河北 任丘 062552；4.風(fēng)帆集團(tuán) 職工醫(yī)院，河北 保定 071000；5.首都師范大學(xué) 數(shù)學(xué)科學(xué)學(xué)院，北京 100148

結(jié)核病（tuberculosis，TB）是一種由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）引起的嚴(yán)重危害人類健康的呼吸道傳染病，是全球性的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題和社會(huì)問(wèn)題[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全世界每年約300 萬(wàn)人死于TB，是造成死亡人數(shù)最多的單一傳染病。我國(guó)是全世界22 個(gè)TB 高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，患者人數(shù)僅次于印度而位居全球第二，這說(shuō)明我國(guó)TB流行趨勢(shì)嚴(yán)峻，不可小覷[2]。流動(dòng)人口增加、免疫力下降、耐藥性菌株的出現(xiàn)，以及艾滋病共感染等因素，加速了結(jié)核病的感染復(fù)發(fā)與進(jìn)一步流行。

酶聯(lián)免疫測(cè)定技術(shù)（ELISA）是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原-抗體的特異性反應(yīng)與酶和底物的高效催化作用相結(jié)合的一種敏感性很高的技術(shù)。臨床上常用間接ELISA法檢測(cè)TB患者血清中的IgG抗體水平，但I(xiàn)gG 抗體出現(xiàn)較晚，對(duì)TB 的早期感染會(huì)產(chǎn)生漏檢，血清中非特異性物質(zhì)的吸附干擾也會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)。研究表明[3]，同時(shí)使用間接ELISA 法檢測(cè)TB 患者血清中的IgG、IgM 和IgA 抗體可顯著提高陽(yáng)性檢出率，但聯(lián)合檢測(cè)費(fèi)用較單一檢測(cè)高，增加了患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。為了改進(jìn)Mtb 血清學(xué)診斷方法，我們建立了2種檢測(cè)抗Mtb總抗體的雙抗原夾心ELISA 法，即辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記組雙抗原夾心ELISA 和生物素標(biāo)記組雙抗原夾心ELISA（以下簡(jiǎn)稱HRP-ELISA 法和Bio-ELISA 法），并利用臨床患者樣本初步評(píng)價(jià)了2種方法的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

所有血清均來(lái)自北京市朝陽(yáng)區(qū)疾病預(yù)防控制中心，全部為臨床新近診斷的活動(dòng)性肺結(jié)核患者，未合并感染人免疫缺陷病毒（HIV），未接受抗結(jié)核治療；陰性對(duì)照組來(lái)自健康體檢者。

融合抗原38kD+ESAT6+CFP10（以下簡(jiǎn)稱38+6+10）為本室構(gòu)建并保存；HRP 購(gòu)自Sigma 公司；生物素購(gòu)自Thermo公司；SA-HRP購(gòu)自VECTOR公司；NaIO4、NaBH4、DMSO、丙三醇、硫酸均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品；SM-3 型自動(dòng)化酶免分析儀、ZMX-988B 型自動(dòng)化酶免洗板機(jī)均為北京天石天力醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；CU420 型電熱恒溫水箱為上海一恒科技有限公司產(chǎn)品；96 孔酶聯(lián)板為廈門怡佳美實(shí)驗(yàn)器材有限公司產(chǎn)品。

1.2 HRP標(biāo)記融合抗原38+6+10

將1 mL 5 mg/mL 融合抗原裝入透析袋，用0.01 mol/L 碳酸鹽緩沖液（pH9.5）1000 mL 于4℃透析48 h；取5 mg HRP 溶于0.5 mL 去離子水；加0.5 mL 0.06 mol/L NaIO4，室溫下避光輕攪20 min，液體呈黃綠色；加0.5 mL 0.16 mol/L 乙二醇，室溫下避光輕攪30 min，終止氧化反應(yīng)；裝入透析袋，用0.01 mol/L 碳酸鹽緩沖液（pH9.5）1000 mL 于4℃透析過(guò)夜；將透析后的酶標(biāo)抗原倒入棕色小瓶，加入0.2 mL 5 mg/mL NaBH4，4℃穩(wěn)定2 h 后，加等量的甘油，小量分裝，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 生物素標(biāo)記融合抗原38+6+10

將1 mL 2 mg/mL 的融合抗原裝入透析袋，用0.01 mol/L 碳酸鹽緩沖液（pH9.5）1000 mL 于4℃透析48 h；加10 μL 用20 μg/μL DMSO 溶解的生物素，室溫穩(wěn)定1～2 h；裝入透析袋，用0.02 mol/L PBS緩沖液（pH7.4）1000 mL 于4℃透析過(guò)夜；小量分裝，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 雙抗原夾心ELISA法的優(yōu)化

采用5份健康對(duì)照和6份不同反應(yīng)強(qiáng)度的TB 患者血清樣本，對(duì)融合抗原包被濃度以及標(biāo)記抗原稀釋率進(jìn)行優(yōu)化，分別計(jì)算TB患者血清平均吸光度值P，健康對(duì)照血清平均吸光度值N，選擇最大P/N 值所對(duì)應(yīng)的反應(yīng)條件作為最佳反應(yīng)條件。ELISA 法的具體優(yōu)化步驟如下：

①將融合抗原38+6+10 用包被液稀釋至2、1、0.5 和0.25 μg/mL，100 μL/孔包被96 孔酶聯(lián)板，4℃過(guò)夜；②洗板2 次后拍干，110 μL/孔加入封閉液，室溫封閉8 h 后棄液拍干；③100 μL/孔加入血清樣本原液，37℃孵育30 min；④洗板5 次后拍干，100 μL/孔加入1∶500 稀釋的HRP-38+6+10，37℃孵育20 min（Bio-ELISA 法的此步為：100 μL/孔加入1∶2000稀釋的Bio-38+6+10，37℃孵育30 min，洗板5 次后拍干，100 μL/孔加入1∶1000 稀釋的SA-HRP，37℃孵育20 min）；⑤洗板5 次后拍干，加入TMB 顯色液A 和B 各50 μL/孔，37℃避光顯色10 min；⑥50 μL/孔加入1 mol/L 硫酸，用酶標(biāo)儀讀取D450nm和D620nm值，分別比較4 組不同抗原包被濃度的P/N 值，選擇P/N較大者作為最佳抗原包被濃度；⑦用已確定的最佳抗原包被濃度包被酶聯(lián)板，將待檢血清與樣品稀釋液的加樣量分別按比例10+90、20+80、30+70、40+60和100 μL血清原液加入酶聯(lián)板各孔中，其他反應(yīng)條件相同，按上述步驟進(jìn)行檢測(cè)，分別比較5 組不同樣品稀釋率的P/N值，選擇P/N值較大者作為最佳樣品稀釋率；⑧用已確定的最佳抗原包被濃度包被酶聯(lián)板，并用所確定的樣品稀釋率加樣后，將HRP-38+6+10 按1∶500、1∶1000 稀釋，將Bio-38+6+10 按1∶2000、1∶4000 稀釋，其他反應(yīng)條件相同，按上述步驟進(jìn)行檢測(cè)，分別比較2組不同標(biāo)記抗原稀釋率的P/N值，選擇P/N值較大者作為最佳標(biāo)記抗原稀釋率。

1.5 已建立雙抗原夾心ELISA法的初步應(yīng)用

用最佳反應(yīng)條件建立的HRP-ELISA 法和Bio-ELISA法檢測(cè)血清樣本，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算2種檢測(cè)方法的靈敏度、特異性、P/N值和AUC。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0 和GraphPad Prism 6 統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。分析結(jié)果中P 為TB患者的平均吸光度值，N 為健康人的平均吸光度值；AUC 表示受試者工作特征曲線下的面積，該值越大且越接近于1即表明該方法的診斷效能越好。

2 結(jié)果

2.1 最佳反應(yīng)條件的確定

2.1.1 融合抗原包被濃度的確定 將融合抗原按不同包被濃度進(jìn)行包被，其他條件相同下進(jìn)行ELISA檢測(cè)，結(jié)果見表1、2。HRP-ELISA 法和Bio-ELISA法的融合抗原分別按2、0.25 μg/mL 包被時(shí)得到的P/N值最高，為各自的最佳包被濃度。

2.1.2 樣品稀釋率的確定 用已確定的最佳抗原包被濃度包被酶聯(lián)板后，將待檢血清與樣品稀釋液的加樣量分別按不同比例加入酶聯(lián)板各孔中，其他條件相同下進(jìn)行ELISA 檢測(cè)，結(jié)果見表3、4。HRPELISA法和Bio-ELISA法均在加入100 μL血清原液時(shí)得到的P/N值最高，為各自的最佳樣品稀釋率。

2.1.3 標(biāo)記抗原稀釋率的確定 用已確定的包被濃度進(jìn)行包被，并用所確定的樣品稀釋率加樣后，將標(biāo)記抗原按不同稀釋率進(jìn)行稀釋，其他條件相同下進(jìn)行ELISA檢測(cè)，結(jié)果見表5、6。HRP-ELISA 法 和Bio-ELISA 法分別按1∶500、1∶2000 稀釋時(shí)得到的P/N值最高，為各自的最佳標(biāo)記抗原稀釋率。

2.2 對(duì)血清樣本的檢測(cè)結(jié)果

用所確定的最佳反應(yīng)條件對(duì)71 份TB 患者和90份健康對(duì)照血清的檢測(cè)結(jié)果見表7，HRP-ELISA 法和Bio-ELISA 法的散點(diǎn)圖和ROC 曲線見圖1。Bio-ELISA 法的臨界值為0.044，顯著低于HRP-ELISA法，靈敏度 為52.11%、P/N 值 為74.42、AUC 為0.9746，均顯著高于HRP-ELISA 法。HRP-ELISA 法和Bio-ELISA 法的TB 患者抗體水平均顯著高于健康對(duì)照，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P＜0.0001）。

表1 HRP-ELISA法融合抗原包被濃度的選擇

表2 Bio-ELISA法融合抗原包被濃度的選擇

表3 HRP-ELISA法樣品稀釋率的選擇

表4 Bio-ELISA法樣品稀釋率的選擇

3 討論

生物素-親合素系統(tǒng)（biotin-avidin system，BAS）是20 世紀(jì)70 年代后期應(yīng)用于免疫學(xué)，并得到迅速發(fā)展的一種新型生物反應(yīng)放大系統(tǒng)。它具有多級(jí)放大效應(yīng)，并與熒光素、酶、放射性核素等免疫標(biāo)記技術(shù)有機(jī)地結(jié)合，使各種示蹤免疫分析的特異性和靈敏度進(jìn)一步提高，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。生物素廣泛分布于動(dòng)、植物組織中，在機(jī)體內(nèi)以輔酶形式參與各種羧化酶反應(yīng)，故又稱為輔酶R或維生素H。它有2個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，分別為咪唑酮環(huán)（與親合素結(jié)合的主要部位）和噻吩環(huán)（其末端羧基是結(jié)合抗體和其他生物大分子的惟一結(jié)構(gòu)）。鏈霉親合素（streptavidin，SA）和生物素之間的親和力極強(qiáng)，一個(gè)SA 分子可以結(jié)合4 個(gè)生物素分子，二者的親和常數(shù)為1015/mol，比抗原與抗體的親和力至少高1 萬(wàn)倍[4]。因此二者能快速結(jié)合且反應(yīng)不易受外界干擾，具有高度特異性和穩(wěn)定性，所以在實(shí)際應(yīng)用中BAS的精確度較高、操作誤差較小。

本研究中所用的抗原是由本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建、表達(dá)和純化的高活性融合抗原38+6+10，包含38kD 抗原、ESAT6和CFP10的優(yōu)勢(shì)表位抗原區(qū)段，在先前建立的間接ELISA 法結(jié)核IgG 抗體檢測(cè)技術(shù)中已證明該融合抗原具有較好的靈敏度和特異性[5]。其中38kD 是一種磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，參與磷鹽的代謝，是Mtb 的主要抗原，因此用于TB 血清學(xué)診斷檢測(cè)的靈敏度和特異性均較高。它只在分枝桿菌復(fù)合體中表達(dá)，且卡介苗（BCG）合成38kD 蛋白的量只有Mtb 的1/10，是目前最為常用的TB 診斷抗原之一。同時(shí)，它是最早發(fā)展用于商業(yè)化診斷試劑盒的抗原，對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核的診斷效果較好[6]。ESAT6 是一種主要的Mtb 分泌蛋白，具有良好的抗原性。1996 年Harboe 等通過(guò)PCR、Southern 雜交和免疫印跡分析，從基因和蛋白水平上揭示ESAT6僅存在于致病性分枝桿菌（如Mtb、牛分枝桿菌）中，而不存在于BCG 及其他非致病分枝桿菌中[7]。CFP10 基因位于ESAT6 基因的上游，以單拷貝的形式分布于相同的分枝桿菌中，在BCG 所有菌株中不存在。它與ESAT6 約有40%的同源性，且具有相同的免疫學(xué)特性[8]，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。同時(shí)，CFP10 蛋白具有與天然蛋白相同的抗原性，可誘發(fā)結(jié)核菌素試驗(yàn)陽(yáng)性者的外周血單核細(xì)胞中出現(xiàn)增殖反應(yīng)并產(chǎn)生較ESAT6分泌水平高的IFN-γ。根據(jù)其BCG缺失的特點(diǎn)，ESAT6-CFP10 蛋白已成為目前應(yīng)用最為廣泛的診斷用抗原[9-10]。

表5 HRP-ELISA法標(biāo)記抗原稀釋率的選擇

表6 Bio-ELISA法標(biāo)記抗原稀釋率的選擇

表7 HRP-ELISA法和Bio-ELISA法對(duì)血清標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果

圖1 HRP-ELISA法和Bio-ELISA法的散點(diǎn)圖（A）和ROC曲線（B）

我們使用HRP 和生物素標(biāo)記融合抗原，其后經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了2種Mtb雙抗原夾心ELISA 法，分別為HRP-ELISA 法和Bio-ELISA法，所確定的最佳抗原包被濃度依次為2和0.25 μg/mL，最佳樣品稀釋率均為100 μL 血清原液，最佳標(biāo)記抗原稀釋率數(shù)依次為1∶500和1∶2000。用建立的抗體檢測(cè)方法對(duì)71份TB 患者和90份健康對(duì)照血清進(jìn)行初步臨床應(yīng)用，比較分析后發(fā)現(xiàn)Bio-ELISA 法的靈敏度、P/N 值和AUC 均顯著高于HRP-ELISA法，這是因?yàn)樯锼貥?biāo)記的蛋白具有多價(jià)性，且標(biāo)記后的抗原生物活性不變，而每個(gè)SA 有4 個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)，可同時(shí)以多價(jià)形式結(jié)合到生物素化大分子衍生物和標(biāo)志物上，因此BAS 具有多級(jí)放大作用。雖然2 種方法的特異性均為100%，但Bio-ELISA 法的P/N 值（74.92）顯著大于HRP-ELISA 法（9.42），且Bio-ELISA 法的AUC 值也高于HRP-ELISA 法，表明Bio-ELISA 法區(qū)分陰性和陽(yáng)性樣本的能力顯著高于HRP-ELISA法，試劑的檢測(cè)性能更好。

綜上所述，本研究建立的2種雙抗原夾心ELISA法均適用于TB 的臨床輔助診斷，其中Bio-ELISA 法的診斷性能明顯優(yōu)于HRP-ELISA 法，更加適合用于TB的臨床輔助診斷。

[1]陳靜.結(jié)核病的預(yù)防與治療[J].基層醫(yī)學(xué)論壇,2015,19(3):359-360.

[2]邵傳賢.遠(yuǎn)離結(jié)核病,首選良方是預(yù)防[J].醫(yī)生談疾病預(yù)防,2015,3:20-21.

[3]Feng Xiaoyan,Yang Xiqin,Xiu Bingshui,et al.IgG,IgM and IgA antibodies against the novel polyprotein in active tuberculosis[J].BMC Infect Dis,2014,14:336.

[4]沈關(guān)心,周汝麟.現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].2版.石家莊:河北科學(xué)技術(shù)出版社,2002:178-180.

[5]馮曉燕,陳堃,宋曉國(guó),等.結(jié)核分枝桿菌抗原優(yōu)勢(shì)肽段融合抗原38kD+ESAT6+CFP10構(gòu)建與抗原性初步檢測(cè)[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2009,13(3):285-288.

[6]張欣,張榮波.結(jié)核分枝桿菌抗原診斷研究進(jìn)展[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2006,22(12):1164-1165.

[7]Lincoln E M,Sordillo V R,Davies P A.Tuberculous meningitis in children:a review of 167 untreated and 74 treated patients with special reference to early diagnosis[J].Pediatric,1960,57:807-823.

[8]Colangeli R,Spencer J S,Bifani P,et al.MTBSA-10,the product of the Rv3874 gene of Mycobacterium tuberculosis,elicites tuberculosis-specific,delayed-type hypersensitivity in guinea pigs[J].Infect Immun,2000,68(2):990-993.

[9]霍霏霏,張麗帆,劉曉清.評(píng)價(jià)Y 干擾素釋放分析T-SPOT.TB在肺外結(jié)核病診斷中的敏感性[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào),2009,31(4):449-452.

[10]Stephan C,Wolf T,Goetsch U,et al.Comparing QuantiFERON-tuberculosis gold,T-SPOT tuberculosis and tuberculin skin test inHIV-infected individuals from a low prevalence tuberculosis country[J].AIDS,2008,22(18):2471-2479.