汪明群 ，叢建波，程莉，董國(guó)福，王少霞，鄭文，王長(zhǎng)振，吳可

1.宜賓市第一人民醫(yī)院，四川 宜賓 644000；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850

C 型凝集素樹突細(xì)胞特異性細(xì)胞間黏附分子3結(jié)合非整合素分子（dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing nonintegrin，DC-SIGN）家族成員肝臟免疫調(diào)控蛋白LSECtin（liver and lymph node sinusoidal endothelial cell Ctype lectin）是近年來(lái)克隆鑒定的新型凝集素蛋白，在肝臟和淋巴結(jié)表達(dá)[1-2]，活體分離的外周血和胸腺樹突細(xì)胞（DC）及體外培養(yǎng)的活化巨噬細(xì)胞也有表達(dá)[3]，并被證實(shí)是肝臟重要的免疫調(diào)控蛋白[4-5]。其基因與DC-SIGN、DC-SIGNR（DC-SIGN related protein）和CD23 的基因緊密排列于染色體19p13.3 區(qū)域。它們均屬于Ⅱ型C 型凝集素家族，具有相似的結(jié)構(gòu)，由一個(gè)N 端的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域、一個(gè)穿膜部分、一個(gè)含卷曲螺旋的頸部結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C 端糖基識(shí)別結(jié)構(gòu)域（carbohydrate recognition domain，CRD）組成，其中CRD 結(jié)構(gòu)域是參與病毒感染及配體結(jié)合的主要功能結(jié)構(gòu)域[1,6]。近年來(lái)對(duì)LSECtin 分子的研究雖有較多進(jìn)展，但對(duì)其功能結(jié)構(gòu)域在溶液狀態(tài)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其在與配體相互作用時(shí)的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)變化并未得到很好的闡明，這也是該領(lǐng)域研究中需要解決的重點(diǎn)和熱點(diǎn)問(wèn)題。

我們擬采用基因克隆的方法構(gòu)建LSECtin-CRD的原核表達(dá)載體，并對(duì)其表達(dá)純化，旨在獲得足量可溶融合蛋白，為后續(xù)LSECtin-CRD 結(jié)構(gòu)域的功能與構(gòu)象變化研究打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

LSECtin-CRD 模板（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院蛋白質(zhì)組與基因組學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供）；pGEX-6p-1（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)標(biāo)所惠贈(zèng)）；大腸桿菌DH5α、Origami（DE3）感受態(tài)細(xì)胞（Novagen 公司）；高保真DNA 聚合酶，DNA純化試劑盒，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、NotⅠ（Promega公司）；DL2000 DNA marker、λHindⅢ、T4DNA 連接酶（NEB 公司）；蛋白質(zhì)分子量marker（Fermentas 公司）；GST 抗體、HRP 標(biāo)記的羊抗兔抗體（Santa Cruz Biotechnology公司）。

1.2 原核表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)LSECtin 基因序列和原核表達(dá)載體pGEX-6p-1 的多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)上游引物P1（5'-CCGGAA TTCGGCTCCTGCTACTTTTT-3'）和下游引物 P2（5'-CCCGCGGCCGCGCAGTTGTGGCCTTTTCT-3'）。上、下游引物分別引入EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)。用上述引物以LSECtin 為模板擴(kuò)增360 bp 的LSECtin-CRD 基因序列，目的片段純化、EcoRⅠ/NotⅠ雙酶切后與經(jīng)同樣雙酶切的原核表達(dá)載體pGEX-6p-1 用T4DNA 連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，陽(yáng)性克隆經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定。

1.3 重組表達(dá)載體的誘導(dǎo)表達(dá)

將測(cè)序正確的表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6p-1-LSECtin-CRD 轉(zhuǎn)化宿主菌Origami（DE3）進(jìn)行重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)。小量菌種培養(yǎng)過(guò)夜，1%接種量轉(zhuǎn)接后，D600nm為0.5～0.8 時(shí)加入終濃度為0.5 mmol/L 的IPTG，20℃低溫誘導(dǎo)6 h，離心收集菌體，用TBS 吹勻，洗3 次，離心后加TBST，超聲波破碎（超聲3 s 停2 s，共5 min,連續(xù)3 次后停5 min，重復(fù)操作5～8 次，直至溶液變得澄清），將得到的樣品（未誘導(dǎo)全菌為陰性對(duì)照）經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)。

1.4 包涵體的復(fù)性、純化及Western印跡鑒定

將誘導(dǎo)表達(dá)的菌液于5000 r/min 離心10 min，棄上清，用TBS 洗2 次，收集菌體，按每克菌體加10 mL STET 緩沖液（pH8.0）的比例重懸，超聲波破菌后1000 r/min離心10 min，棄上清，沉淀用10 mL包涵體洗滌液洗滌3 次，再用9 倍體積的含4 mol/L 尿素的TE 緩沖液（含20 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH8.0）洗滌，過(guò)夜，分別保留上清和沉淀，按10 mL/g 的比例用含8 mol/L 尿素的緩沖液（含0.2 mol/L NaCl，0.1 mol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L DTT，pH8.0）溶解沉淀，4℃攪拌過(guò)夜，4℃低溫離心，上清即為目的蛋白。上述包涵體裂解液用含8 mol/L 尿素的緩沖液（含20 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH8.0）稀釋至0.2 mg/mL，加入DTT 至終濃度1 mmol/L，室溫放置4 h，用含4、3、2 mol/L 尿素的透析外液（含20 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，3 mmol/L GSH，0.5 mmol/L GSSG，pH8.0）進(jìn)行4℃梯度透析復(fù)性24 h，將復(fù)性的溶液進(jìn)行GST 柱親和純化，SDS-PAGE 檢測(cè)收集流出液，對(duì)純化的蛋白進(jìn)行Western印跡鑒定。

對(duì)純化蛋白進(jìn)行12% SDS-PAGE；選用標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置，將蛋白移到PVDF 膜，設(shè)定轉(zhuǎn)膜電流為300～400 mA，時(shí)間為60 min，為了避免發(fā)熱現(xiàn)象，將轉(zhuǎn)膜槽置于冰浴中；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，把PVDF 膜置入洗滌液漂洗2 min，去除洗滌液，加入含5%脫脂牛奶的TBST封閉液，在搖床上緩慢搖動(dòng)，室溫封閉60 min；用兔源單克隆抗體GST（1∶1000）孵育，4℃緩慢搖動(dòng)過(guò)夜，TBST 洗3 次，每次10 min；用羊抗兔辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，TBST 洗3次，每次10 min；ECL暗室曝光顯影。

2 結(jié)果

2.1 pGEX-6p-1-LSECtin-CRD原核表達(dá)載體的構(gòu)建

用EcoRⅠ/NotⅠ雙酶切膠回收擴(kuò)增的目的基因小片段，與同樣經(jīng)雙酶切的質(zhì)粒載體大片段連接后構(gòu)建表達(dá)載體pGEX-6p-1-LSECtin-CRD，挑克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，酶切鑒定（圖1），顯示250～500 bp有特異的DNA 帶，大小與預(yù)計(jì)相符，初步表明目的片段已成功插入。對(duì)呈陽(yáng)性結(jié)果的克隆保存菌種，取1.0 mL送Invitrogen 公司測(cè)序，結(jié)果表明基因序列正確匹配，被測(cè)片段包括了編碼LSECtin-CRD 的全部核苷酸序列及兩端的引物。

2.2 LSECtin-CRD-GST融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將酶切鑒定及測(cè)序正確的pGEX-6p-1-LSECtin-CRD 轉(zhuǎn)化大腸桿菌Origami（DE3）宿主菌，外源基因表達(dá)后離心收集融合蛋白，SDS-PAGE 檢測(cè)表達(dá)情況，結(jié)果見圖2，在相對(duì)分子質(zhì)量約40×103處有蛋白表達(dá)，與預(yù)計(jì)的融合蛋白大小吻合，表明表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主菌后誘導(dǎo)出大量融合蛋白，但以包涵體形式存在，上清液里未發(fā)現(xiàn)可溶蛋白。

2.3 包涵體的復(fù)性、純化及Western印跡鑒定

對(duì)包涵體進(jìn)行洗滌裂解及梯度透析復(fù)性處理后用GST柱親和純化，純化的樣品經(jīng)SDS-PAGE（圖3）分析，結(jié)果顯示獲得純度高的目的蛋白。Western 印跡（圖4）檢測(cè)證明目的蛋白有特異的GST抗原性。

圖1 pGEX-6p-1-LSECtin-CRD表達(dá)載體的雙酶切鑒定

圖2 pGEX-6p-1-LSECtin-CRD在宿主菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

圖3 融合蛋白純化的SDS-PAGE分析

圖4 Western印跡驗(yàn)證融合蛋白

3 討論

LSECtin 系肝臟及淋巴結(jié)竇內(nèi)皮細(xì)胞C 型凝集素，屬于疏水性強(qiáng)、富含二硫鍵的Ⅱ型跨膜糖蛋白。已有研究表明LSECtin-CRD在原核系統(tǒng)中以包涵體形式表達(dá)[5,7-8]。本實(shí)驗(yàn)中，我們選擇了有助于膜蛋白二硫鍵正確折疊的表達(dá)載體pGEX-6p-1。pGEX 質(zhì)粒載體將基因或基因片段與GST 融合后，不但能在細(xì)胞內(nèi)高水平誘導(dǎo)表達(dá)，而且有助于提高表達(dá)蛋白的活性。我們還選擇大腸桿菌Origami（DE3）作為重組蛋白的宿主菌。Origami（DE3）是硫氧還蛋白還原酶（TrxB）突變的BL21 衍生菌，它能促進(jìn)重組蛋白在胞質(zhì)中形成二硫鍵，而普通的大腸桿菌不利于二硫鍵的形成，并且在同類衍生菌中，Origami（DE3）形成二硫鍵的活力是最強(qiáng)的[9]。有研究表明，在整體水平相當(dāng)?shù)那闆r下，采用Origami（DE3）宿主，曾使一個(gè)含二硫鍵的重組蛋白的表達(dá)活性提高了10 倍[10]，同樣是包涵體，但用Origami（DE3）宿主菌更有利于翻譯后修飾，有效降低了重組蛋白的無(wú)序聚集，有益于下一步的復(fù)性。

雖然我們?cè)诘蜏亍⒌虸PTG 濃度、豐富培養(yǎng)基、短時(shí)誘導(dǎo)、錯(cuò)開目的蛋白等電點(diǎn)等方面進(jìn)行了摸索，依然沒能實(shí)現(xiàn)目的蛋白的可溶性表達(dá)。但本實(shí)驗(yàn)揭示宿主菌Origami 與表達(dá)載體pGEX-6p-1 是一對(duì)較佳的組合，這一組合有效地提高了表達(dá)蛋白的活性，降低了重組蛋白的無(wú)序折疊，易化了后續(xù)復(fù)性工作，對(duì)表達(dá)融合蛋白具有重要的借鑒意義。

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