孫衛(wèi)國(guó)，楊栗坤，熊志紅，楊秉芬，劉艷華，張靈霞

解放軍第309醫(yī)院 結(jié)核病研究所，全軍結(jié)核病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091

人表皮生長(zhǎng)因子（human epidermal growth factor，hEGF）是由53 個(gè)氨基酸殘基組成的單鏈多肽，廣泛存在于人體各種組織內(nèi)。人體內(nèi)EGF含量不足易導(dǎo)致一系列的病理變化，如胃腸道潰瘍病，而補(bǔ)充外源性EGF 能大大縮短慢性胃潰瘍的療程[1]。EGF表達(dá)過(guò)量增加鳥氨酸脫羧酶的活性及多胺水平，也與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[2]。hEGF能促進(jìn)燒傷、創(chuàng)傷及外科傷口的愈合，在燒傷、創(chuàng)傷、皮膚和角膜移植、外傷性皮膚潰瘍等治療中有重要作用。EGF也是某些化妝品的添加劑，具有較大的市場(chǎng)價(jià)值。目前利用原核系統(tǒng)表達(dá)重組hEGF（rhEGF）的主要弊端是表達(dá)量較低，生物活性不高，很難規(guī)?；a(chǎn)。我們根據(jù)原核表達(dá)系統(tǒng)特點(diǎn)，優(yōu)化影響rhEGF表達(dá)量的諸多因素，對(duì)基因核酸序列的mRNA 結(jié)構(gòu)、密碼子偏愛(ài)性，表達(dá)宿主菌的生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行綜合考慮，通過(guò)同義密碼子置換合成hEGF 全基因序列，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-24b-hEGF，獲得hEGF 在原核系統(tǒng)內(nèi)的高表達(dá)，其表達(dá)量占菌體總蛋白的15%左右。經(jīng)過(guò)復(fù)性條件的優(yōu)化，包涵體的復(fù)性率達(dá)90%以上，為原核系統(tǒng)規(guī)?；a(chǎn)rhEGF打下了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

BALB/c3T3 細(xì)胞，大腸桿菌BL21（DE3）和載體pET24b 由本室保存；EGF 標(biāo)準(zhǔn)品由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；優(yōu)化后的hEGF編碼序列和測(cè)序由北京華大基因生物工程公司合成；酵母提取物、胰蛋白胨購(gòu)自O(shè)xoid 公司；hEGF 抗體購(gòu)自ABcam 公司；酶標(biāo)羊抗兔IgG（HRP 標(biāo)記）購(gòu)自中杉生物工程技術(shù)公司；MTT 購(gòu)自Sigma 公司；親和色譜填料購(gòu)自GE 公司；其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 hEGF全基因序列優(yōu)化與合成

根據(jù)生物軟件對(duì)hEGF可能表達(dá)量的預(yù)測(cè)，對(duì)其編碼序列按同義密碼子進(jìn)行全合成，使mRNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)自由能滿足最優(yōu)表達(dá)需要，同時(shí)3′端加入大腸桿菌偏好終止密碼子TAA。合成的全序列為：AACAGCGACTCTGAATGCCCGCTGTCCCACGATGGTTACTGCCT GCATGATGGTGTGTGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTATG CATGCAACTGCGTTGTTGGCTACATCGGTGAGCGTTGCCAGTAC CGTGACCTGAAGTGGTGGGAACTGCGC。

1.3 hEGF基因克隆與表達(dá)

對(duì)合成的含有hEGF 全序列載體pUC-hEGF 以限制性內(nèi)切酶NdeⅠ/XhoⅠ于37℃酶切10 h，瓊脂糖膠回收酶切后小片段，與經(jīng)同樣雙酶切的表達(dá)載體pET-24b 在T4DNA 連接酶的作用下于16℃連接4 h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21（DE3）后，挑選陽(yáng)性克隆測(cè)序，取測(cè)序結(jié)果同預(yù)期結(jié)果完全一致的菌落保存。將攜帶有hEGF 序列的原核表達(dá)載體命名為pET-24b-hEGF。

將陽(yáng)性菌落接種含卡那霉素的LB 培養(yǎng)基，37℃振搖過(guò)夜活化后，按1∶100 的比例重新接種LB 培養(yǎng)基，檢測(cè)細(xì)菌的生長(zhǎng)密度，當(dāng)菌液D600nm達(dá)0.4 時(shí)，加入IPTG 使其終濃度為0.3 mmol/L，37℃誘導(dǎo)表達(dá)7 h，離心收集沉淀菌體，加入PBS緩沖液混勻，冰浴超聲波破碎，表達(dá)菌液加入5×上樣緩沖液，煮沸后取20 μL 進(jìn)行20% SDS-PAGE，分析目的蛋白在原核系統(tǒng)內(nèi)的表達(dá)量和表達(dá)形式。

1.4 rhEGF包涵體的復(fù)性與純化

電泳鑒定rhEGF 在原核系統(tǒng)中以包涵體的形式生成，對(duì)包涵體進(jìn)行初步純化。收集rhEGF 沉淀包涵體，用1%的Triton X-100 洗滌3 次，4℃、5000 r/min 離心10 min；室溫條件下取rhEGF 包涵體，以含8 mol/L 尿素的Tris 緩沖液（50 mmol/L，pH8.8）溶解，高速離心后取溶液上清過(guò)Q Sepharose Fastflow陰離子交換柱，并用含8 mol/L 尿素的Tris 緩沖液（50 mmol/L，pH8.8）+NaCl 進(jìn)行梯度洗脫，分別收集穿過(guò)峰和各洗脫峰蛋白；采用透析復(fù)性的方法對(duì)rhEGF 包涵體進(jìn)行復(fù)性，將純化的包涵體尿素溶液以含5 mmol/L EDTA、0.1 mmol/L GSH、0.1 mmol/L GSSG 的Tris 緩沖液（50 mmol/L，pH8.8）在4℃條件下以1∶20 的體積進(jìn)行透析，12 h 更換透析液一次，透析5 次后以50 mmol/L Tris 緩沖液（pH8.8）透析，整個(gè)透析過(guò)程均沒(méi)有沉淀產(chǎn)生；取透析后復(fù)性的rhEGF進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.5 rhEGF的Western印跡與活性檢測(cè)

取純化的rhEGF 行20%的SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)移后將硝酸纖維素膜（NC 膜）置于含5%脫脂奶粉的PBS 緩沖液中，室溫封閉1 h，用TBST 漂洗3 次；將NC 膜與兔抗hEGF 抗體（1∶3000 稀釋）于4℃孵育過(guò)夜，用TBST 洗滌3 次，再與適當(dāng)稀釋的酶標(biāo)記的羊抗兔二抗于37℃反應(yīng)1 h，用TBST 洗滌4 次；ECL 暗室中自動(dòng)曝光顯影，驗(yàn)證重組蛋白的抗原性。

BALB/c3T3 細(xì)胞用RPM1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按7×103/孔加入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，24 h 后更換成含0.5%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，依次加入用維持培養(yǎng)液稀釋的不同濃度的EGF，每濃度梯度做3 個(gè)平行孔，37℃、5% CO2培養(yǎng)48～72 h，MTT 法檢測(cè)各孔的D490nm值，繪制D490nm-EGF濃度關(guān)系圖[3]。

2 結(jié)果

2.1 hEGF原核表達(dá)載體構(gòu)建

對(duì)含有hEGF 全序列的載體pUC-hEGF 進(jìn)行擴(kuò)增后用NdeⅠ/XhoⅠ雙酶切，回收酶切后的小片段，通過(guò)連接酶克隆到表達(dá)載體pET-24b 中，篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒pET-24b-hEGF，經(jīng)NdeⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定，10 g/L 瓊脂糖電泳結(jié)果顯示，酶切后生成的條帶位于目標(biāo)大小160 bp處（圖1）。

2.2 rhEGF的原核表達(dá)

取測(cè)序正確的含有質(zhì)粒pET-24b-hEGF 的重組大腸桿菌BL21（DE3）接種含卡那霉素的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)，在菌液D600nm值約為0.4 時(shí)加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)7 h，離心收集沉淀，超聲波破碎，20%SDS-PAGE 分析目的蛋白的表達(dá)量和表達(dá)形式。結(jié)果如圖2，在相對(duì)分子質(zhì)量6×103處，誘導(dǎo)后有rhEGF明顯表達(dá)，其表達(dá)量占總蛋白的15%以上，且基本以包涵體的形式存在于超聲波后的沉淀中。

2.3 rhEGF包涵體的復(fù)性與純化

圖1 pET-24b-hEGF雙酶切產(chǎn)物的瓊脂糖電泳

對(duì)表達(dá)的rhEGF 包涵體用Triton X-100 洗滌，除去脂類和降解的核酸，然后分別用2、4、6、8 mol/L的尿素溶解。SDS-PAGE 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在6 mol/L 的尿素溶液里rhEGF 包涵體得到部分溶解，而在8 mol/L的尿素溶液里全部溶解。取變性后的上清液過(guò)Q Sepharose Fastflow 陰離子交換柱，用含8 mol/L 尿素的Tris緩沖液（50 mmol/L，pH8.8）+NaCl進(jìn)行梯度洗脫。當(dāng)鹽濃度為0.4 mol/L 時(shí)洗脫目的蛋白，一步純化的純度達(dá)90%以上。對(duì)洗脫上清透析復(fù)性，整個(gè)透析過(guò)程均沒(méi)有沉淀產(chǎn)生，復(fù)性率達(dá)90%以上。取復(fù)性的rhEGF 經(jīng)SDS-PAGE 分析純度，結(jié)果如圖3，純化復(fù)性后rhEGF的Image軟件掃描純度可達(dá)93%。

2.4 rhEGF的Western印跡與活性分析

取純化的rhEGF，經(jīng)SDS-PAGE 后電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，分別和相應(yīng)的一抗和二抗孵育、洗滌。與ECL 結(jié)合1 min，暗室曝光顯影，結(jié)果如圖4，純化的rhEGF能與其抗體結(jié)合，具有強(qiáng)的抗原性。

用BALB/c3T3 細(xì)胞通過(guò)MTT 增殖法測(cè)定rhEGF的活性，以生物制品檢定所提供的EGF為陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照為培養(yǎng)液，細(xì)胞接種數(shù)為7×103/孔。結(jié)果如圖5，rhEGF 活性約為2.5×106U/mL。20～160 ng/mL 的rhEGF 對(duì)成纖維細(xì)胞具有明顯的促增殖作用，與標(biāo)準(zhǔn)品表現(xiàn)一致，兩者在統(tǒng)計(jì)學(xué)分析上無(wú)差異。

3 討論

圖2 hEGF原核表達(dá)形式的SDS-PAGE分析

圖3 rhEGF純化后的SDS-PAGE分析

圖4 rhEGF的Western印跡

圖5 rhEGF對(duì)BALB/c3T3細(xì)胞的促增殖作用

諸多因素影響外源基因在原核系統(tǒng)中的表達(dá)效率，如外源基因結(jié)構(gòu)、密碼子偏性、mRNA 翻譯起始區(qū)結(jié)構(gòu)，目的蛋白的毒性、氨基酸組成，表達(dá)條件的優(yōu)化等[4]。成熟hEGF 具有廣泛的生理功能，如加速受傷表皮細(xì)胞的修復(fù)和治療胃腸道潰瘍等[5]。目前用原核表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)rhEGF 的表達(dá)量非常低。Ferrer-Soler等利用pET-22b載體獲得了單體rhEGF，但表達(dá)量很低[6]。為了獲得EGF 單體的高表達(dá)量，可對(duì)其氨基酸密碼子進(jìn)行同義置換，改變其mRNA 序列自由能，使其適合原核表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)。我們采用生物信息學(xué)方法，參照生物軟件Vector NTI Suitor 7.0 對(duì)hEGF 核酸序列進(jìn)行分析和合成，實(shí)現(xiàn)其在原核系統(tǒng)內(nèi)的優(yōu)勢(shì)表達(dá)，表達(dá)量約占菌體總蛋白的15%；同時(shí)，對(duì)rhEGF 包涵體的復(fù)性進(jìn)行了摸索研究，使包涵體的復(fù)性率達(dá)到90%以上。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究hEGF的結(jié)構(gòu)和功能奠定了基礎(chǔ)，也可為獲得重組蛋白在原核系統(tǒng)的高表達(dá)提供借鑒和參考。

[1]路莉,吳勇杰,高明堂,等.重組人表皮生長(zhǎng)生長(zhǎng)因子膠囊對(duì)大鼠慢性胃潰瘍愈合質(zhì)量的影響[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2004,20(1):75-78.

[2]Bloomer C W,Kenyon L,Hammond E,et al.Cyclooxygenase-2(COX-2) and epidermal growth factor receptor expression in human pituitarymacroadenomas[J].Am J Clin Oncol,2003,26(4):75-80.

[3]鄭敏,嚴(yán)莉,黃清松.EGF 在比赤酵母中的表達(dá)及活性測(cè)定[J].解剖學(xué)研究,2013,35(1):36-38.

[4]楊吉吉,李太華.大腸桿菌中外源基因表達(dá)的研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展,2000,28(2):69-72.

[5]Loot M A,Kenter S B,Au F L,et al.Fibroblasts derived from chronic diabetic ulcers differ in their response to stimulation with EGF,IGF-I,BFGF,and PDGF-AB compared to controls[J].Eur J Cell Biol,2002,81(3):153-160.

[6]Ferrer-Soler L,Cedano J,Querol E,et al.Cloning,expression and purification of human epidermal growth factor using different expression systems[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2003,788:113-123.