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        人表皮生長(zhǎng)因子的原核優(yōu)勢(shì)表達(dá)與復(fù)性

        2015-11-29 08:31:44孫衛(wèi)國(guó)楊栗坤熊志紅楊秉芬劉艷華張靈霞
        生物技術(shù)通訊 2015年5期

        孫衛(wèi)國(guó),楊栗坤,熊志紅,楊秉芬,劉艷華,張靈霞

        解放軍第309醫(yī)院 結(jié)核病研究所,全軍結(jié)核病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100091

        人表皮生長(zhǎng)因子(human epidermal growth factor,hEGF)是由53 個(gè)氨基酸殘基組成的單鏈多肽,廣泛存在于人體各種組織內(nèi)。人體內(nèi)EGF含量不足易導(dǎo)致一系列的病理變化,如胃腸道潰瘍病,而補(bǔ)充外源性EGF 能大大縮短慢性胃潰瘍的療程[1]。EGF表達(dá)過(guò)量增加鳥氨酸脫羧酶的活性及多胺水平,也與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[2]。hEGF能促進(jìn)燒傷、創(chuàng)傷及外科傷口的愈合,在燒傷、創(chuàng)傷、皮膚和角膜移植、外傷性皮膚潰瘍等治療中有重要作用。EGF也是某些化妝品的添加劑,具有較大的市場(chǎng)價(jià)值。目前利用原核系統(tǒng)表達(dá)重組hEGF(rhEGF)的主要弊端是表達(dá)量較低,生物活性不高,很難規(guī)?;a(chǎn)。我們根據(jù)原核表達(dá)系統(tǒng)特點(diǎn),優(yōu)化影響rhEGF表達(dá)量的諸多因素,對(duì)基因核酸序列的mRNA 結(jié)構(gòu)、密碼子偏愛(ài)性,表達(dá)宿主菌的生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行綜合考慮,通過(guò)同義密碼子置換合成hEGF 全基因序列,構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-24b-hEGF,獲得hEGF 在原核系統(tǒng)內(nèi)的高表達(dá),其表達(dá)量占菌體總蛋白的15%左右。經(jīng)過(guò)復(fù)性條件的優(yōu)化,包涵體的復(fù)性率達(dá)90%以上,為原核系統(tǒng)規(guī)?;a(chǎn)rhEGF打下了基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        BALB/c3T3 細(xì)胞,大腸桿菌BL21(DE3)和載體pET24b 由本室保存;EGF 標(biāo)準(zhǔn)品由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供;優(yōu)化后的hEGF編碼序列和測(cè)序由北京華大基因生物工程公司合成;酵母提取物、胰蛋白胨購(gòu)自O(shè)xoid 公司;hEGF 抗體購(gòu)自ABcam 公司;酶標(biāo)羊抗兔IgG(HRP 標(biāo)記)購(gòu)自中杉生物工程技術(shù)公司;MTT 購(gòu)自Sigma 公司;親和色譜填料購(gòu)自GE 公司;其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

        1.2 hEGF全基因序列優(yōu)化與合成

        根據(jù)生物軟件對(duì)hEGF可能表達(dá)量的預(yù)測(cè),對(duì)其編碼序列按同義密碼子進(jìn)行全合成,使mRNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)自由能滿足最優(yōu)表達(dá)需要,同時(shí)3′端加入大腸桿菌偏好終止密碼子TAA。合成的全序列為:AACAGCGACTCTGAATGCCCGCTGTCCCACGATGGTTACTGCCT GCATGATGGTGTGTGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTATG CATGCAACTGCGTTGTTGGCTACATCGGTGAGCGTTGCCAGTAC CGTGACCTGAAGTGGTGGGAACTGCGC。

        1.3 hEGF基因克隆與表達(dá)

        對(duì)合成的含有hEGF 全序列載體pUC-hEGF 以限制性內(nèi)切酶NdeⅠ/XhoⅠ于37℃酶切10 h,瓊脂糖膠回收酶切后小片段,與經(jīng)同樣雙酶切的表達(dá)載體pET-24b 在T4DNA 連接酶的作用下于16℃連接4 h,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)后,挑選陽(yáng)性克隆測(cè)序,取測(cè)序結(jié)果同預(yù)期結(jié)果完全一致的菌落保存。將攜帶有hEGF 序列的原核表達(dá)載體命名為pET-24b-hEGF。

        將陽(yáng)性菌落接種含卡那霉素的LB 培養(yǎng)基,37℃振搖過(guò)夜活化后,按1∶100 的比例重新接種LB 培養(yǎng)基,檢測(cè)細(xì)菌的生長(zhǎng)密度,當(dāng)菌液D600nm達(dá)0.4 時(shí),加入IPTG 使其終濃度為0.3 mmol/L,37℃誘導(dǎo)表達(dá)7 h,離心收集沉淀菌體,加入PBS緩沖液混勻,冰浴超聲波破碎,表達(dá)菌液加入5×上樣緩沖液,煮沸后取20 μL 進(jìn)行20% SDS-PAGE,分析目的蛋白在原核系統(tǒng)內(nèi)的表達(dá)量和表達(dá)形式。

        1.4 rhEGF包涵體的復(fù)性與純化

        電泳鑒定rhEGF 在原核系統(tǒng)中以包涵體的形式生成,對(duì)包涵體進(jìn)行初步純化。收集rhEGF 沉淀包涵體,用1%的Triton X-100 洗滌3 次,4℃、5000 r/min 離心10 min;室溫條件下取rhEGF 包涵體,以含8 mol/L 尿素的Tris 緩沖液(50 mmol/L,pH8.8)溶解,高速離心后取溶液上清過(guò)Q Sepharose Fastflow陰離子交換柱,并用含8 mol/L 尿素的Tris 緩沖液(50 mmol/L,pH8.8)+NaCl 進(jìn)行梯度洗脫,分別收集穿過(guò)峰和各洗脫峰蛋白;采用透析復(fù)性的方法對(duì)rhEGF 包涵體進(jìn)行復(fù)性,將純化的包涵體尿素溶液以含5 mmol/L EDTA、0.1 mmol/L GSH、0.1 mmol/L GSSG 的Tris 緩沖液(50 mmol/L,pH8.8)在4℃條件下以1∶20 的體積進(jìn)行透析,12 h 更換透析液一次,透析5 次后以50 mmol/L Tris 緩沖液(pH8.8)透析,整個(gè)透析過(guò)程均沒(méi)有沉淀產(chǎn)生;取透析后復(fù)性的rhEGF進(jìn)行SDS-PAGE分析。

        1.5 rhEGF的Western印跡與活性檢測(cè)

        取純化的rhEGF 行20%的SDS-PAGE,電轉(zhuǎn)移后將硝酸纖維素膜(NC 膜)置于含5%脫脂奶粉的PBS 緩沖液中,室溫封閉1 h,用TBST 漂洗3 次;將NC 膜與兔抗hEGF 抗體(1∶3000 稀釋)于4℃孵育過(guò)夜,用TBST 洗滌3 次,再與適當(dāng)稀釋的酶標(biāo)記的羊抗兔二抗于37℃反應(yīng)1 h,用TBST 洗滌4 次;ECL 暗室中自動(dòng)曝光顯影,驗(yàn)證重組蛋白的抗原性。

        BALB/c3T3 細(xì)胞用RPM1640 培養(yǎng)基培養(yǎng),將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按7×103/孔加入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板,24 h 后更換成含0.5%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h,依次加入用維持培養(yǎng)液稀釋的不同濃度的EGF,每濃度梯度做3 個(gè)平行孔,37℃、5% CO2培養(yǎng)48~72 h,MTT 法檢測(cè)各孔的D490nm值,繪制D490nm-EGF濃度關(guān)系圖[3]。

        2 結(jié)果

        2.1 hEGF原核表達(dá)載體構(gòu)建

        對(duì)含有hEGF 全序列的載體pUC-hEGF 進(jìn)行擴(kuò)增后用NdeⅠ/XhoⅠ雙酶切,回收酶切后的小片段,通過(guò)連接酶克隆到表達(dá)載體pET-24b 中,篩選陽(yáng)性克隆,提取質(zhì)粒pET-24b-hEGF,經(jīng)NdeⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定,10 g/L 瓊脂糖電泳結(jié)果顯示,酶切后生成的條帶位于目標(biāo)大小160 bp處(圖1)。

        2.2 rhEGF的原核表達(dá)

        取測(cè)序正確的含有質(zhì)粒pET-24b-hEGF 的重組大腸桿菌BL21(DE3)接種含卡那霉素的LB培養(yǎng)基,37℃振蕩培養(yǎng),在菌液D600nm值約為0.4 時(shí)加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)7 h,離心收集沉淀,超聲波破碎,20%SDS-PAGE 分析目的蛋白的表達(dá)量和表達(dá)形式。結(jié)果如圖2,在相對(duì)分子質(zhì)量6×103處,誘導(dǎo)后有rhEGF明顯表達(dá),其表達(dá)量占總蛋白的15%以上,且基本以包涵體的形式存在于超聲波后的沉淀中。

        2.3 rhEGF包涵體的復(fù)性與純化

        圖1 pET-24b-hEGF雙酶切產(chǎn)物的瓊脂糖電泳

        對(duì)表達(dá)的rhEGF 包涵體用Triton X-100 洗滌,除去脂類和降解的核酸,然后分別用2、4、6、8 mol/L的尿素溶解。SDS-PAGE 檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在6 mol/L 的尿素溶液里rhEGF 包涵體得到部分溶解,而在8 mol/L的尿素溶液里全部溶解。取變性后的上清液過(guò)Q Sepharose Fastflow 陰離子交換柱,用含8 mol/L 尿素的Tris緩沖液(50 mmol/L,pH8.8)+NaCl進(jìn)行梯度洗脫。當(dāng)鹽濃度為0.4 mol/L 時(shí)洗脫目的蛋白,一步純化的純度達(dá)90%以上。對(duì)洗脫上清透析復(fù)性,整個(gè)透析過(guò)程均沒(méi)有沉淀產(chǎn)生,復(fù)性率達(dá)90%以上。取復(fù)性的rhEGF 經(jīng)SDS-PAGE 分析純度,結(jié)果如圖3,純化復(fù)性后rhEGF的Image軟件掃描純度可達(dá)93%。

        2.4 rhEGF的Western印跡與活性分析

        取純化的rhEGF,經(jīng)SDS-PAGE 后電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上,分別和相應(yīng)的一抗和二抗孵育、洗滌。與ECL 結(jié)合1 min,暗室曝光顯影,結(jié)果如圖4,純化的rhEGF能與其抗體結(jié)合,具有強(qiáng)的抗原性。

        用BALB/c3T3 細(xì)胞通過(guò)MTT 增殖法測(cè)定rhEGF的活性,以生物制品檢定所提供的EGF為陽(yáng)性對(duì)照,陰性對(duì)照為培養(yǎng)液,細(xì)胞接種數(shù)為7×103/孔。結(jié)果如圖5,rhEGF 活性約為2.5×106U/mL。20~160 ng/mL 的rhEGF 對(duì)成纖維細(xì)胞具有明顯的促增殖作用,與標(biāo)準(zhǔn)品表現(xiàn)一致,兩者在統(tǒng)計(jì)學(xué)分析上無(wú)差異。

        3 討論

        圖2 hEGF原核表達(dá)形式的SDS-PAGE分析

        圖3 rhEGF純化后的SDS-PAGE分析

        圖4 rhEGF的Western印跡

        圖5 rhEGF對(duì)BALB/c3T3細(xì)胞的促增殖作用

        諸多因素影響外源基因在原核系統(tǒng)中的表達(dá)效率,如外源基因結(jié)構(gòu)、密碼子偏性、mRNA 翻譯起始區(qū)結(jié)構(gòu),目的蛋白的毒性、氨基酸組成,表達(dá)條件的優(yōu)化等[4]。成熟hEGF 具有廣泛的生理功能,如加速受傷表皮細(xì)胞的修復(fù)和治療胃腸道潰瘍等[5]。目前用原核表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)rhEGF 的表達(dá)量非常低。Ferrer-Soler等利用pET-22b載體獲得了單體rhEGF,但表達(dá)量很低[6]。為了獲得EGF 單體的高表達(dá)量,可對(duì)其氨基酸密碼子進(jìn)行同義置換,改變其mRNA 序列自由能,使其適合原核表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)。我們采用生物信息學(xué)方法,參照生物軟件Vector NTI Suitor 7.0 對(duì)hEGF 核酸序列進(jìn)行分析和合成,實(shí)現(xiàn)其在原核系統(tǒng)內(nèi)的優(yōu)勢(shì)表達(dá),表達(dá)量約占菌體總蛋白的15%;同時(shí),對(duì)rhEGF 包涵體的復(fù)性進(jìn)行了摸索研究,使包涵體的復(fù)性率達(dá)到90%以上。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究hEGF的結(jié)構(gòu)和功能奠定了基礎(chǔ),也可為獲得重組蛋白在原核系統(tǒng)的高表達(dá)提供借鑒和參考。

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