馮瀅瀅 ,張云靜,徐小潔,李玲,郭靖,洪甜,張蓉,趙克,葉棋濃
1.第二炮兵總醫(yī)院 肛腸科,北京 100088;2.軍事醫(yī)學科學院 生物工程研究所,北京 100850
H-Ras 基因首先從人膀胱癌細胞系中被發(fā)現(xiàn),由Der等[1]分離得到。它位于人類第11號染色體,與K-Ras、N-Ras 共同組成Ras 家族。Ras 蛋白屬于小G 蛋白,通過參與細胞信號轉導而調(diào)控細胞分化與增殖[2]。Ras 癌基因與人類腫瘤細胞的發(fā)生與發(fā)展密切相關。H-Ras癌基因正常時可調(diào)控細胞生長路徑,發(fā)生異常時可導致細胞持續(xù)生長以至癌變[3]。因此,探討Ras 基因?qū)ρ芯坎糠帜[瘤的發(fā)生與發(fā)展具有重要意義。
Ras 基因編碼相對分子質(zhì)量約21×103的蛋白,又稱p21 蛋白或Ras 蛋白[4]。H-Ras、K-Ras、N-Ras的氨基酸序列有85%的同源性,N端1~165位氨基酸殘基高度保守,165~189/188位氨基酸殘基存在高度差異,從而導致其功能的差異[5]。研究發(fā)現(xiàn),K-Ras、N-Ras、H-Ras 在不同腫瘤細胞系中的表達不同,其功能也不盡相同?;诖苏J識,我們擬將H-Ras 基因片段化,分別構建H-Ras(1-165)和H-Ras(165-189)的原核表達載體,為下一步深入研究H-Ras 基因奠定基礎。
大腸桿菌DH5α、Rossate,原核表達載體pGEXKG,質(zhì)粒Myc-H-Ras由軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所保存;限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ、T4DNA 連接酶購自TaKaRa 公司;GST-Sepharose 4B購自Pharmacia 公司;引物由北京賽百盛生物技術公司合成;測序由北京奧科生物技術有限責任公司完成。
以人Myc-H-Ras 質(zhì)粒為模板,根據(jù)文獻報道的人H-Ras(1-165)序列合成上游引物(5'-CGGGAT CCATGACGGAATATAAGCTGGTGGTG-3')和下游引物(5'-CCGCTCGAGTCACTGCCGGATCTCACGC ACCAAC-3'),按以下條件擴增H-Ras(1-165)編碼區(qū):95℃ 5 min;95℃ 30 s,58℃ 60 s,72℃ 30 s,30個循環(huán);72℃延長7 min。
以人Myc-H-Ras 質(zhì)粒為模板,根據(jù)文獻報道的人H-Ras(165-189)序列合成上游引物(5'-CGGGA TCCCACAAGCTGCGGAAGCTGAAC-3')和下游引物(5'-CCGCTCGAGTCAGGAGAGCACACACTTGCAG C-3'),按以下條件擴增H-Ras(165-189)編碼區(qū):95℃5 min;95℃30 s,58℃60 s,72℃20 s,30 個循環(huán);72℃延長7 min。
用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切pGEX-KG 載體,經(jīng)10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳后,膠回收載體大片段;將PCR 片段回收后再用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切,形成帶有黏端的雙鏈,用T4DNA 連接酶連接入pGEXKG 載體,轉化大腸桿菌DH5α,挑選克隆,培養(yǎng)并提質(zhì)粒,用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定,酶切鑒定正確的克隆送北京奧科生物公司測序。
將鑒定正確的重組表達質(zhì)粒轉化大腸桿菌Rossate 感受態(tài)細胞,挑取菌落,37℃振蕩培養(yǎng)至D600nm為0.6~1.0,加入IPTG 至終濃度為1 mmol/L,37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h,離心收集菌體,進行Western印跡檢測。
將含pGEX-KG-H-Ras(1-165)、pGEX-KG-HRas(165-189)和pGEX-KG 的大腸桿菌Rossate 分別接種于含氨芐西林的LB 液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)過夜活化,按10%的比例轉種于同種液體培養(yǎng)基中,30℃振蕩培養(yǎng)至D600nm為0.4~0.6,加入IPTG 至終濃度為0.1 mmol/L,20℃繼續(xù)培養(yǎng)16 h,離心收集菌體,按Pharmacia 公司提供的方法進行GST 融合蛋白的純化:加入裂解液,超聲波破碎,收集上清,加入適量GST-Sepharose 4B 結合4 h,離心收集GST-Sepharose 4B 小顆粒,充分洗脫未結合蛋白質(zhì),用還原性谷胱甘肽小量多次地將GST-H-Ras(1-165)、GST-H-Ras(165-189)從珠子上逐漸洗脫,最后以SDS-PAGE鑒定純化與洗脫的蛋白。
以Myc-H-Ras 質(zhì)粒為模板擴增H-Ras(1-165)和H-Ras(165-189)的編碼區(qū),獲得大小分別約為500和100 bp的PCR產(chǎn)物,與預期一致(圖1)。
將2 種PCR 產(chǎn)物用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后分別與經(jīng)相同雙酶切的pGEX-KG載體連接,轉化大腸桿菌DH5α,挑選陽性克隆提質(zhì)粒,經(jīng)酶切鑒定,凝膠電泳可分別見約500 和100 bp 的條帶(圖2),表明H-Ras(1-165)、H-Ras(165-189)基因的編碼序列已分別插入pGEX-KG 上游的多克隆位點中。DNA 序列測定結果顯示與已知序列完全一致,無突變發(fā)生(數(shù)據(jù)略)。
將鑒定正確的重組表達質(zhì)粒轉化大腸桿菌Rossate感受態(tài)細胞,經(jīng)過小量誘導后收集菌體,Western印跡檢測發(fā)現(xiàn)GST-H-Ras(1-165)、GST-H-Ras(165-189)融合蛋白獲得正確表達(圖3)。
圖1 目的基因的PCR擴增
融合蛋白經(jīng)GST-Sepharose 4B 親和珠純化、還原性谷胱甘肽小量多次洗脫、考馬斯亮藍染色,結果顯示獲得一定量的純度較高的GST-H-Ras(1-165)和GST-H-Ras(165-189)蛋白(圖4)。
圖2 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定
圖3 融合蛋白的Western印跡
圖4 融合蛋白純化并洗脫后的SDS-PAGE分析
自1982 年Weinberg 等發(fā)現(xiàn)人的膀胱癌細胞中有活化的H-Ras 基因后,Ras 基因家族H-Ras、KRas 和N-Ras 相繼被發(fā)現(xiàn),分別定位于11、12 和1 號染色體上。Ras 基因的編碼產(chǎn)物是具有GTP 結合作用和GTP酶活性的G蛋白,位于細胞膜內(nèi)側,能夠傳遞生長信號,結合GTP 時為活化狀態(tài),而結合GDP時為失活狀態(tài),正常狀態(tài)下Ras蛋白與GDP 結合,參與Ras/RAF/MEK/ERK/MAPK 途徑的信號傳導[6]。Ras基因最常見的激活方式為點突變,約30%的人類惡性腫瘤存在Ras 基因的點突變,常見的突變位點是12、13、61位密碼子,其中又以第12位密碼子突變最為常見[7]。不同類型腫瘤中存在不同的Ras 基因突變。膀胱癌和甲狀腺癌常見H-Ras基因突變。一旦Ras 基因激活,導致其GTPase 活性下降或Ras 蛋白構型改變從而與GTP 結合后,不需外界生長信號的刺激,便保持持續(xù)活化狀態(tài),激活下游MAPK 級聯(lián)反應,導致細胞大量增殖,凋亡減少,細胞惡性轉化。此外,正常的Ras 基因也可因過度表達而誘導惡性轉化[8]。最近的研究發(fā)現(xiàn)Ras 激活還能調(diào)控細胞周期,促進血管內(nèi)皮生長因子的表達,從而促進血管生成,與細胞自噬、細胞能量代謝也存在一定的關系[9-10]。不僅如此,Ras 的突變還與腸癌患者表皮生長因子受體單克隆抗體(西妥昔單抗)的耐藥密切相關[11]。所以,構建原核表達載體GST-H-Ras,有助于進一步了解H-Ras在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用。
Ras蛋白家族具有高度特異性和同源性[12],所有的Ras家族成員的基因編碼區(qū)都有5個外顯子,其中1個外顯子不編碼蛋白質(zhì),因為前165位氨基酸殘基序列無種屬間差別且高度保守。Ras 家族3 個高度同源的亞型的不同生物學功能主要歸于C 端高度變異區(qū)的不同序列,這后25位氨基酸殘基(166~188/9)是它們之間惟一不同的區(qū)域,也包含著Ras 與細胞膜內(nèi)信號聯(lián)系的必要蛋白序列[5]。
綜上,我們以人Myc-H-Ras 質(zhì)粒為模板擴增了H-Ras(1-165)和H-Ras(166-189)編碼序列,首次將H-Ras 基因片段化,構建出上述2 個片段的原核表達載體,并表達、純化得到純度較高的重組蛋白GST-H-Ras(1-165)和GST-H-Ras(165-189),為后續(xù)研究H-Ras 片段與其他癌/抑癌蛋白之間的相互作用,深入探討其致癌機制奠定了實驗基礎。
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