李倩，孫鵬，楊建林，曹春雨，王艷林

三峽大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443002

鼠黑色素瘤相關(guān)抗原（melanoma antigen recognized by T-cells 1，MART1）又稱Melan-A，主要存在于正常黑色素細(xì)胞或惡性黑色素腫瘤細(xì)胞中。作為一種特征性黑素瘤腫瘤抗原，MART1 的表達(dá)異常與惡性黑色素瘤發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)[1-2]。最新研究表明，MART1 中的抗原肽能夠被T 淋巴細(xì)胞識(shí)別并激發(fā)強(qiáng)烈的CTL 反應(yīng)，提示MART1在黑色素瘤特異性免疫治療中潛在的應(yīng)用價(jià)值[3-6]。我們擬在大腸桿菌中原核表達(dá)和純化MART1蛋白，并以此為抗原制備高效價(jià)的兔抗鼠多克隆抗體，以為MART1在抗腫瘤免疫治療中的應(yīng)用研究提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

日本大耳白兔（雄性，2 kg）購自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；鼠黑色素瘤B16-F1 細(xì)胞株、大腸桿菌Rosseta（DE3）、質(zhì)粒載體pET32a 為本實(shí)驗(yàn)室保存；TRIzol 總RNA 純化試劑由Introvogen 公司提供；TaqDNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶由Thermo 公司提供，Ni-NTA蛋白純化樹脂購于Qiagen公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、抗β-actin 和抗His 標(biāo)簽單抗購自Sigma 公司；Rodamine 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 為北京中杉金橋公司產(chǎn)品；HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 多克隆抗體購自武漢博士德公司；PCR 引物合成及DNA測(cè)序由上海生工生物工程技術(shù)有限公司完成。

1.2 RT-PCR克隆小鼠MART1 cDNA

用TRIzol 試劑提取小鼠B16-F1 黑素瘤細(xì)胞總RNA，以該RNA 為模板、Oligo（dT）為引物，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV 催化，將mRNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 第一鏈，再以此cDNA 第一鏈為模板，用PCR 技術(shù)擴(kuò)增出MART1 雙鏈DNA 編碼序列。PCR 上下游引物序列分別為5'-CGGAATTCATGCCCCAAGAAGACACAT TCA-3'和5'-AGCAAGCTTTCTCAGGGTGAATAAG GTGG-3'，在上下游引物的5'端分別引入酶切位點(diǎn)EcoRⅠ和HindⅢ（引物序列中下劃線部分）以便隨后的克隆操作。PCR 產(chǎn)物經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切后克隆入pET32a 原核表達(dá)載體，用酶切和DNA測(cè)序鑒定所得重組質(zhì)粒pET32a-MART1 中插入DNA序列和方向的正確性。

1.3 MART1的原核表達(dá)、純化及鑒定

用質(zhì)粒pET32a-MART1 轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosseta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)至細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)，加入IPTG 至終濃度為0.3 mmol/L，誘導(dǎo)細(xì)菌表達(dá)重組蛋白5 h；離心收集誘導(dǎo)后的菌體，用裂解緩沖液（10 μmol/L 咪 唑，300 mmol/L NaCl，50 mmol/L NaH2PO4）重懸沉淀，超聲波裂解后取上清，上清中的MART1 重組蛋白用Ni-NTA 樹脂親和層析分離，咪唑濃度梯度洗脫獲得初步純化的MART1重組蛋白，再用制備性PAGE 進(jìn)一步純化。用Western 印跡鑒定MART1 重組蛋白：樣品經(jīng)SDS-PAGE 分離后電轉(zhuǎn)至PVDF膜，膜用5%脫脂牛奶封閉1 h，與1∶1000稀釋的鼠源His 標(biāo)簽抗體共孵育，低速搖床上4℃過夜，再與1∶5000 稀釋的HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG 室溫共孵育1 h，ECL顯影指示目標(biāo)蛋白。

1.4 MART1多克隆抗體的制備

用純化的MART1 蛋白免疫雄性日本大耳白兔。首次免疫劑量500 μg/只，與等量弗氏完全佐劑混合后于脊柱兩旁皮下注射；間隔10 d 后進(jìn)行第二次免疫，注射劑量為100 μg/只，與等量弗氏不完全佐劑混合后皮下注射；10 d 后同樣方法進(jìn)行第三次免疫；第三次免疫1周后頸靜脈取血，分離血清。

1.5 ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)

以純化的MART1 蛋白（2 μg/孔）為包被抗原，一抗為本實(shí)驗(yàn)中制備的梯度稀釋的兔抗血清，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶5000稀釋），TMB顯色，全波長酶標(biāo)儀檢測(cè)光密度（D450nm）。

1.6 Western印跡檢測(cè)抗體的特異性

蛋白樣品包括IPTG 誘導(dǎo)前、后的大腸桿菌菌液，純化的MART1 蛋白和B16-F1 細(xì)胞裂解液。上述樣品經(jīng)SDS-PAGE 分離后電轉(zhuǎn)至PVDF 膜，膜用5%脫脂牛奶封閉后，先后與本實(shí)驗(yàn)自制的兔抗血清（1∶3000 稀釋）和HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶5000 稀釋）共孵育，ECL顯影指示目標(biāo)蛋白。

1.7 制備抗體用于免疫熒光染色

將B16-F1 細(xì)胞接種于事先放置有蓋玻片的6孔板中制備細(xì)胞爬片，培養(yǎng)24 h 后用40 g/L 多聚甲醛于4℃固定15 min，經(jīng)5 mL/L TxitonX-100 透化處理15 min，10 mL/L山羊血清37℃封閉30 min，然后分別與本實(shí)驗(yàn)制備的MART1抗血清（1∶500稀釋）和陰性對(duì)照（1×PBS 取代一抗）37℃共孵育2 h，加入羅丹明標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶100 稀釋），37℃避光孵育30 min，熒光倒置顯微鏡下觀測(cè)并記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 鼠MART1 編碼cDNA 的克隆與原核表達(dá)載體構(gòu)建

如1.2所述方法構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a-MART1，重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切，獲得的限制性片段長度與理論預(yù)期一致（圖1），DNA 測(cè)序證實(shí)pET32a-MART1 中插入的DNA 序列、方向及讀框之間的對(duì)接均無誤。

2.2 MART1重組蛋白的原核表達(dá)、純化及鑒定

將重組質(zhì)粒pET32a-MART1轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosseta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞并用IPTG 誘導(dǎo)5 h 后，SDSPAGE 分析顯示誘導(dǎo)后的細(xì)菌中有一新生蛋白條帶出現(xiàn)，其分子大小與MART1重組蛋白預(yù)期相對(duì)分子質(zhì)量一致（圖2）。該蛋白可經(jīng)Ni-NTA 樹脂親和層析及切膠回收方法有效純化。Western 印跡分析證實(shí)該融合蛋白能與His標(biāo)簽抗體特異性結(jié)合（圖3）。

2.3 抗MART1抗體的制備及效價(jià)鑒定

用上述實(shí)驗(yàn)純化所得重組MART1 蛋白作為抗原免疫日本大耳白兔，經(jīng)3 次皮下注射后，獲取免疫后的兔血清并用ELISA 法分析制備抗體的滴度和特異性。

用上述純化的同一批次的MART1 蛋白包被ELISA 檢測(cè)板，將抗體梯度稀釋（每個(gè)稀釋度設(shè)3 個(gè)復(fù)孔）后進(jìn)行抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)，以高出對(duì)照血清D450nm值2.1 倍的制備血清抗體的最高稀釋度為抗體滴度。結(jié)果如圖4，本實(shí)驗(yàn)所制備抗體的滴度為1∶1 024 000。

2.4 Western印跡鑒定制備抗體的特異性

Western 印跡結(jié)果顯示，制備的抗體能有效識(shí)別和結(jié)合原核表達(dá)的MART1 蛋白，在相對(duì)分子質(zhì)量23×103處出現(xiàn)明顯的特異性反應(yīng)條帶，其分子大小與預(yù)期一致（圖5）。另外，用16-F1細(xì)胞裂解液作為樣品進(jìn)行的分析也能檢測(cè)出特異性條帶，表明本實(shí)驗(yàn)制備的抗體能與真核細(xì)胞表達(dá)的MART1 抗原特異性結(jié)合（圖5）。

圖1 pET32a-MART1質(zhì)粒的酶切鑒定

圖2 SDS-PAGE分析原核表達(dá)及純化的重組MART1

圖3 Western印跡分析原核表達(dá)和純化的MART1重組蛋白

同時(shí)，還用免疫熒光染色法檢測(cè)了制備抗體的特異性。制備B16-F1細(xì)胞爬片后，先后與制備抗體（一抗）和羅丹明標(biāo)記的羊抗兔IgG（二抗）共孵育，然后在熒光顯微鏡下分析結(jié)果。結(jié)果顯示，制備抗體可以有效識(shí)別B16-F1細(xì)胞中的MART1蛋白（圖6）。

3 討論

為獲得大量可用作免疫抗原的小鼠MART1 蛋白，我們利用基因克隆技術(shù)將小鼠MART1基因全長編碼序列克隆到pET32a載體中，DNA 雙向測(cè)序證實(shí)構(gòu)建的pET32a-MART1 重組質(zhì)粒中外源DNA 片段插入方向及其與質(zhì)粒中6×His 標(biāo)簽編碼序列框架對(duì)接無誤，無移碼突變、堿基缺失等。在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)中，IPTG 能高效誘導(dǎo)MART1 重組蛋白表達(dá)。由于重組蛋白N 端帶有6×His 標(biāo)簽，我們用Ni-NTA 樹脂親和層析法純化MART1 重組蛋白。為得到更高純度的MART1 重組蛋白，我們將Ni-NTA 樹脂純化所得的蛋白樣品用制備性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)一步純化。

圖4 ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)

圖5 Western印跡檢測(cè)抗體的特異性

圖6 細(xì)胞免疫熒光分析制備抗體的特異性（×400）

為獲得抗MART1的多克隆抗體，我們利用上述純化的MART1 重組蛋白作為抗原免疫日本大耳白兔，經(jīng)1 次啟動(dòng)免疫和2 次強(qiáng)化免疫后，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)獲得高效價(jià)的抗MART1 多克隆抗體。經(jīng)免疫印跡和細(xì)胞免疫熒光法分析證實(shí)，該抗體能有效識(shí)別和結(jié)合原核及真核細(xì)胞中表達(dá)的MART1蛋白，具有良好的特異性。

綜上所述，我們建立了小鼠MART1蛋白原核表達(dá)和純化技術(shù)，制備出的高效價(jià)和特異性抗MART1多克隆抗體將為黑色素瘤的防治研究提供技術(shù)支撐。

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