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        冷誘導(dǎo)RNA 結(jié)合蛋白在急性腦外傷后的表達(dá)變化及其促炎作用研究

        2015-11-29 08:31:40劉雨瀟劉文佳蘇寧張志文薛菁輝
        生物技術(shù)通訊 2015年5期
        關(guān)鍵詞:腦外傷腦損傷腦組織

        劉雨瀟,劉文佳,蘇寧,張志文,薛菁輝

        1.解放軍總醫(yī)院 第一附屬醫(yī)院,北京 100048;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所,北京 100071

        急性腦外傷是神經(jīng)系統(tǒng)的常見疾病,具有較高的致死率,且容易引發(fā)多種腦損傷后遺癥如偏癱、癲癇、失語等,給病人及其家庭帶來了極大的痛苦。急性創(chuàng)傷后的損傷修復(fù)一直是神經(jīng)科學(xué)研究的難點(diǎn)。因此,深入研究腦外傷的致病機(jī)制,提高該疾病的臨床診治水平具有重要意義。冷誘導(dǎo)RNA 結(jié)合蛋白(cold-inducible RNA binding protein,CIRP)是冷激蛋白家族成員,該蛋白包含一個(gè)N 端共有序列RNA結(jié)合域(consensus sequence RNA-binding domain,CS-RBD)和一個(gè)C 端富甘氨酸結(jié)構(gòu)域[1]。CIRP 的核酸及氨基酸組成在種間具有高度的保守性和較高的同源性,人與小鼠CIRP CS-RBD 序列的相同性達(dá)99%,富甘氨酸結(jié)構(gòu)域序列相同性達(dá)91%。CIRP 在動(dòng)物的腦、肺、腎臟、肝臟、胃、結(jié)腸等組織中結(jié)構(gòu)性低表達(dá),并在應(yīng)激原的誘導(dǎo)下表達(dá)升高,廣泛參與低溫保護(hù)、神經(jīng)及胚胎發(fā)育等一系列生物學(xué)過程,是一種重要的生理活性物質(zhì)[2-3]。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)CIRP 對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷修復(fù)具有調(diào)控作用[4]。腫瘤壞死因子α(TNFα)是一種單核因子,主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,在炎癥的發(fā)生過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。本研究中,我們著重觀察CIRP 在急性腦外傷發(fā)病過程中的表達(dá)變化,以及該分子與炎癥因子TNFα之間的關(guān)系,探討其在腦外傷發(fā)病過程中的作用,為該疾病的治療提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        健康成年雄性昆明白小鼠46 只,體重20~25 g,由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物于常溫下飼養(yǎng),自由進(jìn)食飲水。隨機(jī)分為正常組(n=10)、手術(shù)組(n=36)。

        10%水合氯醛、2%鹽酸利多卡因、0.9%氯化鈉注射液(武漢博士德公司);牙托粉和牙托膠(上海齒科材料廠);兔抗CIRP 多克隆抗體(美國CST 公司);TRIzol試劑(Invitrogen 公司);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物公司);液壓顱腦損傷儀(美國NEWSUN公司)。

        1.2 小鼠急性腦損傷模型的制作

        用10%水合氯醛麻醉動(dòng)物,將其頭部固定在立體定向儀上,固定過程中要求人字縫與前囟保持水平;沿中線切開頭皮及皮下組織,充分暴露前囟和人字縫,選擇前囟后2 mm、矢狀縫右側(cè)2 mm 作為圓心,用磨鉆鉆直徑2 mm 的骨孔磨,須保持硬膜完整;清潔骨窗邊緣,采用和好的牙科水門汀連接連接管,并用生理鹽水注滿連接管,以排出連接管內(nèi)氣泡;將連接管接入液壓打擊儀打擊口,將打擊力度調(diào)整到1.8~2.0 atm 以造成重度腦外傷,液壓瞬間打擊到暴露的硬膜上,打擊壓力由外接壓力傳感器記錄。

        1.3 實(shí)時(shí)PCR檢測CIRP和TNFα mRNA的表達(dá)

        分別于損傷后24及48 h脫頸處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)18只實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物、5只正常組動(dòng)物),TRIzol法提取每個(gè)時(shí)間點(diǎn)9 只小鼠損傷部位腦組織及3 只正常小鼠相同腦區(qū)RNA,反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA 模板,進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增。

        20 μL 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測體系包括1×Real Master Mix,1×SYBR Green,CIRP基因的上、下游引物各1 μL(5 pmol)及1 μL 模板。以β-actin基因作為內(nèi)參照,每樣品均做3 個(gè)復(fù)孔,以不加模板為空白對(duì)照。反應(yīng)條件:94℃5 min 預(yù)變性;94℃30 s,52℃ 30 s,72℃ 40 s,30 個(gè)循環(huán);72℃延 伸10 min。擴(kuò)增后獲得各組Ct 值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,用基于ΔΔCt方法進(jìn)行相對(duì)定量分析,基因表達(dá)差異為2ΔΔCt,ΔΔCt=ΔCt樣品-ΔCt參考基因。

        β-actin上游引物為5′GATCCACATCTGCTGG AAGG3′,下游引物為5′AAGTGTCGTTGACATCCG 3′;TNFα上游引物為5′CCTGTAGCCCACGTCGTAG 3′,下游引物為5′GGGAGTAGACAAGGTACAACCC 3′;CIRP上游引物為5′GGACTCAGCTTCGACACCA AC3′,下游引物為5′ATGGCGTCCTTAGCGTCATC3′。

        1.4 大腦標(biāo)本的HE染色

        另取24、48 h 時(shí)間點(diǎn)9 只實(shí)驗(yàn)組、2 只正常組小鼠制備大腦標(biāo)本。實(shí)驗(yàn)鼠用2%水合氯醛腹腔注射麻醉、4%多聚甲醛心臟灌注后取出腦組織,將腦組織置于4%多聚甲醛中固定48 h后進(jìn)行石蠟包埋及切片,切片厚度為8 μm。

        石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、水合后,將已入蒸餾水后的切片放入蘇木精水溶液中染色數(shù)分鐘,酸水及氨水中分色各數(shù)秒鐘,流水沖洗1 h 后入蒸餾水片刻,入70%和90%酒精中脫水各10 min,入酒精伊紅染色液染色2~3 min,梯度乙醇脫水、二甲苯透明后封片觀察。

        1.5 大腦標(biāo)本的免疫組化檢測

        采用間接免疫熒光法檢測損傷及正常大腦組織中人特異抗原CIRP的表達(dá)水平,一抗工作濃度為1∶200。石蠟切片脫蠟至水,用3% H2O2室溫孵育5~10 min,以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性;蒸餾水沖洗,PBS 浸泡2 次,每次5 min;用5%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉,室溫孵育10 min,傾去血清,勿洗;滴加一抗工作液,37℃孵育1~2 h 或4℃過夜;PBS沖洗3 次,每次5 min;滴加適量生物素標(biāo)記二抗工作液,37℃孵育10~30 min;PBS 緩沖液沖洗3 次,每次5 min;滴加適量辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液,37℃孵育30 min;PBS緩沖液沖洗3次,每次5 min;顯色劑顯色3~15 min,自來水充分沖洗,復(fù)染,脫水,透明,封片。

        1.6 統(tǒng)計(jì)分析

        采用Student′st檢驗(yàn)分析損傷后不同時(shí)間點(diǎn)損傷腦組織與正常腦組織CIRP 表達(dá)水平的差異,P<0.05 表示差異顯著;采用統(tǒng)計(jì)軟件Graphpad prism 6分析CIRP表達(dá)水平與TNFα表達(dá)水平的相關(guān)性。

        2 結(jié)果

        2.1 建立小鼠急性腦損傷模型

        對(duì)照組小鼠大腦左右對(duì)稱,未見明顯病理變化。液壓打擊可導(dǎo)致小鼠大腦急性損傷,損傷程度與范圍隨打擊力度增大而增大。液壓打擊后,可觀察到小鼠大腦皮層、蛛網(wǎng)膜下腔及腦挫裂傷灶周圍出血,損傷越重,出血越明顯。傷后數(shù)小時(shí),大腦挫裂傷灶逐漸形成壞死空洞。24 h 可見傷側(cè)腦組織蒼白、損傷部位組織水腫,壞死灶明顯。此外,行為學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)手術(shù)組小鼠出現(xiàn)偏癱、行動(dòng)困難等癥狀。HE 染色結(jié)果顯示,急性腦損傷48 h 后大腦局部出現(xiàn)明顯的組織缺損;小鼠在打擊部位白質(zhì)內(nèi)可見大量神經(jīng)元壞死、膠質(zhì)細(xì)胞增生和空洞樣結(jié)構(gòu)形成;空洞位于原出血區(qū),呈類圓形,周圍有增生的膠質(zhì)細(xì)胞包繞(圖1)。

        2.2 免疫組化染色觀察

        建模48 h 后,免疫組化染色觀察CIRP 蛋白在損傷部位的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),損傷側(cè)大腦組織標(biāo)本中可以觀察到更多CIRP 陽性細(xì)胞,呈黃色或淡黃色,染色陰性的神經(jīng)元細(xì)胞核經(jīng)蘇木精復(fù)染呈藍(lán)色,與正常大腦相比損傷大腦CIRP 陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加(圖2)。

        2.3 損傷后不同時(shí)間點(diǎn)CIRP mRNA表達(dá)水平檢測

        以正常大腦為對(duì)照,采用實(shí)時(shí)PCR 方法檢測損傷后不同時(shí)間點(diǎn)大腦損傷部位CIRP 的表達(dá)變化情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)急性腦損傷24 及48 h 后CIRP 的表達(dá)持續(xù)升高,與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。

        2.4 損傷后不同時(shí)間點(diǎn)炎癥因子TNFα mRNA 表達(dá)水平檢測

        采用實(shí)時(shí)PCR 方法,在大腦急性損傷后不同時(shí)間點(diǎn)檢測炎癥因子TNFα的表達(dá)變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常腦組織相比,TNFα在大腦損傷后顯著增多,提示腦損傷會(huì)誘導(dǎo)炎癥因子的分泌(圖4)。

        圖1 小鼠缺急性腦外傷模型的建立

        圖2 正常大腦及腦損傷后48 h后觀察CIRP在腦內(nèi)的表達(dá)情況

        2.5 急性損傷后腦組織中CIRP 的變化與TNFα表達(dá)水平的關(guān)系

        為了進(jìn)一步研究CIRP 在大腦損傷修復(fù)過程中的作用,我們利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析了CIRP 的變化與TNFα表達(dá)水平之間的關(guān)系,結(jié)果表明大腦急性損傷后,腦組織中CIRP 的表達(dá)量與炎癥因子TNFα的表達(dá)水平存在線性關(guān)系,TNFα的表達(dá)水平隨著CIRP表達(dá)量的增高而增高,兩者具有線性相關(guān)。

        3 討論

        圖3 實(shí)時(shí)PCR檢測急性腦損傷后不同時(shí)間點(diǎn)CIRP的表達(dá)

        圖4 實(shí)時(shí)PCR檢測急性腦損傷后不同時(shí)間點(diǎn)CIRP的表達(dá)

        圖5 CIRP與TNFα mRNA表達(dá)水平相關(guān)性分析

        流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)急性腦外傷是交通事故、高空墜落等公共突發(fā)事件引發(fā)的常見病。我國急性腦外傷的發(fā)生率可占城市傷亡病總數(shù)的60%,該疾病容易導(dǎo)致永久性殘疾和死亡,是嚴(yán)重影響人類生命健康的疾病之一[5-6]。創(chuàng)傷后腦組織的損傷修復(fù)對(duì)病人生活能力的改善至關(guān)重要。在臨床治療過程中,腦組織的創(chuàng)傷越嚴(yán)重,修復(fù)越困難。然而目前腦外傷發(fā)展過程中的調(diào)節(jié)機(jī)制還不明確。因此,建立適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型,研究調(diào)控腦外傷損傷修復(fù)的分子機(jī)制,對(duì)臨床具有指導(dǎo)意義。

        建立穩(wěn)定的動(dòng)物模型是腦外傷致病機(jī)理研究的基礎(chǔ)。理想的腦外傷模型應(yīng)具備以下特點(diǎn):①具有良好的重復(fù)性,即采用相同方法制作出的模型具有相近程度的腦損傷;②具有良好的臨床指導(dǎo)性,動(dòng)物模型的損傷與所要研究的人類腦損傷具有相似的特征;③實(shí)驗(yàn)因素的可控性,即打擊力度與大腦損傷程度線性相關(guān),可通過對(duì)打擊力的控制來控制動(dòng)物腦損傷的程度;④操作簡單易行。20 世紀(jì)以來,研究者采用多種方法建立了腦創(chuàng)傷動(dòng)物模型,其中包括液壓打擊腦損傷模型、慣性加速腦損傷模型、固定沖擊損傷模型、落重法閉合性腦損傷模型等[7-9]。有研究者比較上述模型后,認(rèn)為采用液壓打擊法制作腦損傷模型操作簡單、重復(fù)性好,可以很好地模擬臨床復(fù)制出局灶性和彌漫性損傷[10]。小鼠具有與人類相似的基因序列,容易進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作,是制作小動(dòng)物腦損傷模型的最常用動(dòng)物之一。因此,本研究以成年小鼠作為研究對(duì)象,采用液壓打擊法穩(wěn)定制作出小鼠腦外傷模型,打擊后的小鼠出現(xiàn)明顯的腦外傷癥狀,且損傷程度與打擊強(qiáng)度正相關(guān)。

        我們?cè)谇捌诠ぷ髦邪l(fā)現(xiàn),在缺血再灌注模型中CIRP 隨著損傷時(shí)間的推移表達(dá)升高,然而CIRP 的表達(dá)與腦中能量代謝無線性關(guān)系[11]。2014 年,Zhou等研究發(fā)現(xiàn)在腦缺血模型中CIRP 促進(jìn)了大腦的炎癥反應(yīng)[12]。本研究中首次利用實(shí)時(shí)PCR 及免疫組化法觀察了CIRP 在急性腦損傷中的表達(dá)變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)大腦損傷部位的CIRP 表達(dá)持續(xù)升高。為了進(jìn)一步研究CIRP 表達(dá)與大腦炎癥之間的關(guān)系,我們檢測了同一時(shí)間點(diǎn)炎癥因子TNFα的表達(dá)水平,并分析了TNFα表達(dá)變化與CIRP 之間的關(guān)系,結(jié)果表明CIRP表達(dá)水平與TNFα表達(dá)水平呈線性相關(guān)。本研究進(jìn)一步證實(shí)了CIRP 對(duì)炎癥反應(yīng)促進(jìn)作用,與Zhou 等的研究結(jié)果一致。

        盡管取得了上述進(jìn)展,CIRP 發(fā)揮作用的具體機(jī)制尚不明確,有待深入研究。相信大腦損傷修復(fù)研究的不斷深入,會(huì)在不久的將來為創(chuàng)傷性腦外傷的治療帶來新的希望。

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