劉雨瀟，劉文佳，蘇寧，張志文，薛菁輝

1.解放軍總醫(yī)院 第一附屬醫(yī)院，北京 100048；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100071

急性腦外傷是神經(jīng)系統(tǒng)的常見疾病，具有較高的致死率，且容易引發(fā)多種腦損傷后遺癥如偏癱、癲癇、失語等，給病人及其家庭帶來了極大的痛苦。急性創(chuàng)傷后的損傷修復(fù)一直是神經(jīng)科學(xué)研究的難點(diǎn)。因此，深入研究腦外傷的致病機(jī)制，提高該疾病的臨床診治水平具有重要意義。冷誘導(dǎo)RNA 結(jié)合蛋白（cold-inducible RNA binding protein，CIRP）是冷激蛋白家族成員，該蛋白包含一個(gè)N 端共有序列RNA結(jié)合域（consensus sequence RNA-binding domain，CS-RBD）和一個(gè)C 端富甘氨酸結(jié)構(gòu)域[1]。CIRP 的核酸及氨基酸組成在種間具有高度的保守性和較高的同源性，人與小鼠CIRP CS-RBD 序列的相同性達(dá)99%，富甘氨酸結(jié)構(gòu)域序列相同性達(dá)91%。CIRP 在動(dòng)物的腦、肺、腎臟、肝臟、胃、結(jié)腸等組織中結(jié)構(gòu)性低表達(dá)，并在應(yīng)激原的誘導(dǎo)下表達(dá)升高，廣泛參與低溫保護(hù)、神經(jīng)及胚胎發(fā)育等一系列生物學(xué)過程，是一種重要的生理活性物質(zhì)[2-3]。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)CIRP 對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷修復(fù)具有調(diào)控作用[4]。腫瘤壞死因子α（TNFα）是一種單核因子，主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，在炎癥的發(fā)生過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。本研究中，我們著重觀察CIRP 在急性腦外傷發(fā)病過程中的表達(dá)變化，以及該分子與炎癥因子TNFα之間的關(guān)系，探討其在腦外傷發(fā)病過程中的作用，為該疾病的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

健康成年雄性昆明白小鼠46 只，體重20～25 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物于常溫下飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。隨機(jī)分為正常組（n=10）、手術(shù)組（n=36）。

10%水合氯醛、2%鹽酸利多卡因、0.9%氯化鈉注射液（武漢博士德公司）；牙托粉和牙托膠（上海齒科材料廠）；兔抗CIRP 多克隆抗體（美國CST 公司）；TRIzol試劑（Invitrogen 公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連寶生物公司）；液壓顱腦損傷儀（美國NEWSUN公司）。

1.2 小鼠急性腦損傷模型的制作

用10%水合氯醛麻醉動(dòng)物，將其頭部固定在立體定向儀上，固定過程中要求人字縫與前囟保持水平；沿中線切開頭皮及皮下組織，充分暴露前囟和人字縫，選擇前囟后2 mm、矢狀縫右側(cè)2 mm 作為圓心，用磨鉆鉆直徑2 mm 的骨孔磨，須保持硬膜完整；清潔骨窗邊緣，采用和好的牙科水門汀連接連接管，并用生理鹽水注滿連接管，以排出連接管內(nèi)氣泡；將連接管接入液壓打擊儀打擊口，將打擊力度調(diào)整到1.8～2.0 atm 以造成重度腦外傷，液壓瞬間打擊到暴露的硬膜上，打擊壓力由外接壓力傳感器記錄。

1.3 實(shí)時(shí)PCR檢測CIRP和TNFα mRNA的表達(dá)

分別于損傷后24及48 h脫頸處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（每個(gè)時(shí)間點(diǎn)18只實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物、5只正常組動(dòng)物），TRIzol法提取每個(gè)時(shí)間點(diǎn)9 只小鼠損傷部位腦組織及3 只正常小鼠相同腦區(qū)RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA 模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增。

20 μL 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測體系包括1×Real Master Mix，1×SYBR Green，CIRP基因的上、下游引物各1 μL（5 pmol）及1 μL 模板。以β-actin基因作為內(nèi)參照，每樣品均做3 個(gè)復(fù)孔，以不加模板為空白對(duì)照。反應(yīng)條件：94℃5 min 預(yù)變性；94℃30 s，52℃ 30 s，72℃ 40 s，30 個(gè)循環(huán)；72℃延 伸10 min。擴(kuò)增后獲得各組Ct 值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用基于ΔΔCt方法進(jìn)行相對(duì)定量分析，基因表達(dá)差異為2ΔΔCt，ΔΔCt=ΔCt樣品-ΔCt參考基因。

β-actin上游引物為5′GATCCACATCTGCTGG AAGG3′，下游引物為5′AAGTGTCGTTGACATCCG 3′；TNFα上游引物為5′CCTGTAGCCCACGTCGTAG 3′，下游引物為5′GGGAGTAGACAAGGTACAACCC 3′；CIRP上游引物為5′GGACTCAGCTTCGACACCA AC3′，下游引物為5′ATGGCGTCCTTAGCGTCATC3′。

1.4 大腦標(biāo)本的HE染色

另取24、48 h 時(shí)間點(diǎn)9 只實(shí)驗(yàn)組、2 只正常組小鼠制備大腦標(biāo)本。實(shí)驗(yàn)鼠用2%水合氯醛腹腔注射麻醉、4%多聚甲醛心臟灌注后取出腦組織，將腦組織置于4%多聚甲醛中固定48 h后進(jìn)行石蠟包埋及切片，切片厚度為8 μm。

石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、水合后，將已入蒸餾水后的切片放入蘇木精水溶液中染色數(shù)分鐘，酸水及氨水中分色各數(shù)秒鐘，流水沖洗1 h 后入蒸餾水片刻，入70%和90%酒精中脫水各10 min，入酒精伊紅染色液染色2～3 min，梯度乙醇脫水、二甲苯透明后封片觀察。

1.5 大腦標(biāo)本的免疫組化檢測

采用間接免疫熒光法檢測損傷及正常大腦組織中人特異抗原CIRP的表達(dá)水平，一抗工作濃度為1∶200。石蠟切片脫蠟至水，用3% H2O2室溫孵育5～10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；蒸餾水沖洗，PBS 浸泡2 次，每次5 min；用5%正常山羊血清（PBS稀釋）封閉，室溫孵育10 min，傾去血清，勿洗；滴加一抗工作液，37℃孵育1～2 h 或4℃過夜；PBS沖洗3 次，每次5 min；滴加適量生物素標(biāo)記二抗工作液，37℃孵育10～30 min；PBS 緩沖液沖洗3 次，每次5 min；滴加適量辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育30 min；PBS緩沖液沖洗3次，每次5 min；顯色劑顯色3～15 min，自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明，封片。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用Student′st檢驗(yàn)分析損傷后不同時(shí)間點(diǎn)損傷腦組織與正常腦組織CIRP 表達(dá)水平的差異，P＜0.05 表示差異顯著；采用統(tǒng)計(jì)軟件Graphpad prism 6分析CIRP表達(dá)水平與TNFα表達(dá)水平的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 建立小鼠急性腦損傷模型

對(duì)照組小鼠大腦左右對(duì)稱，未見明顯病理變化。液壓打擊可導(dǎo)致小鼠大腦急性損傷，損傷程度與范圍隨打擊力度增大而增大。液壓打擊后，可觀察到小鼠大腦皮層、蛛網(wǎng)膜下腔及腦挫裂傷灶周圍出血，損傷越重，出血越明顯。傷后數(shù)小時(shí)，大腦挫裂傷灶逐漸形成壞死空洞。24 h 可見傷側(cè)腦組織蒼白、損傷部位組織水腫，壞死灶明顯。此外，行為學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)手術(shù)組小鼠出現(xiàn)偏癱、行動(dòng)困難等癥狀。HE 染色結(jié)果顯示，急性腦損傷48 h 后大腦局部出現(xiàn)明顯的組織缺損；小鼠在打擊部位白質(zhì)內(nèi)可見大量神經(jīng)元壞死、膠質(zhì)細(xì)胞增生和空洞樣結(jié)構(gòu)形成；空洞位于原出血區(qū)，呈類圓形，周圍有增生的膠質(zhì)細(xì)胞包繞（圖1）。

2.2 免疫組化染色觀察

建模48 h 后，免疫組化染色觀察CIRP 蛋白在損傷部位的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，損傷側(cè)大腦組織標(biāo)本中可以觀察到更多CIRP 陽性細(xì)胞，呈黃色或淡黃色，染色陰性的神經(jīng)元細(xì)胞核經(jīng)蘇木精復(fù)染呈藍(lán)色，與正常大腦相比損傷大腦CIRP 陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加（圖2）。

2.3 損傷后不同時(shí)間點(diǎn)CIRP mRNA表達(dá)水平檢測

以正常大腦為對(duì)照，采用實(shí)時(shí)PCR 方法檢測損傷后不同時(shí)間點(diǎn)大腦損傷部位CIRP 的表達(dá)變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)急性腦損傷24 及48 h 后CIRP 的表達(dá)持續(xù)升高，與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3）。

2.4 損傷后不同時(shí)間點(diǎn)炎癥因子TNFα mRNA 表達(dá)水平檢測

采用實(shí)時(shí)PCR 方法，在大腦急性損傷后不同時(shí)間點(diǎn)檢測炎癥因子TNFα的表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常腦組織相比，TNFα在大腦損傷后顯著增多，提示腦損傷會(huì)誘導(dǎo)炎癥因子的分泌（圖4）。

圖1 小鼠缺急性腦外傷模型的建立

圖2 正常大腦及腦損傷后48 h后觀察CIRP在腦內(nèi)的表達(dá)情況

2.5 急性損傷后腦組織中CIRP 的變化與TNFα表達(dá)水平的關(guān)系

為了進(jìn)一步研究CIRP 在大腦損傷修復(fù)過程中的作用，我們利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析了CIRP 的變化與TNFα表達(dá)水平之間的關(guān)系，結(jié)果表明大腦急性損傷后，腦組織中CIRP 的表達(dá)量與炎癥因子TNFα的表達(dá)水平存在線性關(guān)系，TNFα的表達(dá)水平隨著CIRP表達(dá)量的增高而增高，兩者具有線性相關(guān)。

3 討論

圖3 實(shí)時(shí)PCR檢測急性腦損傷后不同時(shí)間點(diǎn)CIRP的表達(dá)

圖4 實(shí)時(shí)PCR檢測急性腦損傷后不同時(shí)間點(diǎn)CIRP的表達(dá)

圖5 CIRP與TNFα mRNA表達(dá)水平相關(guān)性分析

流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)急性腦外傷是交通事故、高空墜落等公共突發(fā)事件引發(fā)的常見病。我國急性腦外傷的發(fā)生率可占城市傷亡病總數(shù)的60%，該疾病容易導(dǎo)致永久性殘疾和死亡，是嚴(yán)重影響人類生命健康的疾病之一[5-6]。創(chuàng)傷后腦組織的損傷修復(fù)對(duì)病人生活能力的改善至關(guān)重要。在臨床治療過程中，腦組織的創(chuàng)傷越嚴(yán)重，修復(fù)越困難。然而目前腦外傷發(fā)展過程中的調(diào)節(jié)機(jī)制還不明確。因此，建立適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型，研究調(diào)控腦外傷損傷修復(fù)的分子機(jī)制，對(duì)臨床具有指導(dǎo)意義。

建立穩(wěn)定的動(dòng)物模型是腦外傷致病機(jī)理研究的基礎(chǔ)。理想的腦外傷模型應(yīng)具備以下特點(diǎn)：①具有良好的重復(fù)性，即采用相同方法制作出的模型具有相近程度的腦損傷；②具有良好的臨床指導(dǎo)性，動(dòng)物模型的損傷與所要研究的人類腦損傷具有相似的特征；③實(shí)驗(yàn)因素的可控性，即打擊力度與大腦損傷程度線性相關(guān)，可通過對(duì)打擊力的控制來控制動(dòng)物腦損傷的程度；④操作簡單易行。20 世紀(jì)以來，研究者采用多種方法建立了腦創(chuàng)傷動(dòng)物模型，其中包括液壓打擊腦損傷模型、慣性加速腦損傷模型、固定沖擊損傷模型、落重法閉合性腦損傷模型等[7-9]。有研究者比較上述模型后，認(rèn)為采用液壓打擊法制作腦損傷模型操作簡單、重復(fù)性好，可以很好地模擬臨床復(fù)制出局灶性和彌漫性損傷[10]。小鼠具有與人類相似的基因序列，容易進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，是制作小動(dòng)物腦損傷模型的最常用動(dòng)物之一。因此，本研究以成年小鼠作為研究對(duì)象，采用液壓打擊法穩(wěn)定制作出小鼠腦外傷模型，打擊后的小鼠出現(xiàn)明顯的腦外傷癥狀，且損傷程度與打擊強(qiáng)度正相關(guān)。

我們?cè)谇捌诠ぷ髦邪l(fā)現(xiàn)，在缺血再灌注模型中CIRP 隨著損傷時(shí)間的推移表達(dá)升高，然而CIRP 的表達(dá)與腦中能量代謝無線性關(guān)系[11]。2014 年，Zhou等研究發(fā)現(xiàn)在腦缺血模型中CIRP 促進(jìn)了大腦的炎癥反應(yīng)[12]。本研究中首次利用實(shí)時(shí)PCR 及免疫組化法觀察了CIRP 在急性腦損傷中的表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大腦損傷部位的CIRP 表達(dá)持續(xù)升高。為了進(jìn)一步研究CIRP 表達(dá)與大腦炎癥之間的關(guān)系，我們檢測了同一時(shí)間點(diǎn)炎癥因子TNFα的表達(dá)水平，并分析了TNFα表達(dá)變化與CIRP 之間的關(guān)系，結(jié)果表明CIRP表達(dá)水平與TNFα表達(dá)水平呈線性相關(guān)。本研究進(jìn)一步證實(shí)了CIRP 對(duì)炎癥反應(yīng)促進(jìn)作用，與Zhou 等的研究結(jié)果一致。

盡管取得了上述進(jìn)展，CIRP 發(fā)揮作用的具體機(jī)制尚不明確，有待深入研究。相信大腦損傷修復(fù)研究的不斷深入，會(huì)在不久的將來為創(chuàng)傷性腦外傷的治療帶來新的希望。

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