覃霞 羅彥彥 袁廣之 暢榮妮 賴青鳥 楊益金 華榮 李福記 方玲 吳華裕 馬軍 胡啟平 李曉龍 袁志剛 林有坤 舒?zhèn)?/p>

·研究報道·

一個兒童早老癥家系臨床特征分析和致病基因研究

覃霞 羅彥彥 袁廣之 暢榮妮 賴青鳥 楊益金 華榮 李福記 方玲 吳華裕 馬軍 胡啟平 李曉龍 袁志剛 林有坤 舒?zhèn)?/p>

目的 通過對一個罕見早老癥家系的分析，探討早老癥患者的臨床病理學(xué)特征和遺傳學(xué)因素。方法 收集1個早老癥家系（2代共5名家庭成員，子女3人均為患者）3例患者的基本資料，對其進行臨床檢查，并對患者手部、肺臟和下頜骨進行影像學(xué)分析；同時對3例患者進行染色體核型分析，對該家系進行LMNA基因突變分析。結(jié)果 家系中的3例患者半歲左右即可見皮膚硬化癥，并表現(xiàn)出生長嚴重遲緩，極度衰老面容。年長患者影像學(xué)檢查顯示骨質(zhì)疏松，下頜骨發(fā)育不全。染色體核型分析顯示，3例患者及其父母核型正常?；蛲蛔兎治鲲@示，3例患者均為LMNA基因第9號外顯子的純合突變1579C＞T（R527C），父母均為LMNA R527C雜合突變。結(jié)論 該早老癥家系患者符合兒童早老癥表型，為LMNA基因R527C純合突變所致。

早衰；LMNA基因；DNA突變分析；Hutchinson-Gilford綜合征

兒童早老癥也稱為漢氏早老綜合征（Hutchinson-Gilford progeria syndrome，HGPS,OMIM,176670），是一種極為罕見、以過早老化為特征的疾病［1］。高加索人較其他人種更易患早老病，達到該病例報道的97%［2］。有文獻報道HGPS為常染色體顯性遺傳病，也有極少數(shù)文獻報道為常染色體隱性遺傳?。?-6］。研究表明，將近90%的HGPS是由定位于1q21.2上的LMNA基因的 11 號外顯子發(fā)生點突變（G608G：GGC→GGT）引起［7］。本研究對我國發(fā)現(xiàn)的一個隱性遺傳早老癥家系進行了臨床特征分析，并研究了該家系的致病基因及其突變位點。

一、對象

獲得患者父母知情同意。該HGPS家系來自廣西壯族自治區(qū)賀州市，漢族，先證者為7歲女孩，2009年就診于廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科。家系2代共5名家庭成員，子女3人均為患者，父母為非近親婚配。家系中雙親表型正常。

二、研究方法

1.染色體G顯帶：抽取3例患者外周血2ml，用抗凝管保存。送至廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院生殖中心進行染色體G顯帶分析。

2.外周血DNA抽提：在簽署知情同意書的前提下抽取該家系5名成員外周靜脈血各3ml，EDTA抗凝。外周血使用常規(guī)苯酚、氯仿抽提白細胞基因組DNA。2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定基因組DNA的完整性，微量紫外分光光度計測定DNA濃度和純度。DNA無降解、A260/280介于1.8～2.0之間為合格樣品。根據(jù)所測濃度，用1×TE緩沖液稀釋DNA樣本至終質(zhì)量濃度為50 mg/L，置于-20℃保存。

3.LMNA基因的突變分析：根據(jù)NCBI中LMNA基因序列，利用NCBI在線引物設(shè)計軟件Primer-BLAST得到LMNA基因12個外顯子相關(guān)引物序列（9號外顯子上游引物5′-CAGGTGGTGACGGTGAGTG-3′，下游引物 5′-TCTAGAAAGG GGCCCTGAAT-3′，11 號外顯子上游引物 5′-AGTGGTCAGTC CCAGACTCG-3′，下游引物 5′-CCTGCAGGATTTGGAGACA-3′），所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以家系中5名成員外周血提取的DNA為模板進行PCR擴增，使用美國Bio-RAD公司的T100 Thermal CyclerPCR儀進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為：2×Taq PCR Master Mix（羅氏公司）25μl，下游引物各 1μl，DNA 模板 1μl；水 22μl，總體系為50μl。反應(yīng)條件為第1步94℃2min；第2步（29個循環(huán)）94℃30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s；第3步 72℃ 5min后可設(shè)置4℃保存。2%瓊脂糖電泳鑒定產(chǎn)物特異性后送生工生物工程（上海）股份有限公司進行雙向測序。測序結(jié)果用Chrome軟件分析測序峰圖，Clustal 1.83軟件進行序列比對，尋找可疑突變。

圖1 兒童早老癥家系患者臨床特征 1A：先證者（Ⅱ1）典型早老面容，同時有斜頸；1B：先證者（Ⅱ1）雙手皮膚硬化，雙手指遠端萎縮，肢端溶解；1C：先證者妹妹（Ⅱ2）典型的早老面容，禿頂，尖鼻，小下頜；1D：先證者妹妹（Ⅱ2）雙下肢皮膚硬化，足背皮膚呈瘢痕狀萎縮

三、結(jié)果

1.患者基本資料和表型特征：3例患者的發(fā)病過程基本一致，均于1歲內(nèi)發(fā)病。先證者7歲，身材矮?。ㄉ砀?5 cm，9 kg），頭圍45.4 cm，禿頭，眼球突出，眉毛、睫毛稀疏，小下頜，牙擁擠，斜頸。全身皮下脂肪萎縮，皮膚薄，干燥緊縮，頭皮及雙下肢淺靜脈顯露。四肢皮膚硬皮病樣改變，指趾骨攣縮，指甲蒼白。曳行步態(tài)，關(guān)節(jié)活動度下降。先證者之妹妹4歲，身高77 cm，體重8 kg，頭圍44.4 cm，全部牙齒均患齲病，除無斜頸外，其余特征與先證者類似（圖1）。先證者之弟弟1歲，出生后6個月頭發(fā)便開始脫落，頭皮靜脈顯露，皮層變薄，雙下肢皮膚為硬皮病早期改變。3例患者智力和性格均無異常。家族中未發(fā)現(xiàn)其他遺傳病史。

2.臨床檢查：先證者2009年就診時發(fā)現(xiàn)血小板升高，D-二聚體定量檢測為203 mg/L。雙膝關(guān)節(jié)平片未見異常，左腕部腕骨骨化中心出現(xiàn)2枚，骨質(zhì)未見異常。左手遠節(jié)指骨發(fā)育細?。?］。此次檢查發(fā)現(xiàn)，先證者游離脂肪酸為2 372μmol/L，骨堿性磷酸酶132 U/L，血清磷1.83 mmol/L，肌酸激酶219 U/L，D-二聚體定量為426 mg/L，尿素肌酐比為0.219。其他2例患者此次檢查結(jié)果在與先證者基本相同，而家系中父母血清學(xué)指標則正常。

3例患者的雙手正側(cè)位X線片均提示骨質(zhì)疏松及指骨遠端骨質(zhì)缺損，先證者有骨齡發(fā)育遲緩，右側(cè)胸鎖乳突肌發(fā)育不良導(dǎo)致斜頸，且有明顯的小下頜，顱蓋骨與下頜骨比例失調(diào)，軀干瘦小。其他檢查如甲狀腺激素、生長激素、電解質(zhì)則在正常范圍內(nèi)。肺部CT未見明顯病變。心電圖、心臟彩超、眼底血管檢查也未見異常。

3.家系致病基因分析結(jié)果：該家系中父母表型正常，子女3人均患病，符合常染色體隱性遺傳特征。3例患者染色體核型分析顯示，先證者及其妹妹均為46，XX，先證者之弟弟為46，XY，G帶分析均未見異常。

家系成員外周血基因的雙向測序結(jié)果用Chrome軟件分析測序，用Clustal 1.83軟件與NCBI獲取的標準序列序列比對，發(fā)現(xiàn)3例患者均為R527C純合突變；患者父母為攜帶者，均為LMNA基因第9號外顯子R527C雜合突變（圖2）。

圖2 早老癥家系5名成員LMNA C.1579T突變 攜帶者即為患者父母，患者即為3例早老兒童，箭頭所指即為LMNA基因上的突變位點

四、討論

早老癥主要表現(xiàn)為生長發(fā)育遲緩，身材矮小，體重輕，頭大臉小，進食量少，皮下脂肪萎縮，表現(xiàn)為頭皮靜脈顯露，突眼，無耳垂，薄唇。皮膚干皺，有色素斑及鈣鹽沉著斑，四肢皮膚表現(xiàn)硬皮病樣改變。禿頭，眉毛及睫毛稀疏，甲蒼白。乳牙遲出，換牙延遲，牙齒擁擠。囟門關(guān)閉延遲，鷹鉤鼻，小下頜，梨形胸，鎖骨短小或缺如，遠側(cè)趾指骨骨質(zhì)溶解，髖外翻，骨質(zhì)疏松。步態(tài)異常表現(xiàn)為曳行步態(tài)，騎馬步態(tài)，寬步。50%個體有胰島素抵抗，1～2歲時表現(xiàn)有以上大部分特征的個體都被認為是典型的HGPS［9-10］。本研究家系中先證者及其妹妹除表現(xiàn)出以上大部分特征外，先證者尚有斜頸表現(xiàn)，而其妹妹則患嚴重齲病，這點與Panigrahi等［2］報道的HGPS病例相同。綜合本研究家系中先證者除了有大部分典型的HGPS癥狀外，還有胸鎖乳突肌發(fā)育不良導(dǎo)致的斜頸，先證者妹妹患有嚴重的齲病。該家系患者癥狀符合典型HGPS臨床表現(xiàn)。大部分早老癥兒童均先有皮膚硬化后漸出現(xiàn)其他典型的早老表型，如本家系的先證者于2009年因皮膚硬化至我院皮膚科就診，當(dāng)時患兒表現(xiàn)出明顯皮膚硬化，雙下肢活動障礙，且皮膚活檢亦符合硬皮病表現(xiàn)，但早老面容尚不明顯，從而被誤診為系統(tǒng)性硬皮病［8］。因早老癥為罕見疾病，故疾病早期較容易漏診、誤診。

本研究HGPS家系患者染色體核型G帶分析未見異常，表明疾病不是由于染色體畸變所致。Eriksson等最先在兩個早老癥小孩中發(fā)現(xiàn)LMNA基因上的雜合突變1824C＞T（G608G）［7，11］。隨后發(fā)現(xiàn) R471C、R527C、G608S 和 c.2036C ＞ T等與HGPS有關(guān)［12］。研究表明，LMNA基因上的雜合突變位點G608G表現(xiàn)出常染色體顯性遺傳模式。然而在來自父母表型正常但為雜合突變攜帶者的同一個家庭，兄弟姐妹中出現(xiàn)多個HGPS患者（基因型為純合突變狀態(tài)），這種遺傳模式符合常染色體隱性遺傳方式。我們所研究的漢族HGPS家系遺傳模式則符合常染色體隱性遺傳方式。

LMNA基因上不同位置的突變可能導(dǎo)致不同的表型，即使同一位點突變引起的臨床表現(xiàn)也可能不同。本研究發(fā)現(xiàn)的HGPS家系患者是LMNA R527C純合突變所致。2009年Liang 等［13］最先在我國發(fā)現(xiàn)該突變位點，2013年 Xiong 等［10］報道了一個同樣為LMNA R527C純合突變的HGPS家系。本家系與前面報道的患者有一定的相似性，表型符合大部分典型HGPS的臨床表現(xiàn)，且符合Xiong報道的血磷升高，血清三酰甘油升高。本研究不同于前2例報道的臨床特征是：先證者無類似Liang等報道的腹瀉、便秘、脊柱嚴重畸形等情況。先證者及其妹妹囟門已閉合。先證者右側(cè)胸鎖乳突肌發(fā)育不良引起斜頸，同時血小板及D-二聚體升高，骨堿性磷酸酶升高，尿素肌酐升高。先證者的妹妹患有嚴重的齲病。這充分說明同一個突變位點會引起HGPS不同程度的表型。這是國際上繼Liang和Xiong等后發(fā)現(xiàn)的第3個R527C純合突變HGPS家系，也說明LMNA基因上的突變位點有一定的地域性，該突變位點好發(fā)于亞洲人。

LMNA基因位于1號染色體q21.1-21.3上，共有12個外顯子，編碼lamin A、lamin C參與組成核纖層。至少有12種不同的疾病是由于LMNA基因突變產(chǎn)生［14］。LMNA基因上的C.1579T純合突變導(dǎo)致了相應(yīng)蛋白527位氨基酸的改變。R527及其相鄰的殘基R471、T528、M540和K542在空間構(gòu)像上位于一個可引起早老癥樣疾病的突變熱點區(qū)［1］。該位點突變使得堿性精氨酸改變?yōu)橹行园腚装彼幔@有可能破壞蛋白的表層結(jié)構(gòu)，并對核纖層結(jié)構(gòu)產(chǎn)生廣泛作用。

HGPS尚無有效的治療方法。有研究表明，法尼基化抑制劑可以逆轉(zhuǎn)表達早老蛋白細胞的核形態(tài)改變，同時小鼠體外實驗也暗示在早老癥治療領(lǐng)域中法尼基化抑制劑將會被有效使用。該類藥物有洛那法尼和替吡法尼，目前已進入臨床三期試驗［15］。但該類藥物只限于G608G突變導(dǎo)致細胞內(nèi)有早老蛋白堆積的患者，其他罕見位點突變并無早老蛋白堆積［1］。本研究中發(fā)現(xiàn)的致病突變位點目前僅在中國報道，尚無報道稱該位點突變導(dǎo)致細胞內(nèi)早老蛋白堆積，針對這個問題本課題組將在后期的研究中進一步驗證。

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2014-05-08）

（本文編輯：顏艷）

Analysis of clinical characteristics and causative genes of Hutchinson-Gilford progeria syndrome in a family

Qin Xia*，Luo Yanyan,Yuan Guangzhi,Chang Rongni,Lai Qingniao,Yang Yijin,Hua Rong,Li Fuji,Fang Ling,Wu Huayu,Ma Jun,Hu Qiping,Li Xiaolong,Yuan Zhigang,Lin Youkun,Shu Wei.*Department of Dermatology,First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021,China

s:Lin Youkun,Email:linyoukun7@aliyun.com;Shu Wei,Email:shuwei7866@126.com

ObjectiveTo assess clinicopathological features of and genetic factors in Hutchinson-Gilford progeria syndrome（HGPS）in a family.MethodsGeneral information was collected from 3 patients with Hutchinson-Gilford progeria syndrome in a family,which included 5 members over 2 generations with all the 3 children affected by HGPS.All the 3 patients underwent clinical investigation,image analysis of hands,lungs and mandibles,as well as karyotype analysis of chromosomes.LMNA gene mutations were analyzed in these family members.ResultsAll the 3 patients developed skin sclerosis with severe growth retardation and appearance of extreme aging at about 6 months of age.Image analysis showed osteoporosis and mandibular hypoplasia in the elder patient.Karyotype analysis showed no abnormality in the patients or their parents.Mutation analysis revealed a homozygous mutation 1579 C＞T （R527C）in exon 9 of the LMNA gene in all the patients,but a heterozygous mutation R527C in the LMNA gene in their parents.ConclusionsThe patients in this family present characteristic manifestations of HGPS,which may be caused by the homozygous LMNA mutation R527C.

Progeria;LMNA gene;DNA mutational analysis;Hutchinson-Gilford syndrome

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.03.011

國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金（81260479）；廣西自然科學(xué)青年基金（2013GXNSFBA019143）

530021南寧，廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科（覃霞、羅彥彥、林有坤），脊柱外科（袁廣之）；廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室（暢榮妮、賴青鳥、楊益金、華榮、李福記、方玲、吳華裕、馬軍、胡啟平、李曉龍、袁志剛、舒?zhèn)ィ?/p>

林有坤，Email：linyoukun7@aliyun.com；舒?zhèn)?，Email：shuwei7866@126.com