王玉金 劉杏

（山東省蒙陰縣畜牧獸醫(yī)局276200）

貴州黑山羊FSHR 基因與繁殖性狀相關(guān)性研究

王玉金 劉杏

（山東省蒙陰縣畜牧獸醫(yī)局276200）

本研究通過探討FSHR基因SNP與貴州黑山羊繁殖性狀關(guān)聯(lián)性。試驗(yàn)采用PCR-SSCP技術(shù)檢測FSHR基因單核苷酸多態(tài)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，貴州黑山羊FSHR基因外顯子1檢測到1個(gè)SNP位點(diǎn)C1412A。基因型與繁殖性狀關(guān)聯(lián)分析顯示，貴州黑山羊FSHR基因AA基因型個(gè)體產(chǎn)羔數(shù)顯著高于與AC和CC基因型個(gè)體（P＜0.05）。研究結(jié)果提示：FSHR基因可能是影響山羊產(chǎn)羔數(shù)的主效基因。

FSHR；基因；關(guān)聯(lián)性；繁殖性狀；貴州黑山羊

促卵泡素是垂體前葉分泌的一種調(diào)控動(dòng)物繁殖活動(dòng)的糖蛋白質(zhì)激素，能促進(jìn)卵泡的生長發(fā)育和分化成熟。由于促卵泡素是大分子，不能透過細(xì)胞膜直接發(fā)揮其生理作用。因此，F(xiàn)SH的生理作用是通過與特異性受體促卵泡素受體（Follicle stimulating hormone receptor，F(xiàn)SHR）結(jié)合來發(fā)揮生物學(xué)活性[1]。對FSHR基因5'端調(diào)控區(qū)[2]和第10外顯子[3]的多態(tài)性研究表明，F(xiàn)SHR的多態(tài)性對動(dòng)物的產(chǎn)羔（仔）數(shù)有重要的影響。國內(nèi)外對動(dòng)物和人的FSHR基因有許多報(bào)道，但對于貴州黑山羊FSHR基因多態(tài)性的研究尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)采用PCR-SSCP及PCR產(chǎn)物直接測序技術(shù)對FSHR基因在貴州黑山羊的多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行檢測，以探尋FSHR基因多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)之間的相關(guān)性，為進(jìn)一步研究貴州黑山羊繁殖性狀的遺傳機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

試驗(yàn)均采集具有前3胎產(chǎn)羔記錄的貴州黑山羊102只采自貴州省黔西縣。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

Ezup柱式血液基因組DNA抽提試劑盒，聚丙烯酰胺凝膠，瓊脂糖凝膠，2xEs TaqMasterMix，DM2000，Buffer1 xTBE緩沖液均購自貴州鼎國生物工程有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI中GenBank數(shù)據(jù)庫中綿羊FSHR（登錄號(hào)：NC_019460.1）基因序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。利用Primier-BLAST在線軟件設(shè)計(jì)特異性引物，引物信息見表1。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物相關(guān)信息

1.4 SSCP分型及測序

PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃3min；34個(gè)循環(huán)（95℃30s，表 1溫度 30s，72℃30min）； 72℃延伸 5min； 4℃保存。PCR 反應(yīng)體系為 20μL： 2×Taq PCR Master Mix10μL，DNA 模板 2μL，上、下游引物各1.5μL，加水至20μL。SSCP所需PCR產(chǎn)物用10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。取5μLPCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。選擇條帶單一的PCR產(chǎn)物送交北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行雙向測序。用DNAStar軟件對序列結(jié)果進(jìn)行校正，BLAST分析確定SNPs。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR-SSCP分型及測序

在貴州黑山羊FSHR-T引物所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行SSCP分析，結(jié)果顯示擴(kuò)增序列在貴州黑山羊樣品中均出現(xiàn)3種帶型，純合型定義為AA型和CC型，雜合型定義為AC型（圖1）。

圖1 PCR-SSCP電泳圖譜

選擇貴州黑山羊不同基因型個(gè)體PCR產(chǎn)物送交公司測序，通過SepMan程序分析測序結(jié)果并比對，在FSHR基因第10外顯子1412bp發(fā)生突變，突變前后均未引起氨基酸的改變。

2.2 FSHR基因多態(tài)性與繁殖性狀關(guān)聯(lián)性分析

由表2可知，在貴州黑山羊試驗(yàn)群體中，AA基因型與AG和GG基因型差異顯著（P＜0.05），而AG基因型與GG基因型差異不顯著（P＞0.05）。

3 討論

圖2 多態(tài)位點(diǎn)測序峰圖

目前，對FSHR基因第1和10外顯子多態(tài)性與動(dòng)物繁殖性能的研究表明，這些多態(tài)位點(diǎn)對動(dòng)物的產(chǎn)羔（仔）性狀有一定的相關(guān)性。吳井生[4]等對小梅山豬FSHR基因第10外顯子進(jìn)行多態(tài)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在l～2胎小梅山母豬中，AA和CC基因型母豬的總產(chǎn)仔數(shù)低于AB、AC和BC基因型；2胎以上個(gè)體中，AA和CC基因型母豬總產(chǎn)子數(shù)比BC型分別少0.64（P＞0.05）和0.36頭（P＞0.05）； 雷雪芹[5]等檢測秦川牛和荷斯坦奶牛的雙、單胎母牛FSHR基因第10個(gè)外顯子SNP發(fā)現(xiàn)，雙胎牛突變型明顯高于單胎牛的突變型。表明該突變對秦川牛、荷斯坦牛的單、雙胎有顯著影響。由此推斷，F(xiàn)SHR基因可能是影響動(dòng)物繁殖性狀的一個(gè)候選基因。本試驗(yàn)對在FSHR基因上發(fā)現(xiàn)的C1412A位點(diǎn)與貴州黑山羊繁殖性狀進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，在貴州黑山羊群體中AA基因型個(gè)體的產(chǎn)羔數(shù)與CC和AC基因型個(gè)體的產(chǎn)羔數(shù)差異顯著（P＜0.05），同樣CA和CC基因型個(gè)體產(chǎn)羔數(shù)差異不顯著（P＞0.05）。由此可以推斷FSHR基因可能對貴州黑山羊繁殖性能有一定影響，與之前報(bào)道FSHR基因參與動(dòng)物的繁殖調(diào)節(jié)一致。

表2 G121A位點(diǎn)不同基因型與不同山羊品種與產(chǎn)羔數(shù)的相關(guān)分析

[1]Ranniki A S,Zhang F P,Huhtaniemi I T.Ontogeny of follicle stimulating hormone receptor gene expression inthetestis and ovary[J].MolCell Endocrinol,1995,107:199-208.

[2]GuoX,LiY,ChuM,et al.Polymorphism of 5'regulatory region of caprine FSHR gene and its association with litter size in Jining Grey goat[J].Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences,2013,37（5）:497-503.

[3]姜懷志.雙羔型遼寧絨山羊FSHR基因SNP分析的研究[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2004(5):550-553.

[4]吳井生,張跟喜,戴國俊,等.FSHR基因第10外顯子多態(tài)性及其與小梅山豬產(chǎn)仔數(shù)的關(guān)系[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2012(4):509-515.

[5]雷雪芹,陳宏,袁志發(fā),等.牛 FSHR 基因第10外顯子單核苷酸多態(tài)性及其與雙胎性狀的關(guān)系[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào),2004(1):34-37.

王玉金（1986-），本科，助理獸醫(yī)師，從事畜牧獸醫(yī)方面工作。