王紅月，王 茉，張 晨，齊宏欣，遲寶榮

（1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院腎內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春 130021；2.吉林大學(xué)藥學(xué)院再生醫(yī)學(xué)系，吉林 長(zhǎng)春 130021；3.吉林大學(xué)第一醫(yī)院肝膽胰內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春 130021）

肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子 （hepatocyte growth factor，HGF）是一種重要的抗纖維化因子，具有抗肝纖維化作用［1］。近年來研究［2］顯示：HGF也有抗腎纖維化作用，但其抗腎間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制目前尚不完全清楚。近年來研究［3－4］表明：HGF可通過抗腎小管上皮－肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化 （tubular epithelial－myofibroblast transdifferentiation，TEMT）而防止腎臟纖維化，TEMT被認(rèn)為是導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化的重要原因。近期研究［5－7］發(fā)現(xiàn)：血管緊張素Ⅱ （angiotensinⅡ，AngⅡ）也是很強(qiáng)的致TEMT因子，且HGF與血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑聯(lián)合有更好抗的TEMT作用，但關(guān)于HGF和AngⅡ?qū)EMT的影響及是否存在相關(guān)性尚無確切報(bào)道，本課題組主要針對(duì)HGF和AngⅡ與TEMT的關(guān)系進(jìn)行深入研究。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑 人腎近曲小管上皮細(xì)胞（human kidney proximaltubular cells－2， HK－2）購自中國(guó)生命科學(xué)院上海細(xì)胞庫。RPMI－1640和胎牛血清 （美國(guó) Gibco公司），CK－8試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒 （碧云天生物有限公司），α－平滑肌肌動(dòng)蛋白 （α－SMA）抗體及二抗 （美國(guó)Santa Cruz），RT－PCR試劑盒 （日本 Takara公司）。

1.2 HK－2細(xì)胞培養(yǎng)HK－2細(xì)胞用含有10%RPMI－1640胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)。在含10% 胎牛血清100U·mL－1青霉素和100mg·L－1鏈霉素的RPMI－1640培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。將 HK－2細(xì)胞按1×106接種在75cm2Flask培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2，當(dāng)貼壁細(xì)胞達(dá)80%～90%融合時(shí)用無血清培養(yǎng)基洗3次，進(jìn)行傳代或種板，?、羝诩?xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞分組及CCK8法檢測(cè) 以每孔1×103細(xì)胞接種于96孔板中，接種后6h加入刺激物，按加入刺激物的不同將HK－2細(xì)胞分對(duì)照組、AngⅡ組、HGF組和AngⅡ＋HGF組，每組3復(fù)孔。對(duì)照組只加HK－2細(xì)胞，HGF和AngⅡ組在細(xì)胞的基礎(chǔ)上分別加入8μg·L－1HGF 和1×10－6mol·L－1AngⅡ，AngⅡ＋HGF組在細(xì)胞基礎(chǔ)上同時(shí)加8μg·L－1HGF和1×10－6mol·L－1AngⅡ。24h后收集細(xì)胞，每孔加入10μL CCK8，37℃孵育1h后，檢測(cè)450nm處吸光度 （A）值。以A值表示細(xì)胞增殖活性。

1.4 RT－PCR法檢測(cè) HK－2細(xì)胞中α－SMA mRNA表達(dá)水平 采用Trizol法提取總RNA，檢測(cè)mRNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR擴(kuò)增α－SMA基因，β－actin為內(nèi)參。α－SMA，正義鏈5′－ACTGGGACGACTAGGAAAAAG－3′， 反 義 鏈5′－CATCTCCAGAGTCCAGCACA－3′。 β－actin，正 義 鏈 5′－ATCATGTTTGAGACCTTCAACAC－3′，反義鏈 5′－CATGGTGGTGCCGCCAGACAG－3′。PCR擴(kuò)增體系：cDNA模板2μL，去離子水14.5μL，10× PCR 緩 沖 液 2.5 μL，dNTP（2.5mmol·L－1）2μL，MgCl2（25mmol·L－1）1.5μL，上游引物 （50μmol·L－1）1μL，下游引物 （50μmol·L－1）1μL，ExTaqDNA聚合酶（5U·μL－1）0.5μL，總體積25μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：94℃、5min，94℃變性30s，58℃退火45s，72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，用Phoretix ID凝膠圖像分析軟件測(cè)定電泳條帶的灰度值，用內(nèi)參校準(zhǔn)，以α－SMA／β－actin灰度值比值表示α－SMA mRNA表達(dá)水平。

1.5 Western blotting法檢測(cè) HK－2細(xì)胞中α－SMA蛋白表達(dá)水平 將細(xì)胞加入細(xì)胞裂解緩沖液，離心，提取總蛋白。取總蛋白50μg作SDS－PAGE電泳，凝膠濃度為10%，濃縮膠電壓110V，電泳30min，分離膠電壓100V，電泳90min。電泳結(jié)束后，用電轉(zhuǎn)印儀將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，時(shí)間60min，電流等于膠面積 （cm2）×0.55mA。PVDF膜用Blocking buffer（5% 脫脂奶粉）封閉4℃過夜。次晨，室溫1h，TBST［20mmol·L－1Tris－HCl（pH7.4），0.15mol·L－1NaCl，0.1%Tween］洗3次，加入α－SMA兔抗人多克隆抗體（1∶500）室溫孵育2h，TBST洗3次，加入辣根過氧化物酶交聯(lián)的羊抗兔IgG二抗 （1∶2000）1h，TBST洗3次，加入免疫印跡化學(xué)ECL發(fā)光試劑，暗室曝光顯影。用凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描分析條帶的面積和灰度，蛋白區(qū)帶用積分灰度值表示，同時(shí)檢測(cè)β－actin的蛋白表達(dá)作為對(duì)照，其比值表示α－SMA蛋白表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。細(xì)胞增殖活性、α－SMA mRNA和蛋白表達(dá)水平均以表示，組間比較采用單因素方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié) 果

2.1 各組 HK－2細(xì)胞的增殖活性 與對(duì)照組（0.668±0.030）比 較，HGF 組細(xì)胞增 殖 活 性（0.737±0.051）升高 （P＜0.05），AngⅡ組和AngⅡ＋HGF組細(xì)胞增殖活性 （0.235±0.015和0.466±0.023）降低 （P＜0.05）；與 AngⅡ組比較，AngⅡ＋HGF組細(xì)胞增殖活性升高 （P＜0.05）。

2.2 各組 HK－2細(xì)胞中α－SMA mRNA 表達(dá)水平與對(duì)照組比較，HGF組和AngⅡ＋HGF組細(xì)胞中α－SMA mRNA表達(dá)水平降低 （P＜0.05或P＜0.01），AngⅡ組細(xì)胞中α－SMA mRNA表達(dá)水平升高 （P＜0.05）。與AngⅡ 組比較，AngⅡ＋HGF組細(xì)胞中α－SMA mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.05）。見圖1和表1。

2.3 各組HK－2細(xì)胞中α－SMA蛋白表達(dá)水平 與對(duì)照組比較，HGF組細(xì)胞中α－SMA蛋白表達(dá)水平降低 （P＜0.05），AngⅡ組和 AngⅡ＋HGF組細(xì)胞α－SMA蛋白表達(dá)水平升高 （P＜0.05或P＜0.01）。與AngⅡ 組比較，AngⅡ＋HGF組細(xì)胞α－SMA蛋白表達(dá)水平降低 （P＜0.05）。見圖2和表1。

3 討 論

圖1 各組HK－2細(xì)胞中α－SMA mRNA表達(dá)電泳圖Fig.1 Electrophoregram ofα－SMA mRNA expressions in HK－2cells in various groups

表1 各組HK－2細(xì)胞中α－SMA mRNA和蛋白表達(dá)水平Tab.1 Expression levels ofα－SMA mRNA and protein in HK－2cells in various groups （n＝3，）

表1 各組HK－2細(xì)胞中α－SMA mRNA和蛋白表達(dá)水平Tab.1 Expression levels ofα－SMA mRNA and protein in HK－2cells in various groups （n＝3，）

＊ P＜0.05，＊＊ P＜0.01 vs control group；△P＜0.05 vs AngⅡgroup.

Group α－SMA mRNA Protein Control 210±30 199±25 AngⅡ 270±15＊ 796±55＊＊HGF 120±41＊＊ 119±11＊AngⅡ＋HGF 150±23＊△ 398±23＊△

圖2 各組HK－2細(xì)胞中α－SMA蛋白表達(dá)電泳圖Fig.2 Electrophoregram ofα－SMA protein expressions in HK－2cells in various groups

HGF是一種非組織特異性生長(zhǎng)因子，是目前已知生物活性最廣泛的生長(zhǎng)因子之一，其可以刺激多種上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂、運(yùn)動(dòng)以及小管形態(tài)的發(fā)生［8］。HGF作為一種有效的、拮抗纖維化形成的內(nèi)源性因子，已經(jīng)被用于治療腎纖維化的實(shí)驗(yàn)及臨床研究中［9］。腎小管上皮細(xì)胞在某種刺激下激活，可表達(dá)α－SMA，顯示出肌成纖維細(xì)胞的形態(tài)，增殖能力加強(qiáng)，并產(chǎn)生大量間質(zhì)基質(zhì)成分，這一過程稱為TEMT。TEMT被認(rèn)為是一個(gè)相互協(xié)作、調(diào)節(jié)精準(zhǔn)的過程，包括4個(gè)重要步驟：①腎小管上皮細(xì)胞喪失細(xì)胞－細(xì)胞間連接，發(fā)生TEMT的早期，E－鈣黏蛋白的表達(dá)受抑；②α－SMA再表達(dá)和肌動(dòng)蛋白重組，利于轉(zhuǎn)化細(xì)胞遷移、侵襲、甚至獲得收縮能力，可以作為TEMT的標(biāo)志；③小管基底膜分裂破壞；④細(xì)胞遷移入侵能力增強(qiáng)。目前研究TEMT多以α－SMA為標(biāo)志。近期的研究結(jié)果［4］提示：腎間質(zhì)纖維化很大程度上是由于TEMT引起的，因此研究能夠抑制TEMT的物質(zhì)對(duì)防治腎間質(zhì)纖維化至關(guān)重要。國(guó)內(nèi)外的研究［10］及本課題組研究結(jié)果［3］顯示：HGF有逆轉(zhuǎn)TEMT的作用，但關(guān)于其具體機(jī)制尚在探討中，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其主要是通過對(duì)TGF－β1的抑制而實(shí)現(xiàn)的，目前有些研究［7，11－12］已顯示：HGF與AngⅡ的關(guān)系不容忽視。AngⅡ也是很強(qiáng)的致TEMT因子，前期的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)HGF與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑鹽酸貝納普利 （洛汀新）合用較單獨(dú)應(yīng)用HGF或洛汀新可更進(jìn)一步減輕腎間質(zhì)纖維化，二者有協(xié)同作用。而洛汀新的腎臟保護(hù)作用主要是由對(duì)AngⅡ的抑制作用而實(shí)現(xiàn)的，提示HGF亦可抑制AngⅡ，故兩者合用作用增強(qiáng)，或通過其他途徑放大了洛汀新抑制AngⅡ的作用。

本研究結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，HGF組α－SMA mRNA和蛋白表達(dá)水平降低，促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞增生，而AngⅡ組α－SMA mRNA和蛋白的表達(dá)增多，抑制腎小管上皮細(xì)胞增生，說明HGF不但可以促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞增生，而且可以從基因及蛋白水平上抑制腎小管上皮細(xì)胞α－SMA的表達(dá)，即可抑制TEMT；而AngⅡ可抑制細(xì)胞增生，促進(jìn)α－SMA的表達(dá)，促進(jìn)TEMT，兩者作用相反。與單獨(dú)應(yīng)用AngⅡ?qū)Ρ?，同時(shí)加入HGF和AngⅡ時(shí)，腎小管上皮細(xì)胞增生明顯，α－SMA的 mRNA及蛋白表達(dá)減少，即 HGF對(duì)AngⅡ抑制細(xì)胞增生及促進(jìn)TEMT方面有逆轉(zhuǎn)作用。本研究結(jié)果進(jìn)一步擴(kuò)充了HGF的作用機(jī)制，但在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面需要深入探討。

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