劉茜(廣東環(huán)境保護(hù)工程職業(yè)學(xué)院,廣東 佛山 528216)
食用豆類不僅是重要的糧食資源之一,還含有多種生物活性物質(zhì),其中含有多種維生素,礦物質(zhì)以及黃酮類化合物[1]。
天然抗氧化劑普遍取自天然可以食用的原料中[2-6],由于天然抗氧化劑具有安全,無(wú)毒等優(yōu)點(diǎn)而引起人們的關(guān)注。尋找高效,天然抗氧化劑符合現(xiàn)代人的健康需要,極具開發(fā)價(jià)值。
黃酮類化合物是植物界廣泛存在的成分之一,常作為植物藥的有效成分存在,廣泛存在于植物的次級(jí)代謝產(chǎn)物中,具有抗癌、抗衰老、抗炎、降血糖、降血壓、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等多種功能,還可有效清除羥自由基等活性氧組分,是一類具有廣泛開發(fā)前景的天然抗氧化劑[7]。
浸提法是黃酮類化合物提取中較常用的一種提取法。浸提法主要依據(jù)各種黃酮類化合物的極性、溶解性不同,從而使其分離出,是黃酮類化合物的一種初級(jí)分離法。
材料:花豇豆(市售)
試劑:95% 乙醇(開封市芳晶化學(xué)試劑有限公司);FeSO4·7H2O(天津市凱通化學(xué)試劑有限公司);30%過(guò)氧化氫(天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心);水楊酸(天津市博迪化工股份有限公司);以上試劑均為分析純。
新苗電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司);KM 快速研磨機(jī)(湘潭湘儀儀器有限公司);8411 電動(dòng)振篩機(jī)(湘潭湘儀儀器有限公司);電子分析天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司);數(shù)星HH-2 恒溫水浴鍋(金壇市杰瑞爾電器有限公司);SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司);UV-754 型紫外可見分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。
1.3.1 花豇豆的預(yù)處理
將花豇豆用自來(lái)水洗凈,然后用蒸餾水洗3 遍,平鋪于不銹鋼托盤上,自然晾干,用粉磨機(jī)將花豇豆粉碎,然后過(guò)40 目篩,將粉末至于烘箱內(nèi)于40℃下干燥5h,置于棕色試劑瓶中避光保存。
1.3.2 乙醇濃度對(duì)提取率的影響
稱取花豇豆粉末2.000g,放于150mL 的圓底燒瓶中,分別加入40mL 的40%,50%,60%,70%,80%,95%的乙醇溶液,料液比為1∶20。置于回流裝置中回流45min,設(shè)置水浴溫度為80℃。冷卻后減壓抽濾,移取上層清液測(cè)定其羥自由基清除率。
1.3.3 料液比對(duì)提取率的影響
稱取花豇豆粉末2.000g,放于150mL 的圓底燒瓶中,分別加入20mL,40mL,60mL,80mL,100mL 的60%乙醇溶液,即料液比為:1∶10,1∶20,1∶30,1∶40,1∶50。置于回流裝置中回流45min,設(shè)置水浴溫度為80℃。冷卻后減壓抽濾,移取上層清液測(cè)定其羥自由基清除率。
1.3.4 水浴溫度對(duì)提取率的影響
稱取花豇豆粉末2.000g,放于150mL 的圓底燒瓶中,加入60mL60%乙醇溶液,置于回流裝置中回流45min,設(shè)置水浴溫度為60℃,70℃,80℃,90℃,95℃,冷卻后減壓抽濾,移取上層清液測(cè)定其羥自由基清除率。
1.3.5 浸提時(shí)間對(duì)提取率的影響
稱取花豇豆粉末2.000g,放于150mL 的圓底燒瓶中,加入60mL60%乙醇溶液,置于回流裝置中回流15min,45min,75min,105min,135min,設(shè)置水浴溫度為70℃,冷卻后減壓抽濾,移取上層清液測(cè)定其羥自由基清除率。
實(shí)驗(yàn)體系中,過(guò)氧化氫在亞鐵離子作用下生成羥自由基,向體系中加入水楊酸捕捉羥自由基,同時(shí)產(chǎn)生在可見光區(qū)有特征吸收的紫色產(chǎn)物。在反應(yīng)體系中加入抗氧化物質(zhì),與水楊酸競(jìng)爭(zhēng)捕捉羥自由基,使生成的紫色產(chǎn)物減少,溶液的吸光度發(fā)生改變。通過(guò)比較實(shí)驗(yàn)組與空白組反應(yīng)溶液吸光度的變化評(píng)價(jià)受試物的抗氧化活性[8]。
黃酮提取液清除羥自由基(·OH)實(shí)驗(yàn)在試管中依次加入0.5mL 水楊酸-乙醇溶液(9.1mmol/L),0.5mL 的黃酮提取液,0.5mLFe2+溶液(9mmol/L),3.5mL 蒸餾水,最后加入5.0mLH2O2(88mmol/L)啟動(dòng)反應(yīng),搖勻后于510nm 處測(cè)定吸光度A1;取0.5mL 的蒸餾水代替Fe2+溶液所測(cè)得的吸光度為A2;取0.5mL 蒸餾水代替黃酮提取液所測(cè)得的吸光度為A3,均重復(fù)5 次,按下式[18]計(jì)算羥自由基(·OH)的清除率P(%)。
式中:A1為樣品的吸光度值;A2為對(duì)照體系的吸光度值;A3為空白組的吸光度值。
2.1.1 乙醇濃度的影響
表1 不同濃度乙醇反應(yīng)后提取液的吸光度與羥自由基清除率關(guān)系
由表1 可看出,乙醇濃度為60%時(shí),羥自由基清除率最高,其黃酮提取率最高。
2.1.2 料液比的影響
表2 不同料液比反應(yīng)后提取液的吸光度與羥自由基清除率關(guān)系
由表2 可看出,當(dāng)料液比為1∶30 時(shí),羥自由基清除率最高,其黃酮提取率最高。
2.1.3 水浴溫度的影響
表3 不同水浴溫度反應(yīng)后提取液的吸光度與羥自由基清除率的關(guān)系
由表3 可看出,當(dāng)溫度為70℃時(shí),羥自由基清除率最高,其黃酮提取率最高。
2.1.4 浸提時(shí)間的影響
表4 不同浸提時(shí)間反應(yīng)后提取液的吸光度與羥自由基清除率的關(guān)系
由表4 可看出,當(dāng)回流時(shí)間為75min 時(shí),羥自由基清除率最高,其黃酮提取率最高。
在本實(shí)驗(yàn)設(shè)置的4 個(gè)影響因素下,確定了花豇豆粉末提取黃酮的最佳提取工藝:乙醇的體積分?jǐn)?shù)為60%;料液比為1∶30;提取溫度為70℃;提取時(shí)間為75min 時(shí),提取液中所含黃酮對(duì)羥自由基(·OH)具有較好的清除作用。使用該種方法來(lái)提取花豇豆中黃酮,對(duì)黃酮的提取和加工具有重要意義,為花豇豆加工企業(yè)進(jìn)行了合理的深加工提供技術(shù)參考。
[1]宗緒曉.關(guān)鍵平.食用豆類的植物學(xué)特征、營(yíng)養(yǎng)化及產(chǎn)業(yè)化[J].資源與生產(chǎn),2003,32(11):28-30.
[2]李貴榮.枸杞多糖的提取及其對(duì)活性氧自由基的清除作用[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志,2002,19(2):94-96.
[3]宋力,翟秋閣,付裕,等.圣女果中番茄紅素的提取方法及其抗氧化效果研究[J].信陽(yáng)師范學(xué)院學(xué)報(bào),2012,25(1):109-112.
[4]鄭晶泉.抗氧化劑抗氧化試驗(yàn)研究進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)衛(wèi)生分冊(cè),2000,27(8):137-141.
[5]蘇克曼,潘鐵英,張玉蘭等波譜解析法[M].上海:華東理工大學(xué)出版社,2002:80-131.
[6]鄭建仙.功能性食品學(xué)[M].北京市:中國(guó)輕工業(yè)出版社,2011:12-18.
[7]宋力,史朝霞,孫玉聰,等.酒石酸亞鐵法測(cè)定黃瓜中多酚的含量[J].信陽(yáng)師范學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2014,27(4):558-561.
[8]魯曉翔,唐津忠.紫背天葵中總黃酮的提取及其抗氧化性研究[J].食品科學(xué),2007,28(4):145-148.