曾 敏 ，李 姣 ，姚 立 ，石 挺 ，呂 軒 ，雷 勇 ，李文平 ，※

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙410128；2.湖南省畜牧水產(chǎn)局，湖南長沙410006）

隨著養(yǎng)豬業(yè)的規(guī)?；l(fā)展，豬人工授精技術(shù)在生產(chǎn)中的應(yīng)用越來越多，它具有提高良種利用率、減少疾病傳播和降低飼料成本等優(yōu)勢(shì)，是目前我國推行豬品種改良最有效的方法[1-2]。公豬精子密度的高低直接決定母豬生產(chǎn)性能和產(chǎn)仔數(shù)量，是人工授精的關(guān)鍵[3]。根據(jù)《種豬常溫精液國家標(biāo)準(zhǔn)》，最常使用的是血球計(jì)數(shù)板法，其準(zhǔn)確率最高，但操作過于繁瑣[4]。目前較方便的是分光光度計(jì)法，美卡精子密度儀正是基于這一原理研發(fā)出的用于測(cè)定家畜精液精子密度的一種較先進(jìn)設(shè)備，它的應(yīng)用使得精子密度的測(cè)定變得快速而簡便。但目前國內(nèi)外還沒有關(guān)于其在公豬精液密度中的實(shí)用性報(bào)道，本文主要針對(duì)其重復(fù)性和對(duì)不同品種公豬的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分析，旨在為美卡精子密度儀在豬精子測(cè)定中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及儀器、試劑

大白、長白、杜洛克種公豬，由瀏陽仁和種公豬站提供。

美卡精子密度儀，意大利美的科卡動(dòng)物育種公司制造。血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、顯微鏡等常規(guī)試驗(yàn)器具與試劑由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)臨床實(shí)驗(yàn)室提供。

越豐1號(hào)長效稀釋液由濟(jì)南洛克工貿(mào)有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 精液的采集與處理

用手套采精法采集公豬精液，采精前注意剃除包皮周圍的被毛，舍棄射精初期的部分和凝膠部分。將精液過濾后用稀釋液作梯度稀釋，分裝在集精瓶中，置于17℃恒溫箱中保存。每個(gè)品種分別采10頭公豬精液，在12h內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 密度的測(cè)定

血球計(jì)數(shù)板法：先按1:200的比例進(jìn)行稀釋，取20μL稀釋好的精液轉(zhuǎn)移到計(jì)數(shù)板上，5min后在400倍顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。選取位于計(jì)數(shù)板中心的5個(gè)大格的精子數(shù)量，通過換算得出每毫升的精子數(shù)量。

精子密度儀測(cè)定法：用稀釋液將儀器校零后，吸取0.2mL混勻的新鮮精液注入測(cè)試瓶中，然后加入9.8mL稀釋液，通過移液器混勻后蓋上測(cè)試瓶蓋子；按READ/DIRECT鍵，等待顯示屏上出現(xiàn)一個(gè)透光系數(shù)，對(duì)比說明書得出所測(cè)樣品的精子密度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所得數(shù)據(jù)采用EXCEL和SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果

2.1 精子密度儀檢測(cè)的可重復(fù)性和一致性

表1 精子密度儀的可重復(fù)性統(tǒng)計(jì)分析

從表1可知，同一樣品連續(xù)檢測(cè)12次，其精子密度變化很小，數(shù)據(jù)之間的差異不顯著（P>0.05），表明該儀器可重復(fù)性良好。變異系數(shù)也顯示該檢測(cè)系統(tǒng)具有較好的一致性。

2.2 精子密度儀檢測(cè)與血球計(jì)數(shù)法的比較

表2 精子密度儀在杜洛克公豬精液中的使用結(jié)果

表3 精子密度儀在大白公豬精液中的使用結(jié)果

表4 精子密度儀在長白公豬精液中的使用結(jié)果

通過對(duì)比分析可知，精子密度儀與計(jì)數(shù)板檢測(cè)結(jié)果之間有直線回歸關(guān)系，且不同品種公豬精液中的回歸方程有所不同，杜洛克為y=0.6502x+0.0128，大白為y=0.8364x+0.0511，長白為y=0.86x-0.0102?；貧w關(guān)系均達(dá)顯著水平（P＜0.05），其中大白與長白的回歸方程很相似。（式中：y為實(shí)際密度，x為系統(tǒng)檢測(cè)密度)。

從表2、3、4可以看出，精子密度儀換算后結(jié)果與計(jì)數(shù)板所測(cè)的豬精子密度結(jié)果無顯著差異（P>0.05），相關(guān)性較好，表明精子密度儀測(cè)定豬精子密度有較高的準(zhǔn)確性，可以代替計(jì)數(shù)板法在生產(chǎn)應(yīng)用中的使用。

3 討論

目前常用的檢測(cè)精子密度的方法有血球計(jì)數(shù)法、分光光度法和流式細(xì)胞儀法[5-7]。血球計(jì)數(shù)法因?yàn)椴僮鞣爆?，重?fù)性差[8]，在生產(chǎn)應(yīng)用中較少使用；流式細(xì)胞儀法雖無此缺點(diǎn)，但其儀器昂貴，在養(yǎng)殖場中也極少見到[9]。利用分光光度法測(cè)定精子密度的方法始于上世紀(jì)七八十年代，其具有快速、簡便的優(yōu)點(diǎn)，但由于當(dāng)時(shí)的技術(shù)條件不成熟，導(dǎo)致其準(zhǔn)確性不高。隨著養(yǎng)殖技術(shù)的不斷提高和一次性濾紙應(yīng)用使得分光光度法在豬精子密度檢測(cè)中的應(yīng)用成為了可能。美卡精子密度儀是由意大利美的科卡動(dòng)物育種公司出品，用來測(cè)定家畜精液中精子密度的一種較先進(jìn)設(shè)備，其原理為在特定波長下測(cè)定待檢樣品的吸光度，通過吸光度與精子密度的函數(shù)轉(zhuǎn)換，對(duì)樣品進(jìn)行定量分析。

利用美卡精子密度儀檢測(cè)豬精子密度的結(jié)果需要轉(zhuǎn)換的原因是其設(shè)定的程序并非是檢測(cè)豬精子密度，所以需要進(jìn)行矯正。通過對(duì)精子密度儀的重復(fù)性和一致性研究發(fā)現(xiàn)，該儀器可重復(fù)性良好，具有較好的一致性。應(yīng)用精子密度儀對(duì)不同品種公豬精液進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)比計(jì)數(shù)板的結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者具有顯著的直線回歸關(guān)系。經(jīng)換算，精子密度儀與計(jì)數(shù)板法所測(cè)結(jié)果無顯著差異，表明其準(zhǔn)確性較高。測(cè)得的密度值偏大可能是因?yàn)闇y(cè)定用的玻璃杯在使用過程中有一些磨損導(dǎo)致透光率下降或者操作時(shí)間較長，水分蒸發(fā)所導(dǎo)致。試驗(yàn)結(jié)果顯示，大白豬和長白豬的回歸方程相似，與杜洛克的回歸方程有較大差異，這可能與品種有關(guān)。有報(bào)道[10]指出，杜洛克公豬的精子活率和運(yùn)動(dòng)能力顯著高于大白豬和長白豬。另外，不同品種公豬的睪丸大小、精子畸形率也不一樣[11-12]，但究竟是何原因還有待進(jìn)一步深入探究。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，美卡精子密度儀對(duì)精子密度很高的精液和精子密度較低的精液準(zhǔn)確性不理想，而對(duì)精子密度在0.6~2.7億/mL的精液測(cè)定結(jié)果最可靠。因此，在檢測(cè)精子密度之前，建議將原精進(jìn)行適當(dāng)4~8倍稀釋。種豬常溫精液標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)精子密度的要求是大于1億/mL，說明美卡精子密度儀能適用生產(chǎn)實(shí)際中的需要。

綜上所述，美卡精子密度儀具有準(zhǔn)確、快速、簡便等優(yōu)點(diǎn)，能取代復(fù)雜而繁瑣的血細(xì)胞計(jì)數(shù)法在生產(chǎn)實(shí)際中的使用，這不僅能提高實(shí)驗(yàn)人員的工作效率，還能使精液得到較好的稀釋，從而提高精液產(chǎn)品的質(zhì)量和農(nóng)戶的生產(chǎn)效益。隨著養(yǎng)殖條件的不斷提高，美卡精子密度儀的應(yīng)用將逐步擴(kuò)大。

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