胡懷強(qiáng)周永紅張皓

（1中國(guó)人民解放軍濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，濟(jì)南250031；2青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青島266021）

化濁行血顆粒對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化模型大鼠頸總動(dòng)脈NF-κB的作用※

胡懷強(qiáng)1周永紅2*張皓2

（1中國(guó)人民解放軍濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，濟(jì)南250031；2青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青島266021）

目的研究化濁行血顆粒對(duì)食餌性動(dòng)脈粥樣硬化模型大鼠頸總動(dòng)脈核因子-κB的影響，探討中藥治療AS的有效方法。方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按質(zhì)量隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組和藥物組，每組12只，采用高脂飼料法建立大鼠食餌性AS模型。建模后，藥物組灌胃給予化濁行血顆粒水溶液（12 g生藥/kg·d），正常對(duì)照組、模型組分別給予等容量的蒸餾水，連續(xù)8周。免疫印跡法觀察NF-κB表達(dá)。結(jié)果與正常對(duì)照組比較，模型組和藥物組NF-κB均顯著增高（P＜0.01）；與模型組比較，藥物組NF-κB顯著降低（P＜0.01）。結(jié)論化濁行血顆?？捎行м卓购艘蜃?κB，從而抑制AS的發(fā)生、發(fā)展。

化濁行血顆粒；動(dòng)脈粥樣硬化；核因子-κB；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

以動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）為主要病理基礎(chǔ)的慢性疾病嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康，已經(jīng)成為我國(guó)的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題［1］，防治AS具有重要的健康效應(yīng)和經(jīng)濟(jì)效應(yīng)［2］。AS發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，單一環(huán)節(jié)藥物作用無(wú)法取得滿(mǎn)意效果，中藥因其具有多種生物學(xué)活性、多靶點(diǎn)治療作用而備受關(guān)注。核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）的活化可誘發(fā)AS產(chǎn)生并加重其發(fā)展［3-4］，成為動(dòng)脈粥樣硬化及其相關(guān)并發(fā)癥的潛在治療靶點(diǎn)，本文觀察了中藥對(duì)食餌性AS大鼠頸總動(dòng)脈NF-κB的作用，以期尋找新的有效治療AS的中藥復(fù)方。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成年SPF級(jí)雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠36只，體重250～300 g，由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可號(hào)：SCXK（魯）20090001（山東省科學(xué)技術(shù)廳發(fā)），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：魯動(dòng)質(zhì)號(hào)1205215（山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)發(fā)），檢疫后備用，自由攝食進(jìn)水。顆粒大鼠飼料，由濟(jì)南康大飼料與山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心聯(lián)合生產(chǎn)，許可證號(hào)：魯飼準(zhǔn)字364號(hào)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物飼養(yǎng)及取材均遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和保護(hù)的有關(guān)規(guī)定。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物化濁行血顆粒，主要由荷葉、焦山楂、決明子、制水蛭、酒大黃、赤芍、路路通、虎杖、何首烏等組成，由山東魯信藥業(yè)有限公司生產(chǎn)（批號(hào)：2012031701），并按照成人劑量的20倍（12 g/kg/d）將其制成水溶液，濃度為1.2 g/ml（即1 ml/100 g），置于4℃冰箱中備用。

1.1.3 主要試劑NF-κB抗體，美國(guó)Sigma公司；細(xì)胞及組織總蛋白抽提試劑盒，上?？党缮锕こ逃邢薰荆籅CA蛋白質(zhì)定量試劑盒，上?？党缮锕こ逃邢薰?；濃縮型DAB試劑盒，北京中杉金橋生物科技有限公司；Tris，美國(guó)Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 分組方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)買(mǎi)后，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，1 w后按體重隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組和藥物組，每組大鼠各12只。因灌胃致吸入性肺炎模型組死亡2只、藥物組死亡1只。

1.2.2 造模方法參照文獻(xiàn)［5］建立大鼠食餌性AS模型，AS大鼠（包括藥物組和模型組）喂食高脂飼料（配方：3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、10%豬油、81.3%基礎(chǔ)飼料），同時(shí)在喂食開(kāi)始時(shí)一次性腹腔注射維生素D 60萬(wàn)IU/kg。對(duì)照組按照體重給予同等體積的生理鹽水。連續(xù)喂12周。

1.2.3 給藥方法造模后，藥物組灌胃給予化濁行血顆粒水溶液，劑量為12 g生藥/kg/d（相當(dāng)于70 kg成人每日10倍用量）；正常對(duì)照組、模型組分別給予等容量的蒸餾水，連續(xù)8周。

1.2.4 動(dòng)物處理與取材給藥結(jié)束后禁食8 h，100 g/L水合氯醛腹腔注射（300 mg·kg）麻醉動(dòng)物，分離頸總動(dòng)脈血管，用生理鹽水沖洗后置于多聚甲醛后固定液（含0.1%DEPC）、4%戊二醛溶液中固定，參照文獻(xiàn)［6-7］制備頸總動(dòng)脈提取物，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆么郎y(cè)。

1.2.5 頸總動(dòng)脈NF-κB表達(dá)采用免疫印跡法（Western blot）觀察。蛋白質(zhì)抽提，按照BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行BCA蛋白定量測(cè)定。SDS-PAGE電泳：制備分離膠、制備積層膠、樣品準(zhǔn)備，加入電泳緩沖液，上樣電泳，使用BioRad電泳裝置，樣品首先在80V恒定電壓下電泳至染料接近分離膠頂端，然后120V恒定電壓電泳至溴酚藍(lán)剛出膠底部，凝膠電泳于4℃。蛋白轉(zhuǎn)移，膜的封閉和抗體孵育：膜在5%BSA溶液中室溫孵育1小時(shí)以封閉膜上的非特異結(jié)合，封閉過(guò)的膜加入一抗體4℃過(guò)夜，抗原抗體結(jié)合，加入HRP標(biāo)記的二級(jí)抗體以結(jié)合一級(jí)抗體及HRP標(biāo)記的抗生物素抗體以結(jié)合分子量標(biāo)準(zhǔn)，室溫孵育膜1小時(shí)。TKCTM化學(xué)發(fā)光試劑盒中兩種試劑等比例混合為反應(yīng)液，將膜置于反應(yīng)液中室溫孵育3分鐘，去除過(guò)量的溶液，將膜夾在兩塑料薄膜之間，以X光膠片曝光，對(duì)膠片進(jìn)行掃描，圖片掃描保存為電腦文件，并用ImageJ分析軟件將圖片上每個(gè)特異條帶灰度值的數(shù)字化。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有資料數(shù)據(jù)用SAS8.1版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)、q檢驗(yàn)；組間比較用單因素方差分析，所用計(jì)量資料均采用（x±s）（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示。P為雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05為有顯著性差異，P＜0.01為有非常顯著性差異。

2 結(jié)果

與正常對(duì)照組比較，模型組和藥物組NF-κB均顯著增高（P＜0.01）；與模型組比較，藥物組NF-κB顯著降低（P＜0.01）（見(jiàn)表1）。

表1 免疫印跡法觀察大鼠頸總動(dòng)脈NF-κB表達(dá)的變化

3 討論

AS是一種復(fù)雜的血管炎性疾病，炎癥反應(yīng)貫穿其發(fā)生、發(fā)展的全過(guò)程［8］。研究發(fā)現(xiàn)，AS炎癥病變過(guò)程中炎性細(xì)胞的激活和炎性細(xì)胞因子的釋放與NF-κB的激活密切相關(guān)［9-10］。NF-κB屬于Rel蛋白家族，該家族包括一系列結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的蛋白質(zhì)，在機(jī)體多種生物學(xué)活性物質(zhì)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程中均起著重要作用，因而被稱(chēng)為核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB。激活的NF-κB進(jìn)入胞核與相應(yīng)靶序列結(jié)合，調(diào)節(jié)相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄活性，參與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和自由基損傷等病理生理過(guò)程［11］，NF-κB的活化可以調(diào)節(jié)多種致AS炎癥基因的表達(dá)，并通過(guò)炎癥因子之間的連鎖放大效應(yīng)加速AS的形成［12］。在形成AS的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，NF-κB的活化是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化一個(gè)中心環(huán)節(jié)［3-4］，因而對(duì)NF-κB進(jìn)行干預(yù)，可有效控制AS的發(fā)生和發(fā)展。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，血濁是AS的病理樞紐，清化血濁可調(diào)整臟腑功能狀態(tài)，增強(qiáng)臟腑功能，使氣旺血和，血脈暢通，瘀祛新生，氣化復(fù)常，痰濁得消，經(jīng)絡(luò)得通，為AS的基本治法?；瘽嵝醒w粒主要由荷葉、焦山楂、決明子、制水蛭、酒大黃、赤芍、路路通、虎杖、何首烏等藥物組成，該方一可化濁，清化血中濁邪，恢復(fù)血液的清純精專(zhuān)狀態(tài)；二可行血，及時(shí)改善血濁帶來(lái)的血行障礙以及脈道紊亂狀態(tài)［13］，充分體現(xiàn)了清化血濁的治療方法。該方是本課題組使用多年的臨床經(jīng)驗(yàn)方，在治療AS方面有較好的療效［14］。

本文觀察了化濁行血顆粒對(duì)AS模型大鼠頸總動(dòng)脈NF-κB的影響，研究結(jié)果顯示，模型組中大鼠頸總動(dòng)脈NF-κB較正常對(duì)照組明顯升高，二者之間有顯著性差異（P＜0.01），表明高脂飼料喂養(yǎng)可激發(fā)大鼠動(dòng)脈內(nèi)NF-κB活化，從而誘發(fā)、加重動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展。藥物組大鼠頸總動(dòng)脈NF-κB較正常對(duì)照組升高，但較模型組明顯降低，且三組之間有顯著性差異（P＜0.01），說(shuō)明化濁行血顆粒可有效抑制食餌性動(dòng)脈粥樣硬化模型大鼠頸總動(dòng)脈NF-κB表達(dá)，表明清化血濁法可有效抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展。

［1］Heron M，Hoyert DL，MurphySL，et al.Deaths:final data for 2006［J］.Natl Vital Stat Rep.2009，57（14）:1-134.

［2］蔣立新，李希，李靜，等.中國(guó)動(dòng)脈粥樣硬化性缺血性腦卒中患者他汀類(lèi)藥物應(yīng)用現(xiàn)狀調(diào)查［J］.中華流行病學(xué)雜志.2010（8）:925-928.

［3］Brand K，Page S，Rogler G，et al.Activated transcription factor nuclear factorkappa Bispresent in the atherosclerotic esion［J］.J Clin Invest.1996；97:1715.

［4］王敏，曹秉振.缺血性腦損傷與核因子κB［J］.中國(guó)臨床康復(fù)，2006，10（42）：110.

［5］楊鵬遠(yuǎn)，芮耀誠(chéng)，焦亞斌.動(dòng)脈粥樣硬化大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕ⅲ跩］.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，24（7）：802-804.

［6］Heather M，Mattern Pamela G.，Lloyd Michael Sturek，Christopher D Hardin. Gender and genetic differences in bladder smooth muscle PPAR mRNA in a porcine model ofthe metabolic syndrome［J］.Mol Cell Biochem，2007，302:43-49.

［7］Shannon E.Dunn，I Shalina S.Ousman，I Raymond A，et al.Peroxisome proliferator activated receptor（PPAR）α expression in Tcells mediates gender diff erences in development ofTcell mediated autoimmunity［J］.The Journal of Experimental Medicine，2007，204（2）:321-330.

［8］Hansson G.Immune mechanisms in athersclerosis.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2001，21:1876-1890.［46］Sun Z，Andersson R.NF-kappa B activation and inhibition:a review［J］.Stroke，2002，18（2）:99-106.

［9］Israelian-Konaraki Z，Reaven PD.Peroxisome proliferator-activated receptoralpha and atherosclerosis:from basic mechanisms to clinical implications［J］. Cardiology.2005，103（1）:1.

［10］Schleser S，Ringseis R，Eder K.Conjugated linoleic acids have no effect on TNF alpha-induced adhesion molecule expression，U937 monocyte adhesion，and chemokine release in human aortic endothelial cells［J］.Atherosclerosis. 2006，186（2）:337-344.

［11］Sun Z，Andersson R.NF-kappa B activation and inhibition:a review［J］. Stroke，2002，18（2）:99-106.

［12］Chen F，Castranova V，Shi X，et al.New insights into the role of nuclear factor-kappaB，a ubiquitous transcription factor in the initiation of diseases［J］. Clin Chem，1999，45（1）:7.

［13］王新陸.腦血辨證［M］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2002：110.

［14］胡懷強(qiáng)，周永紅，曹秉振，等.化濁行血丸治療頸動(dòng)脈粥樣硬化癥的臨床研究［J］.天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，29（2）：66-68.

Effect of the Huazhuo Xingxue Granules on NF-κB in the Common Carotid Artery of Atherosclerosis Rats

HU Huaiqiang1，ZHOU Yonghong2，ZHANGHao2
（1.Department of Neurology，the General Hospital of Jinan Military Command，Jinan250031，China；2.Medical College of Qingdao University，Shandong Province，Qingdao266021，China）

Objective To explore the effect of Huazhuo Xingxue granules on nuclear factor kappa B（NF-κB）in the common carotid artery of atherosclerosis rats.Methods The rats were randomly divided into control，model，and medicine groups.The medicine group was administrated with Huazhuo Xingxue granules for a course of 8 weeks after the atherosclerosis model rats were established by high fat diet.The control group and model group were taken orally equivolumetric distilled water.NF-κB was measured by western blotting.Results The NF-κB of model，medicine groups obviously increased，which were significantly difference with the control group（P＜0.01）.The NF-κB of medicine group was significantly less than that of the model group（P＜0.01）.Conclusion Huazhuo Xingxue granules can resist NF-κB to inhibit the development of atherosclerosis.

Huazhuo Xingxue granules；atherosclerosis；nuclear factor kappa B；animal experiment

10.3969/j.issn.1672-2779.2015.10.070

1672-2779（2015）-10-0136-03

：張文娟本文校對(duì)：毛妮

2015-04-09）

山東省自然科學(xué)基金（No：ZR2010HM109）；山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家基金（No：2009BSB02208）

*通訊作者：qduzyh@126.com