麻文建, 朱天輝, 韓 珊

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院, 雅安 625014)

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寄生隱叢赤殼菌ITS分子檢測技術(shù)研究

麻文建, 朱天輝*, 韓 珊

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院, 雅安 625014)

寄生隱叢赤殼菌是引起板栗疫病的致病菌。為建立該菌的分子檢測技術(shù),本研究首先采用通用引物ITS1/ITS4對分離自四川雅安、瀘州及重慶的寄生隱叢赤殼菌及其他參試菌株的ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序比對。根據(jù)該片段與GenBank中隱叢赤殼屬其他種的ITS序列差異,設(shè)計(jì)了寄生隱叢赤殼菌的特異性引物ITSP1/ITSP2,片段擴(kuò)增大小為462 bp。利用該引物對菌株基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，可以將寄生隱叢赤殼菌與其他參試菌區(qū)分開,檢測靈敏度達(dá)30 pg。而以引物ITS1/ITS4和ITSP1/ITSP2進(jìn)行的巢氏PCR,可檢測到30 fg基因組DNA,其靈敏度較常規(guī)PCR提高了1 000倍。利用巢氏PCR 檢測體系對發(fā)病程度不同的組織和攜菌組織進(jìn)行檢測,均能快速穩(wěn)定地檢測出寄生隱叢赤殼菌。

寄生隱叢赤殼菌; 分子檢測; ITS; 特異引物; 巢氏PCR

板栗疫病廣泛分布于世界各地,是栗樹的主要病害。該病于1904年首次在美洲發(fā)現(xiàn),由于其危害嚴(yán)重,蔓延迅速,曾使歐美一些地區(qū)栗樹遭到滅種的威脅[1]。我國于1913年發(fā)現(xiàn)該病,隨后各地陸續(xù)有報(bào)道[2]。Anagnostakis[3]認(rèn)為我國板栗品種有較高的抗病性,但多數(shù)地區(qū)該病仍有不同程度的發(fā)生。近幾年受氣候和環(huán)境等因素的影響,板栗疫病發(fā)病呈上升趨勢,已經(jīng)成為板栗產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要限制因素[4-5]。

引起板栗疫病的病原菌屬子囊菌亞門(Ascomycotina),核菌綱(Pyrenomycetes),球殼菌目(Sphaeriales),間座殼科(Diaporthaceae),學(xué)名為寄生隱叢赤殼菌[Cryphonectriaparasitica(Murrill) M.E. Barr]。主要危害中國板栗(CastaneamollissimaBlume)、歐洲板栗(C.sativaMill.)、錐栗[C.henryi(Skan) Rehd.etWils.]、美洲板栗[C.dentata(Marsh.) Borkh.]等山毛櫸科植物[1]。該病原主要以傷口侵入方式為主,其癥狀表現(xiàn)為主干、分枝及小枝上出現(xiàn)爛皮、潰瘍,嚴(yán)重時(shí)整個(gè)枝條甚至全株枯死。2005年之前,我國曾將板栗疫病列入森林植物檢疫對象,之后雖被取消,但仍屬于全國林業(yè)危險(xiǎn)性有害生物[6]。目前對該病尚無有效的根除措施[7],只能加強(qiáng)檢疫防止其流行和暴發(fā)。過去對板栗疫病的檢疫主要依靠病原形態(tài)、病害特征判斷,不僅費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、準(zhǔn)確性低,且對潛伏期和發(fā)病初期病害難以識別,例如板栗疫病發(fā)病初期病斑形狀與樹皮皮孔極為相似,普通方法難以區(qū)分。

近年來,PCR及各種基于PCR的技術(shù)被廣泛應(yīng)用于植物病原分子檢測。其中基于核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列特征的PCR技術(shù)的應(yīng)用最為廣泛。ITS區(qū)在種內(nèi)具有保守性,在科、屬間及屬內(nèi)不同種間又具有特異性,利用這一特點(diǎn)設(shè)計(jì)特異引物來檢測病原菌,很大程度上推動了植物病害的檢測和病原鑒定工作[8-9]。ITS-PCR技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),已在劍蘭和茶樹炭疽菌(Colletotrichum)[10-11],雪松、煙草、大豆等各種疫霉菌(Phytophthora)[12-15],落葉松枯梢病菌[Botryosphaerialaricina(K.Sawada)][16],大豆北方莖潰瘍病菌(Diaporthephaseolorumvar.caulivoraAthow & Caldwell)[17]及鐮孢屬(Fusarium)[18]等病原菌的鑒定、分類、系統(tǒng)發(fā)育及檢測研究方面得到廣泛應(yīng)用。與此同時(shí),許多新的檢測方法應(yīng)用也是以ITS-PCR為基礎(chǔ)開展的,如Real-time PCR[19-22],多重PCR技術(shù)等[23-24]。目前,國內(nèi)有關(guān)寄生隱叢赤殼菌分子檢測的研究還未見報(bào)道,本研究旨在根據(jù)寄生隱叢赤殼菌的ITS序列特征,設(shè)計(jì)特異性引物,建立一套快速、準(zhǔn)確、高效的PCR檢測方法,方便檢疫部門檢測診斷時(shí)使用,也為板栗疫病的早期診斷及防治提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 參試菌株

本研究采用的寄生隱叢赤殼菌及其他參試菌株分離自不同板栗栽培區(qū)的發(fā)病板栗枝干組織。編號代表不同地區(qū)或同一地區(qū)不同發(fā)病植株上所分離的不同菌株。樣本均采自具有典型潰瘍斑的枝條或枯死的板栗枝干組織。菌株編號、菌種、分離地區(qū)及引物特異性驗(yàn)證詳見表1。

表1 參試菌株信息及引物驗(yàn)證結(jié)果1)

1) “+”表示有條帶;“-”表示無條帶。

“+” a single PCR band; “-” no PCR band.

1.2 參試菌菌絲收集及DNA提取

1.2.1 菌絲收集

所有參試菌株經(jīng)PDA培養(yǎng)基純化培養(yǎng)后,挑取新鮮菌絲塊接入PDB液體培養(yǎng)基中,25 ℃振蕩培養(yǎng)7 d,用滅菌紗布過濾,用滅菌蒸餾水沖洗3次,收集菌絲,凍干搗成粉末,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 參試菌基因組DNA提取

參考許立強(qiáng)等[25]的方法，略有改動。取約100 mg凍干菌粉置于2 mL離心管中，加入1 mL裂解緩沖液(150 mmol/L EDTA, 50 mmol/L, Tris pH 8.0,3% SDS)，充分混勻后置于65 ℃水浴1 h；12 000 r/min離心5 min；取上清液，加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)混勻，12 000 r/min離心3 min；取上清，加入65 μL 5 mmol/L NaCl和1 mL酚/氯仿/異戊醇混勻，12 000 r/min離心3 min，取上清液，加入65 μL 5 mol/L NaCl和300 μL的異丙醇混勻，12 000 r/min離心1 min；棄上清，加300 μL 70%乙醇洗滌沉淀，晾干至無乙醇味；加入100 μL TE(10 mmol/L Tris,1 mmol/L EDTA)溶解DNA，加入1 μL RNA酶，37 ℃水浴1 h,加入500 μL氯仿/異戊醇(24∶1)，12 000 r/min離心5 min，重復(fù)2次；取上清，加1/10體積的3 mol/L 的NaAc溶液和2.5倍體積的無水乙醇，-70 ℃沉淀1 h；最后用75%乙醇漂洗沉淀，風(fēng)干后加100 μL TE溶解，所提DNA在紫外分光光度計(jì)(UV-3600)下測定A260和A280，A260/A280在1.80左右表明其純度較好，DNA溶液保存于-20 ℃，PCR反應(yīng)時(shí)稀釋至30 ng/μL。

1.3 利用通用引物擴(kuò)增ITS序列

利用White等[26]設(shè)計(jì)的真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3-3′)/ITS4 (5′-TCC-TCCGCTTATTGATATGC-3′)擴(kuò)增所有參試菌株的基因組DNA。

PCR反應(yīng)體系和程序:反應(yīng)混合液總體積為25 μL,包括10×PCR buffer(100 mmol/L Tris-HCl,pH 8.3, 500 mmol/L KCl)2.5 μL、 10 μmol/L的引物ITS1/ITS4各0.8 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、25 mmol/L MgCl22 μL、5 U/μLTaq酶0.2 μL、模板DNA 1 μL,加滅菌雙蒸水補(bǔ)足25 μL。以滅菌水代替模板DNA作為陰性對照。反應(yīng)混合液于Mastercycler Personal PCR儀(Eppendorf)上進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性40 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后,取5 μL PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳30 min(120 V),經(jīng)EB染色后,在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并拍照。

按照天根瓊脂糖DNA回收試劑盒說明書對PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收、純化,送往上海生工生物工程有限公司測序。

1.4 特異引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室測得的寄生隱叢赤殼菌ITS序列和已報(bào)道的Cryphonectria屬其他種(登錄號:AF452115、AY697940、EU442647、EF026116、EU442648、EU442655)的ITS序列差異設(shè)計(jì)寄生隱叢赤殼菌的特異引物ITSP1(5′-CCAGATACCCTTTGTGAACT-3′)/ITSP2(5′-TCAGAGTCTTAGCGAGCC-3′),擴(kuò)增片段大小462 bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.5 特異引物PCR驗(yàn)證

利用引物ITSP1/ITSP2對所有參試菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系同1.3，以特異性引物ITSP1/ITSP2代替ITS1/ITS4。以滅菌雙蒸水代替模板DNA為陰性對照。反應(yīng)混合液于Mastercycler Personal PCR儀(Eppendorf)上進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性40 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸40 s,共35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min。取10 μL PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳,經(jīng)EB染色后,在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并拍照。

1.6 靈敏度檢測

將寄生隱叢赤殼菌的基因組DNA以10倍濃度梯度稀釋成30 ng/μL、3 ng/μL、300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、300 fg/μL、30 fg/μL、3 fg/μL、300 ag/μL。各取1 μL作為常規(guī)PCR和巢氏PCR的反應(yīng)模板,比較兩者靈敏度。

1) 常規(guī)PCR:反應(yīng)混合液總體積為25 μL,其中10×PCR buffer(100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.3; 500 mmol/L KCl)2.5 μL、10 μmol/L引物ITSP1/ITSP2各0.1 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、25 mmol/L MgCl22 μL、5 U/μLTaq酶 0.2 μL、DNA模板1 μL,滅菌雙蒸水補(bǔ)足至25 μL。擴(kuò)增程序同1.5。

2) 巢氏PCR:以真菌通用引物ITS1/ITS4為第一輪PCR擴(kuò)增引物,反應(yīng)體系和程序同1.3。其PCR產(chǎn)物稀釋10倍后作為第二輪PCR的模板,以ITSP1/ITSP2為第二輪反應(yīng)的引物。第二輪反應(yīng)體系和程序同常規(guī)PCR。

1.7 板栗枝干組織中寄生隱叢赤殼菌的檢測

分別采集不同發(fā)病程度的板栗疫病樣本:新枯死組織、具有典型癥狀的發(fā)病組織、初發(fā)病組織、感染未發(fā)病組織、枯死株殘?bào)w及健康組織。用刀片切取100 mg左右的組織,用70%乙醇表面消毒后,蒸餾水沖洗,吸水紙吸干組織表面水滴,置于研缽中用液氮研磨成粉末, 采用天根公司植物基因組DNA提取試劑盒(Plant Genomic DNA Kit)提取樣品DNA。

分別采用1.6中常規(guī)PCR和巢氏PCR的體系和程序進(jìn)行檢測,以ddH2O為陰性對照。反應(yīng)結(jié)束后,取5 μL PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 利用通用引物擴(kuò)增ITS序列

利用真菌通用引物ITS1/ITS4能從寄生隱叢赤殼菌及其他參試菌株中擴(kuò)增出650 bp左右的條帶,而陰性對照無條帶(圖1),表明所有菌株基因組DNA均成功提取,可以用于后續(xù)PCR擴(kuò)增。應(yīng)用軟件MEGA 5.0對寄生隱叢赤殼菌及其他參試菌株的ITS序列進(jìn)行比對分析,結(jié)果表明，來自重慶、四川雅安和瀘州的寄生隱叢赤殼菌病原菌ITS序列并無差異,同源性達(dá)100%。向NCBI提交序列后獲得登錄號:KJ528274、KJ528273、KJ528272。

圖1 通用引物ITS1/ITS4對供試菌株P(guān)CR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR products of tested strains using universal primers ITS1/ITS4

2.2 引物特異性驗(yàn)證

引物ITSP1/ITSP2能從寄生隱叢赤殼菌中擴(kuò)增出1條462 bp的條帶(圖2),其他參試菌株及陰性對照均無任何條帶,說明該引物對寄生隱叢赤殼菌具有特異性。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收測序比對表明,該片段與GenBank中寄生隱叢赤殼菌的ITS區(qū)序列同源性為100%,證明該P(yáng)CR片段來源于寄生隱叢赤殼菌,故排除假陽性的可能。

圖2 引物ITSP1/ITSP2特異性檢測Fig.2 PCR amplification of Cryphonectria parasitica using specific primers ITSP1/ITSP2

2.3 引物靈敏度檢測

由圖3可知,常規(guī)PCR檢測極限為30 pg的基因組DNA,低于30 pg則不能檢測到條帶,而巢氏PCR可達(dá)到30 fg,其檢測靈敏度至少提高了1 000倍。田間植物病害的分子檢測需要有較高的準(zhǔn)確性和靈敏度,尤其從病狀不明顯或隱癥病害樣本中提取病原菌的DNA,其含量往往極低,常規(guī)PCR很難檢測到,而巢氏PCR則可以滿足檢測要求。

圖3 巢氏PCR和常規(guī)PCR的靈敏度檢測Fig.3 Sensitivity of nested PCR and regular PCR for detection of Cryphonectria parasitica

2.4 板栗枝干組織中寄生隱叢赤殼菌的檢測

分別采集自然條件下健康、感染未發(fā)病、感染初發(fā)病、典型發(fā)病組織、新枯死組織和病株殘?bào)w,提取基因組DNA后,先后采用常規(guī)PCR和巢氏PCR檢測寄生隱叢赤殼菌,結(jié)果(圖4)表明,利用真菌通用引物ITS1/ITS4進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增時(shí)僅新枯死組織和典型發(fā)病組織擴(kuò)增出條帶，且出現(xiàn)了雜帶,可能是該引物對植物樣本DNA或其他真菌DNA的ITS區(qū)也進(jìn)行了PCR擴(kuò)增,但不影響對寄生隱叢赤殼菌的第二輪PCR檢測。利用特異引物ITSP1/ITSP2進(jìn)行常規(guī)PCR和巢氏PCR可以從典型發(fā)病組織和新枯死組織中檢測到寄生隱叢赤殼菌,而巢氏PCR還可以從初發(fā)病、病株殘?bào)w和攜菌組織中檢測到病原菌,說明巢氏PCR具有較高靈敏度和特異性,更適合于田間板栗疫病的快速、準(zhǔn)確檢測。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序比對和病原分離鑒定,結(jié)果表明檢測出的含有病原的樣本均含有寄生隱叢赤殼菌。

圖4 利用常規(guī)PCR和巢氏PCR檢測板栗組織中寄生隱叢赤殼菌Fig.4 Detection of Cryphonectria parasitica from Castanea spp. by using nested PCR and regular PCR

3 結(jié)論與討論

板栗疫病是世界范圍內(nèi)的一種病害,從發(fā)現(xiàn)至今國內(nèi)外許多學(xué)者對其開展了廣泛和深入的研究。目前主要集中在對寄生隱叢赤殼菌的遺傳[27-28]、營養(yǎng)體親和[29-30]、致病機(jī)理[31]、防治[32]的研究上,關(guān)于其分子檢測方面的相關(guān)報(bào)道較少。Popov等[33]根據(jù)寄生隱叢赤殼菌的信息素前體編碼基因設(shè)計(jì)引物用于PCR分子檢測;Marra等[34]用DNA雜交技術(shù)設(shè)計(jì)出栗疫菌交配型特異性引物及配套巢氏引物,用于區(qū)分兩種交配型。潘琪等[29]用栗疫菌交配型特異性引物以及配套巢氏引物PCR,用于野生菌菌株交配型測定。而國內(nèi),針對該病原菌開展分子檢測尚未見報(bào)道。

本研究通過對GenBank中寄生隱叢赤殼屬(Cryphonectria)其他種和本實(shí)驗(yàn)室所測得的寄生隱叢赤殼菌ITS區(qū)序列進(jìn)行同源性比對,設(shè)計(jì)了一對用于檢測寄生隱叢赤殼菌的特異性引物ITSP1/ITSP2。利用該對引物對參試菌株基因組DNA進(jìn)行了PCR擴(kuò)增,結(jié)果表明,該引物具有較高的特異性,僅從寄生隱叢赤殼菌基因組中擴(kuò)增出1條462 bp的條帶,其他參試菌株和陰性對照均無任何條帶。常規(guī)PCR和巢氏PCR的靈敏度檢測結(jié)果表明,兩種方法均有較高的靈敏度,但巢氏PCR是經(jīng)過兩輪擴(kuò)增,具有更高的檢測靈敏度,可以檢測到3 fg的基因組DNA,是常規(guī)PCR的1 000倍以上。對板栗不同發(fā)病程度組織的檢測結(jié)果也表明巢氏PCR對病狀不明顯、隱癥病害尤其有效,這與許多學(xué)者的報(bào)道一致[35]。因此,巢氏PCR更適合用于田間病害的早期診斷。

引物ITS1/ITS4和ITSP1/ITSP2組成的巢氏PCR,能從參試菌株和發(fā)病程度不同的植物組織中檢測出寄生隱叢赤殼菌,準(zhǔn)確率達(dá)100%,這對板栗疫病的早期診斷具有較高的實(shí)用價(jià)值。從研究材料上來講,本研究選取了不同來源地的病原菌和部分分離自板栗植株上的其他菌株為參試菌,因而材料有一定的代表性,若將該項(xiàng)技術(shù)開發(fā)成分子檢測試劑盒來推廣應(yīng)用則需要更多的樣本進(jìn)行驗(yàn)證。從研究技術(shù)來講,本研究所采用的檢測技術(shù)只做到了定性檢測,還未能做到定量檢測,因此,開展寄生隱叢赤殼菌定量檢測將是我們今后的研究方向。

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(責(zé)任編輯：楊明麗)

Molecular detection ofCryphonectriaparasiticabased on internal transcribed spacer (ITS) sequences

Ma Wenjian, Zhu Tianhui, Han Shan

(College of Forestry, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

Cryphonectriaparasitica, an important pathogenic fungus, causes chestnut blight inCastaneamollissima. The objective of this study was to set up a PCR-based technique for detection ofC.parasitica. The internal spacer(ITS) sequences ofC.parasiticaand other strains isolated from Ya’an, Luzhou and Chongqing region were obtained by PCR amplification using fungal universal primers ITS1 and ITS4. Based on different ITS sequences ofCryphonectriagenus, a pair of species-specific primers ITSP1 and ITSP2 were designed. PCR results showed that primers ITSP1/ITSP2 amplified a single product of 462 bp from DNA prepared fromC.parasitica, but not from other strains. The detection sensitivity was 30 pg of genomic DNA. Nested PCR using primers ITS1/ITS4 and ITSP1/ITSP2 could detect 30 fg of genomic DNA and the detection sensitivity was 1 000 fold higher than that of regular PCR. This nested PCR could stably and quickly detectC.parasiticafrom natural diseased and infected plant tissues.

Cryphonectriaparasitica; molecular detection; ITS; specific primer; nested PCR

2014-05-07

2014-09-07

教育部博士點(diǎn)基金(00329701)

S 432.44

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.04.023

* 通信作者 E-mail:zhuth1227@tom.com