侯巨梅, 王玉瑩, 左豫虎, 趙豐舟, 王星茗, 劉 銅

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理與應(yīng)用微生物研究所, 大慶 163319)

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玉米彎孢葉斑病菌Clg2基因克隆、序列特征和不同發(fā)育階段表達(dá)分析

侯巨梅, 王玉瑩, 左豫虎, 趙豐舟, 王星茗, 劉 銅*

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理與應(yīng)用微生物研究所, 大慶 163319)

異源三聚體G信號(hào)通路在調(diào)控植物病原真菌的形態(tài)、侵染結(jié)構(gòu)形成和致病力等方面具有重要作用。本研究根據(jù)玉米彎孢葉斑病菌新月彎孢全長cDNA文庫中的EST序列,克隆獲得一個(gè)含1 074 bp開放讀碼框(ORF)Gα基因。該基因包含5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子, 編碼357個(gè)氨基酸,被命名為Clg2。通過序列比對(duì)和進(jìn)化樹分析,證明Clg2蛋白具有Gα蛋白結(jié)構(gòu)特征和保守序列區(qū),與小麥黃斑葉枯病菌(Pyrenophoratritici-repentisPt-1C-BFP)和大斑剛毛座腔菌(Setosphaeriaturcica)中的Gα蛋白相似性高達(dá)96%和97%,處于同一分支。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析了Clg2基因在病菌不同發(fā)育階段的表達(dá)水平,顯示在菌絲中表達(dá)水平最低,在分生孢子中表達(dá)量最高,暗示Clg2基因在病菌分生孢子形成期起重要作用。上述結(jié)果將為開展Clg2蛋白功能研究奠定基礎(chǔ)。

G蛋白; 玉米彎孢葉斑病菌; Gα; 熒光定量PCR

由新月彎孢[Curvularialunata(Wakker) Boedijn]引起的玉米彎孢葉斑病是我國玉米上普遍發(fā)生的一種重要葉部病害,給玉米生產(chǎn)帶來嚴(yán)重影響,有時(shí)甚至超過玉米大斑病和瘤黑粉病引起的損失[1-3]。近年來隨著針對(duì)該病原菌的具有熱帶和亞熱帶血緣的抗性品種的選育和推廣應(yīng)用,該病害的危害程度明顯降低,然而人們研究發(fā)現(xiàn)該病原菌致病性變異和生理分化現(xiàn)象非常明顯[4-5],表明該病害有潛在大發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn),因此深入研究該菌的致病機(jī)理具有重要意義。但目前對(duì)該病菌的致病機(jī)理研究僅局限于致病因子鑒定和調(diào)控機(jī)理研究[6-7],由G蛋白介導(dǎo)的信號(hào)通路對(duì)該病菌的致病調(diào)控作用尚未見報(bào)道。

異源三聚體G蛋白是一類在真核生物中高度保守的蛋白,由α、β和γ3個(gè)亞基構(gòu)成,各亞基由獨(dú)立的基因編碼[8-9]。α亞基分子種類最為多樣,分子量在39～46 kD之間,具有一個(gè)GDP結(jié)合位點(diǎn)。β亞基分子量為36 kD左右,各種G蛋白的β亞基氨基酸序列很相似。γ亞基分子量在7～8 kD之間,各種G蛋白的γ亞基也比較相似但個(gè)別的也有差別[10]。當(dāng)處于靜息狀態(tài)時(shí),Gα上結(jié)合著GDP,并與α、β和γ構(gòu)成穩(wěn)定的三聚體形式。當(dāng)與G蛋白偶聯(lián)的胞膜表面受體結(jié)合配體后,活化的受體催化Gα與GDP發(fā)生解離,并于同一位置結(jié)合GTP,引起Gα構(gòu)象發(fā)生變化,并從三聚體中分離出來,而Gβγ二聚體則可以分別對(duì)其相應(yīng)的下游胞內(nèi)效應(yīng)器進(jìn)行調(diào)節(jié)。由于Gα亞基上有GDP/GTP結(jié)合位點(diǎn)、受體結(jié)合位點(diǎn)、GTPase活性位點(diǎn)等功能位點(diǎn),通常被認(rèn)為是G蛋白的功能亞基[11]。研究發(fā)現(xiàn)Gα亞基在植物病原真菌中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能[12]。然而迄今為止, 在玉米彎孢葉斑病菌還未見Gα蛋白報(bào)道,因此本研究擬分離與克隆該基因,對(duì)其氨基酸序列和不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)特征進(jìn)行分析。研究結(jié)果將有助于Gα蛋白的功能解析,為開展由G蛋白介導(dǎo)的信號(hào)通路對(duì)致病調(diào)控機(jī)理研究奠定基礎(chǔ),也可為防治該病害開發(fā)新型藥劑提供有效的靶位點(diǎn),有望獲得一種特異、高效的玉米彎孢葉斑病防治的新途徑。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和試劑

供試菌株玉米彎孢葉斑病菌(C.lunata)從典型的玉米彎孢葉斑病病株上分離獲得,保存于黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)植物病理與應(yīng)用微生物研究所。大腸桿菌DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存。HiFi 聚合酶、T4 連接酶均購自北京經(jīng)科宏達(dá)公司。質(zhì)粒小量制備試劑盒、回收試劑盒、引物合成和序列測(cè)序都是由上海捷瑞生物工程技術(shù)有限公司提供。Trizol和反轉(zhuǎn)錄酶購自Introgen公司。

1.2 基因組DNA和RNA提取

將供試菌株置于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d后,用蒸餾水沖洗,吸水紙吸干收集菌絲, 置于-80 ℃冷凍過夜,通過冷凍干燥除去水分獲得干燥菌絲,用液氮研磨后采用CTAB法提取DNA、Trizol法提取RNA。

1.3 第一鏈cDNA合成和引物設(shè)計(jì)

以總RNA為模板,利用Oligo(dT)18引物逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。根據(jù)從全長cDNA文庫中獲得的一條EST序列擴(kuò)增Clg2基因的引物,將該序列提交NCBI采用BLASTX分析設(shè)計(jì)1對(duì)特異引物CNB1: ATGTGCTTTGGACGGAAACCCTCCA;CNB2: TCATAGTATCAAAGCGTTGAGGTTT用于克隆基因的讀碼框。

1.4 基因克隆

分別以第一鏈cDNA 和基因組為模板,CNB1/ CNB2 為引物對(duì),用HiFi 聚合酶進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,35 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物用1.0%(W/V)的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),分別回收目的片段并連接到pMD19-T 載體上,轉(zhuǎn)化E.coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞,隨機(jī)篩選白色菌落,利用M13引物對(duì)陽性克隆測(cè)序。

1.5 序列分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

利用Pfam27.0 (http:∥pfam.xfam.org/search) 和NCBI CDD (http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/structure/cdd/wrpsb.cgi)在線軟件對(duì)Clg2蛋白的功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)。采用Clustal W2 程序(http:∥www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)對(duì)Clg2氨基酸序列和其他Gα蛋白序列進(jìn)行比對(duì),并輸出到 GENEDOC軟件, 分析其保守結(jié)構(gòu)域。利用 ProtScale Tool 程序(http:∥cn.expasy.org/tools/protscale.html)采用 Kyte 和Doolittle 的方法[13]對(duì)編碼氨基酸序列進(jìn)行了疏水性/親水性分析,利用 http:∥npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html 網(wǎng)站中Combet 等[14]的方法進(jìn)行Clg2全序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。應(yīng)用http:∥web.expasy.org/compute_pi/ 進(jìn)行分子量和等電點(diǎn)等預(yù)測(cè)。使用MEGA5 (http:∥megasoftware.net)軟件的鄰近比較法構(gòu)建Clg2系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.6 熒光定量PCR

分別收集在PDA平板培養(yǎng)基上生長7 d的分生孢子、在鋪有玻璃紙的PDA平板上萌發(fā)3、6 h和9 h分生孢子和在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d的菌絲。采用Trizol方法提取5個(gè)時(shí)期材料的總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)Clg2 cDNA序列采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物Clg2ds 5′-GTTGTGCTATTCCTCGTCG-3′和Clg2da 5′-TGGTGTCTGTGGCATTTGT-3′進(jìn)行擴(kuò)增,以GAPDH為內(nèi)參基因。PCR反應(yīng)體系為:10×buffer 2.5 μL,MgCl22.5 μL,2 mmol/L dNTPs 2.5 μL,Taq酶 0.4 μL,50×SYBR Green 0.3 μL,模板cDNA 1 μL,引物各1 μL,用ddH2O補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃ 1 min;95 ℃ 20 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,40個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。程序結(jié)束后導(dǎo)出生成的循環(huán)數(shù)值。試驗(yàn)重復(fù)3次,以分生孢子時(shí)期表達(dá)量為參照,相對(duì)表達(dá)量通過2-ΔΔCt的方法進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 基因克隆與結(jié)構(gòu)

以第一鏈cDNA為模板,用CNB1/ CNB2 為引物擴(kuò)增出一條1 074 bp片段(圖1),與預(yù)期片段大小一致。經(jīng)過測(cè)序和生物信息學(xué)分析,這段序列即為Clg2基因的開放讀碼框,基因登錄號(hào)為KJ130018。以基因組為模板,采用相同引物進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)獲得一條特異DNA條帶,測(cè)序分析為1 353 bp(圖1)。通過ClustalX 1.8 軟件對(duì)所獲的DNA和cDNA 序列比較分析發(fā)現(xiàn):該基因含有5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子,其內(nèi)含子的大小分別為110、61、56和52 bp,編碼357個(gè)氨基酸。

圖1 Clg2 基因PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Electrophoresis of Clg2 gene by PCR amplification

2.2 序列特征分析

利用Pfam 27.0和NCBI CDD在線軟件對(duì)Clg2結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)與其他來源的G蛋白α亞基蛋白具有GTP/GDP 結(jié)合活性位點(diǎn)、ADP-核糖基化位點(diǎn)、質(zhì)膜受體識(shí)別與結(jié)合位點(diǎn)、胞內(nèi)效應(yīng)器結(jié)合位點(diǎn)等相同的位點(diǎn),表明該蛋白可能屬于G蛋白α亞基蛋白成員。為了進(jìn)一步明確其氨基酸特征序列,從NCBI 數(shù)據(jù)庫下載了一些植物病原真菌的G蛋白α亞基的氨基酸序列,通過DNAMAN對(duì)氨基酸同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)Clg2蛋白與小麥黃斑葉枯病菌(Pyrenophoratritici-repentisPt-1C-BFP)、大斑剛毛座腔菌(Setosphaeriaturcica)、菜豆殼球孢菌(MacrophominaphaseolinaMS6)、斐濟(jì)假尾孢菌(Pseudocercosporafijiensis)和綠色木霉(Trichodermavirens)有較高的同源性, 分別為96%、97%、76%、72%和57%。它們?cè)诒Ｊ亟Y(jié)構(gòu)域都具有相同的氨基酸序列,特別GTP/Mg2+結(jié)合位點(diǎn)具有GAGESGKS 氨基酸序列,在G-region 結(jié)構(gòu)域有TNATDT特征性保守序列,在C-terminus有LIL特征性序列(圖2)。

進(jìn)一步通過scanProsite軟件對(duì)Clg2蛋白分析,發(fā)現(xiàn)Clg2蛋白第65～328位氨基酸為蛋白激酶區(qū),第71～79和94位氨基酸為ATP結(jié)合位點(diǎn),第188位氨基酸為質(zhì)子接受位點(diǎn)。通過對(duì)編碼氨基酸序列進(jìn)行疏水性/親水性分析,結(jié)果表明,Clg2 第226位亮氨酸(Leu)疏水性最強(qiáng),第30位賴氨酸(Lys)親水性最強(qiáng),并且Clg2大部分的氨基酸屬于親水性氨基酸(分值為負(fù)值),因此Clg2屬于親水性蛋白。通過二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn): Clg2 蛋白由52.10%的α-螺旋、10.36%的β-折疊、4.20%的β-轉(zhuǎn)角、33.33%的隨機(jī)卷曲組成。α-螺旋結(jié)構(gòu)是Clg2 蛋白的主要組成部分,而α-螺旋、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角則散布于蛋白序列中。通過對(duì)分子量和等電點(diǎn)預(yù)測(cè)表明,Clg2分子量為40.9 kD,等電點(diǎn)為5.58。

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

利用ClustalX 2.0 軟件將Clg2氨基酸序列與從NCBI GenBank 數(shù)據(jù)獲取的其他植物病原真菌P.tritici-repentisPt-1C-BFP、S.turcica、C.apollinis、P.fijiensis、M.phaseolina、T.virens等的Gα氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析后,利用MEGA5.0 軟件NJ 法構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果如圖3所示, Clg2蛋白與小麥黃斑葉枯病菌(P.tritici-repentisPt-1C-BFP)和大斑剛毛座腔菌(S.turcica)處于同一分支上,表明親緣關(guān)系最近,與斐濟(jì)假尾孢菌(P.fijiensis)等親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖2 Clg2蛋白特殊保守結(jié)構(gòu)域比對(duì)與分析Fig.2 Alignment and analysis of special conserved motifs of Clg2 protein

圖3 玉米彎孢葉斑病菌Clg2蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of Clg2 protein sequences from C.lunata and other sources

2.4 病菌不同發(fā)育階段Clg2 基因表達(dá)水平

為了研究Clg2 基因在病菌不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)水平,利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)Clg2基因在分生孢子、不同萌發(fā)時(shí)期的分生孢子和菌絲中的表達(dá)量。結(jié)果顯示,Clg2基因在5個(gè)時(shí)期均表達(dá),其中在分生孢子中表達(dá)水平最高,其次在萌發(fā)3、6和9 h分生孢子中表達(dá)逐漸降低,在菌絲中表達(dá)最低(圖4)。

3 討論

G蛋白介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑是真核生物中一種非常保守的跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),它可以介導(dǎo)下游的Ca2+信號(hào)途徑、cAMP信號(hào)途徑和MAPK信號(hào)途徑,調(diào)控病菌的生長發(fā)育和致病性[15-16],因此G蛋白在研究真菌的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中處于重要的地位。

圖4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析病菌不同發(fā)育階段下Clg2基因表達(dá)情況Fig.4 Expression of Clg2 gene in different development stages of C.lunata by real-time fluorescence-quantitative RT-PCR

G蛋白是由α、β和γ3個(gè)亞基構(gòu)成,其中Gα被認(rèn)為是G蛋白的功能亞基,在信號(hào)傳導(dǎo)中至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)Gα蛋白在生物進(jìn)化過程中高度保守,利用分子生物學(xué)技術(shù)比較容易獲得其核苷酸序列。目前已經(jīng)從灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)[12, 17]、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)[18-19]、粗糙鏈孢菌(Neurosporacrassa)[20]、異旋孢腔菌(Cochliobolusheterostrophus)[21]、稻瘟菌(Magnaporthegrisea)[22]、玉蜀黍黑粉菌(Ustilagomaydis)[23]和尖鐮孢(Fusariumoxysporum)[24]等病原菌中分離和克隆出Gα蛋白。

本研究從玉米彎孢葉斑病菌獲得的Clg2蛋白,通過Pfam27.0和NCBI CDD在線分析它含有Gα蛋白的所有結(jié)構(gòu)域和保守結(jié)構(gòu)域的一些特征性的序列,因此認(rèn)為屬于Gα蛋白。將Clg2蛋白與其他植物病原真菌Gα蛋白進(jìn)行多序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)它與所有Gα蛋白一樣,在GTP/Mg2+結(jié)合位點(diǎn)都具GAGESGKS 氨基酸序列,在G-region 結(jié)構(gòu)域具有TNATDT特征性保守序列,在C-terminus有LIL特征性序列,因此從保守結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)的特征序列上判斷玉米彎孢葉斑病菌的Clg2蛋白應(yīng)屬于Gα蛋白。但是在對(duì)序列多重比對(duì)時(shí)發(fā)現(xiàn)菜豆殼球孢和斐濟(jì)假尾孢菌在TNATDT和LIL特征性序列區(qū)各相差一個(gè)核苷酸,這表明Clg2蛋白親緣關(guān)系可能與這兩個(gè)病原菌會(huì)更遠(yuǎn)些。隨后在系統(tǒng)進(jìn)化樹中也發(fā)現(xiàn)玉米彎孢葉斑病菌的Clg2蛋白與菜豆殼球孢和斐濟(jì)假尾孢菌不處于同一個(gè)分支上,并離斐濟(jì)假尾孢菌較遠(yuǎn),該結(jié)果與保守基因序列分析結(jié)果一致。

目前在高等真核生物中發(fā)現(xiàn)至少有21種Gα亞基,在多數(shù)絲狀真菌中也有3個(gè)Gα亞基,并且根據(jù)它們保守區(qū)序列可以劃分為5種亞型,各亞型間的Gα亞基在功能方面存在一定的差異。例如在異旋孢腔菌(C.heterostrophus)中一種Gα基因可以調(diào)控病菌有性交配和附著胞的形成[21],magA基因在稻瘟菌(M.grisea)中調(diào)控病菌生長、發(fā)育和致病性[22],在玉米大斑病菌中Stga-1基因(一種Gα亞型)可以調(diào)控玉米大斑病菌的致病性、交配、毒素合成及色素的代謝[25],而Stga-2(另一種Gα亞型)推測(cè)可能與大斑病菌的有性交配有關(guān)[26]。然而Gα在玉米彎孢葉斑病菌中的功能尚無人研究,本文克隆出Clg2基因,并通過熒光定量PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)它在分生孢子形成期表達(dá)量最高,暗示它可能與分生孢子形成有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),玉米彎孢葉斑病菌在自然界中主要以無性繁殖為主,其無性階段產(chǎn)生的分生孢子通過接觸寄主萌發(fā)侵入寄主,在寄主中擴(kuò)展、繁殖、產(chǎn)生大量的分生孢子。分生孢子可借助介質(zhì)形成再侵染和循環(huán)。因此分生孢子成為該病害發(fā)生和流行的主要影響因子。通過Clg2蛋白研究將有可能尋找到與病菌無性產(chǎn)孢的調(diào)控通路,這將為防治該病害開發(fā)新型藥劑提供有效的靶位點(diǎn),通過抑制病菌分生孢子產(chǎn)生和降低致病性,可有效地阻止病害的傳播、發(fā)生與危害,為創(chuàng)建持久、有效防治技術(shù)提供理論基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯：田 喆)

Cloning, sequence characteristics and expression analysis ofClg2 gene in different development stages ofCurvularialunata

Hou Jumei, Wang Yuying, Zuo Yuhu, Zhao Fengzhou, Wang Xingming, Liu Tong

(Institute of Plant Pathology and Applied Microbiology, College of Agronomy,Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China)

G protein signal pathway plays an important role in regulation of morphology, infection structure formation and virulence of the plant pathogen. To study the regulation mechanism of G protein inCurvularialunata, a Gαgene with an ORF of about 1 074 bp was cloned based on an EST from the full-length cDNA library, which was named asClg2. This gene included 5 exons and 4 introns, and encoded 357 amino acids through comparing genomic DNA and cDNA sequences. Sequence alignment and phylogenetic analysis showed that this protein contained the characteristic conserved sequence like that of other Gαproteins, and shared 96% and 97% similarity with Gα protein fromPyrenophoratritici-repentisPt-1C-BFPandSetosphaeriaturcica, respectively. Expression ofClg2 in different development stages ofC.lunatawas analyzed by fluorescence-quantitative RT-PCR. These results showed that the highest expression level was found in conidia, whereas the lowest in hyphae, which suggested thatClg2 might play a vital role in the formation of conidia, which may provide additional information for the study of the function of Clg2.

G protein;Curvularialunata; Gα; fluorescence-quantitative RT-PCR

2014-11-26

2015-02-14

黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)博士啟動(dòng)基金(B2011-03)

S435.131

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.04.013

* 通信作者 E-mail:liutongamy@sina.com