成建初 徐 懿

益陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校附屬醫(yī)院，湖南益陽 413000

自體DC-CIK細(xì)胞免疫療法治療非小細(xì)胞肺癌的效果

成建初 徐 懿

益陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校附屬醫(yī)院，湖南益陽 413000

目的探討DC-CIK細(xì)胞治療非小細(xì)胞肺癌的療效，為非小細(xì)胞肺癌的治療提供科學(xué)依據(jù)。方法 選取2012年1月～2015年2月臨床確診的中晚期非小細(xì)胞肺癌患者60例，運(yùn)用隨機(jī)數(shù)字表法將患者分為DC-CIK組（30例）和對(duì)照組（30例）。DC-CIK組進(jìn)行自體DC-CIK細(xì)胞免疫療法，而對(duì)照組觀察期間行最佳支持治療。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩組患者治療前后外周血CD3+、CD4+、CD8+及NK細(xì)胞百分比以評(píng)估免疫功能改變，并比較兩組之間的差異；隨訪觀察經(jīng)DC-CIK細(xì)胞治療后非小細(xì)胞肺癌患者的臨床癥狀改善情況及不良反應(yīng)。 結(jié)果治療后DC-CIK組CD3+、CD4+、NK細(xì)胞百分比均高于對(duì)照組，CD8+細(xì)胞百分比低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）；與治療前比較，治療后DC-CIK組CD3+、CD4+、NK細(xì)胞百分比上升，CD8+細(xì)胞百分比下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。治療后DC-CIK組的患者乏力、氣短、失眠、疼痛、少食等臨床癥狀緩解率分別為88.24%、85.00%、90.47%、86.67%、88.00%，除4例患者出現(xiàn)一過性低熱、皮疹、口干外，余未見明顯不良反應(yīng)。 結(jié)論自體DC-CIK細(xì)胞免疫治療能在一定程度上提高非小細(xì)胞肺癌患者機(jī)體的免疫功能，且安全有效。

非小細(xì)胞肺癌；樹突狀細(xì)胞；細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞

肺癌是目前世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤[1]，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small-cell lung carcinoma，NSCLC）約占肺癌總數(shù)的80%，但2/3以上的NSCLC患者被確診時(shí)已是晚期，而錯(cuò)過了手術(shù)治療機(jī)會(huì)。因此，化療在NSCLC治療中起著重要的作用，但盡管化療方案不斷改進(jìn)，其有效率和患者生存時(shí)間仍不盡人意，5年生存率僅8%～15%[2]，而且化療毒副作用較大，因此，肺癌療效的提高存在現(xiàn)實(shí)的緊迫性。隨著生物分子技術(shù)和免疫技術(shù)的快速發(fā)展，生物治療作為一種安全、有效的治療手段，在腫瘤綜合治療中已逐步發(fā)展為繼手術(shù)、化療和放療之后的第四大治療方法。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞 （cytokine-induced killers，CIK）是可直接殺傷腫瘤細(xì)胞的一類新型抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞，并且可調(diào)節(jié)和增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，是新一代腫瘤過繼免疫療法中的主要細(xì)胞，具有增殖速度快、殺瘤活性高、殺瘤譜廣及非主要組織相容性恢復(fù)合體限制性殺瘤的優(yōu)點(diǎn)，回輸體內(nèi)后達(dá)到殺滅癌細(xì)胞、抑制腫瘤生長及清除殘留微小病灶的作用。而樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）是一種專職抗原提呈細(xì)胞，成熟的DC可通過Ⅱ型組織相容性抗原等途徑提呈腫瘤抗原，有效抵制腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸機(jī)制。有研究表明DC與CIK具有協(xié)同作用，共同孵育后DC共刺激分子的表達(dá)及抗原遞呈能力均可提高，且CIK的殺傷活性也進(jìn)一步增強(qiáng)，兩者聯(lián)合應(yīng)用可有效提高患者的免疫功能[3-5]。本研究旨在通過采用DC-CIK治療NSCLC，檢測(cè)治療前后患者外周血T細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞指標(biāo)變化，觀察其臨床療效及不良反應(yīng)，為肺癌的治療提供科學(xué)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年1月～2015年2月在益陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校附屬醫(yī)院經(jīng)手術(shù)病理活檢確診的中晚期非小細(xì)胞肺癌患者60例，其中鱗癌48例，腺癌10例，鱗腺癌2例。運(yùn)用隨機(jī)數(shù)字表法將患者分為DC-CIK組（30例）和對(duì)照組（30例），DC-CIK組進(jìn)行自體DC-CIK細(xì)胞免疫療法，而對(duì)照組觀察期間行最佳支持治療。所有患者治療前心、肝、腎功能及血常規(guī)基本正常，采血前14 d、治療期間及治療后14 d均未接受過放、化療。兩組患者性別、年齡、體重、病理類型等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05），具有可比性（表1）。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者和/或家屬均知情同意并簽署知情同意書。

表1 兩組患者一般資料比較

1.2 方法

1.2.1 儀器及主要試劑 流式細(xì)胞儀EPICS XL（美國貝克曼庫爾特公司），F(xiàn)icoll淋巴細(xì)胞分離液（上海朗頓生物技術(shù)有限公司）；CD3McAb（武漢生物制品研究所）；粒巨-集落刺激因子（GM-CSF）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、干擾素-γ（IFN-γ）、白介素（IL）-1a、IL-2、IL-4（上海賽達(dá)生物藥業(yè)有限公司）；RPMI1640（賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司）。

1.2.2 CIK細(xì)胞治療 細(xì)胞的制備及回輸：①單個(gè)核細(xì)胞（PBMNC）的分離：靜脈采血50 mL，用血細(xì)胞分離機(jī)采集患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞。經(jīng)去除血漿、分離、洗滌、計(jì)數(shù)（白細(xì)胞計(jì)數(shù)法記數(shù)4個(gè)大方格細(xì)胞數(shù)）。②DC-CIK誘導(dǎo)培養(yǎng)：在RPMI1640培養(yǎng)基中加入GM-CSF 1000 U/mL、IL-4 500 U/mL、TNF-α 500 U/mL、IFN-γ 1000 U/mL、IL-2 300 U/L、CD3McAb 70 ng/L，IL-1a 10 U/mL混勻。參照美國斯坦福大學(xué)培養(yǎng)法[6]，取單個(gè)核細(xì)胞（PBMNC），加入RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)。貼壁細(xì)胞培養(yǎng)DC，懸浮細(xì)胞培養(yǎng)CIK。離心（600 r/min，10 min），洗滌3次后，分裝至5瓶75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2中培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中觀察細(xì)胞生長情況，適時(shí)換液。③細(xì)胞收集與回輸：當(dāng)每瓶細(xì)胞數(shù)達(dá)到1.6×109～1.8×109以上，且細(xì)菌及真菌培養(yǎng)陰性時(shí)收集細(xì)胞，生理鹽水洗滌3次后混懸至100 mL生理鹽水中，2 h內(nèi)通過靜脈滴注回輸患者體內(nèi)。采用第1日1瓶，第2、3日各2瓶方式，連輸3 d輸完5瓶作為1個(gè)療程。

1.3 評(píng)價(jià)方法

①細(xì)胞表型測(cè)定：分別于治療前、后6周清晨空腹抽取患者外周靜脈血，用流式細(xì)胞儀測(cè)定T淋巴細(xì)胞亞群、NK淋巴細(xì)胞百分比。②療效評(píng)價(jià)：治療結(jié)束后4周進(jìn)行療效評(píng)定，對(duì)比治療前后患者乏力、氣短、失眠、少食、疼痛等臨床癥狀的改善情況，緩解率=（治療前有癥狀例數(shù)-治療后有癥狀例數(shù)）/治療前有癥狀例數(shù)×100%。③安全性評(píng)價(jià)：靜脈回輸過程中及回輸后2 h內(nèi)密切觀察患者是否出現(xiàn)發(fā)熱、皮疹、肌肉酸痛、嘔吐等不良反應(yīng)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血細(xì)胞表達(dá)分析

DC-CIK組患者經(jīng)DC-CIK治療后外周血CD3+、CD4+、NK細(xì)胞百分比含量明顯高于治療前，CD8+明顯低于治療后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而對(duì)照組治療前、后CD3+、CD4+、CD8+、NK細(xì)胞表達(dá)無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；DC-CIK組經(jīng)治療后，CD3+、CD4+、NK均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），CD8+低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 DC-CIK組與對(duì)照組外周血NK、T細(xì)胞表達(dá)測(cè)定（%，）

表2 DC-CIK組與對(duì)照組外周血NK、T細(xì)胞表達(dá)測(cè)定（%，）

注：與對(duì)照組治療后比較，*P＜0.05

組別 例數(shù) CD3+ CD4+ CD8+ NK DC-CIK組治療前治療后t值P值對(duì)照組治療前治療后t值P值30 52.12±2.51 61.69±3.49*14.76＜0.05 32.08±2.42 39.87±3.75*16.92＜0.05 31.26±2.11 26.41±2.25*17.63＜0.05 14.64±1.12 19.95±1.35*25.40＜0.05 30 51.32±2.35 51.55±2.41 1.17 0.252 31.16±2.70 31.37±2.58 1.62 0.116 32.02±1.92 31.74±2.13 1.48 0.149 14.21±1.15 14.37±1.13 1.32 0.196

2.2 臨床療效

經(jīng)DC-CIK治療后的患者臨床癥狀有明顯改善，具體見表3。

表3 DC-CIK治療前、后臨床癥狀改善情況（例）

2.3 安全性

輸注DC-CIK過程中1例患者出現(xiàn)低熱，體溫達(dá)37.6℃，4 h后自行緩解，1例出現(xiàn)頸部少量皮疹，12 h逐漸消退，口干2例，未予特殊治療很快恢復(fù)正常，均不影響治療，余無其他不良反應(yīng)。

3 討論

肺癌目前已成為對(duì)人類健康威脅最大的惡性腫瘤，目前的治療方法有手術(shù)、化療、放療、生物治療。手術(shù)、化療、放療的發(fā)展到了一個(gè)平臺(tái)期，隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，生物療法治療腫瘤成為繼手術(shù)、放療、化療后的研究熱點(diǎn)，免疫治療已成為近年臨床常用的腫瘤新療法。

DC和CIK是腫瘤細(xì)胞免疫治療的兩種重要細(xì)胞。CIK細(xì)胞的出現(xiàn)，打破了LAK、TIL、CD3AK、CTL等細(xì)胞擴(kuò)增慢，細(xì)胞來源難，毒力低等局限。DC細(xì)胞是機(jī)體重要的抗原遞呈細(xì)胞，能誘導(dǎo)初始型T細(xì)胞的抗原呈遞，將信息傳遞給CIK細(xì)胞，在抗腫瘤活性中具有重要作用。本研究將CIK與DC細(xì)胞混合培養(yǎng)，DC-CIK細(xì)胞能相互調(diào)節(jié)而增加細(xì)胞因子釋放和增強(qiáng)細(xì)胞毒性，顯著提高細(xì)胞的增殖能力和殺傷活性，對(duì)腫瘤的識(shí)別和殺傷能力更強(qiáng)[7]，相關(guān)研究顯示，DC細(xì)胞通過受體的方式攝取外來抗原，并能與這些抗原表面的Ⅰ類和Ⅱ類分子結(jié)合，刺激初始型CD8+T細(xì)胞及CD4+T細(xì)胞，除了誘導(dǎo)抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞外，還可通過直接或間接方式影響B(tài)細(xì)胞及NK細(xì)胞的增殖，活化體液免疫應(yīng)答[8]。相較CIK細(xì)胞，DC-CIK聯(lián)合培養(yǎng)的腫瘤抑制率顯著增高（62.9%比41.5%，P＜0.05）[9]。羅虎等[10]的研究結(jié)果提示DCCIK在肺癌患者的治療效果方面可能優(yōu)于單純的CIK治療。

T細(xì)胞亞群檢測(cè)是較好的免疫功能檢測(cè)指標(biāo)[11-13]，從本研究結(jié)果來看，經(jīng)DC-CIK治療后外周血CD3+、CD4+、NK細(xì)胞表達(dá)明顯高于治療前（P＜0.05），CD8+明顯低于治療前（P＜0.05），且與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明DC-CIK治療可以增強(qiáng)患者免疫功能。而且經(jīng)DC-CIK治療后，患者臨床癥狀有明顯改善，乏力、氣短、失眠、少食、疼痛等癥狀緩解率均在85%以上，研究組患者僅出現(xiàn)低熱、皮疹、口干的不良反應(yīng)，并且未予特殊治療很快恢復(fù)正常，不影響治療，說明DC-CIK治療安全有效，與已有研究結(jié)果相似[14-17]。

綜上所述，DC-CIK對(duì)非小細(xì)胞肺癌的治療安全有效，可增加患者的免疫能力，近期效果明顯，值得臨床推廣。

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Effect of autologous DC-CIK cell immune therapy on cure non-small cell lung cancer

CHENG Jianchu XU Yi
Affiliated Hospital of Yiyang Medical College,Hu'nan Province,Yiyang 413000,China

Objective To explore the effect of autologous DC-CIK cell immune therapy on cure non-small cell lung cancer(NSCLC)and provide scientific basis for the treatment of non-small cell lung cancer.Methods From January 2012 to February 2015,in Affiliated Hospital of Yiyang Medical College,60 patients with NSCLC were divided into DC-CIK group (30 cases)and control group (30 cases)by random nuber table.DC-CIK treatment group were treated with autologous DC-CIK cell immune therapy,and the control group were received with optimal supportive care during the same period.Flow cytometry was used to detect the percentage of CD3+,CD4+,CD8+,NK cell in peripheral blood of patients with NSCLC before and after treatment,it was used to assess the changes of immune function,and difference between two groups were compard,clinical symptoms mend matters and adverse reactions of patients with NSCLC in follow-up after DC-CIK cell therapy were observed.Results After treatment,percentages of CD3+,CD4+,NK cells in DC-CIK group were higher than those in control group,the differences were statistically significant(P＜0.05),while the percentage of CD8+was lower than control group,the differences were statistically significant(P＜0.05);Compared with before DC-CIK treatment,percentages of CD3+,CD4+,NK cell in DC-CIK group increased,percentage of CD8+cell reduced,the differences were statistically significant (P＜0.05).After the treatment,remission rates of clinical symptoms in patients in DC-CIK group,such as fatigue,shortness of breath,insomnia,pain,eat less was 88.24%,85.00, 90.47%,86.67%,88.00%respectively.Only 4 patients suffered from fever,rash,or dry mouth,no other side effect was observed.Conclusion In some extent,autologous DC-CIK cell immunotherapy can improve the immune function of patients with NSCLC,which is safe and effective.

Non-small cell lung cancer;Dendritic cells;Cytokine-induced killer cells

R734.2

A

1673-7210(2015)11(b)-0094-04

2015-07-02本文編輯：蘇 暢）

湖南省高?？蒲许?xiàng)目（12C1243）。

成建初（1962.10-），男，碩士，主任醫(yī)師，益陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校附屬醫(yī)院黨總支書記，主要從事胸外科臨床研究工作。