張 滿 崔宏偉 師迎旭 楊 凌

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院胸外科，內(nèi)蒙古呼和浩特 010050；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010050；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科，內(nèi)蒙古呼和浩特 010050

食道鱗狀細胞癌組織及癌旁組織中sonic hedgehog和patched1的表達

張 滿1崔宏偉2師迎旭3楊 凌2

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院胸外科，內(nèi)蒙古呼和浩特 010050；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010050；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科，內(nèi)蒙古呼和浩特 010050

目的在食道鱗狀細胞癌和配對癌旁組織中檢測sonic hedgehog（SHH）和patched1（PTCH1）的表達。 方法選取內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院胸外科2012～2014年經(jīng)手術(shù)切除、病理科確診為食道鱗狀細胞癌的標(biāo)本共30例及其癌旁組織，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法檢測SHH和patched1的表達。結(jié)果在30例食道鱗狀細胞癌組織中10例（33.3%）PTCH1陽性表達，腫瘤組織中未檢測到SHH蛋白的表達，癌旁組織中未見兩種蛋白的表達。PTCH1的表達與患者吸煙、飲酒，食道鱗狀細胞癌的腫瘤分化、分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)（P＞0.05）。 結(jié)論 SHH的表達不是激活hedgehog通路的原因。

食道鱗狀細胞癌；癌旁組織；Sonic hedgehog；Patched1

食道癌是全球范圍內(nèi)癌癥導(dǎo)致死亡中排名第六的疾病。我國食道鱗狀細胞癌的發(fā)病率占全世界總和的70%[1]。食道鱗狀細胞癌在我國因腫瘤死亡的疾病中排名第四[2]。食道癌在組織學(xué)上有兩種主要的類型：鱗狀細胞癌和腺癌這兩種亞型在不同的地區(qū)有不同的發(fā)病率：在世界范圍內(nèi)食道鱗狀細胞癌是主要的食道癌類型，而在美國腺癌的發(fā)病率幾乎和美洲白人的鱗狀細胞癌發(fā)病率一樣高[3]。由于大多數(shù)的食道癌在晚期被發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致其高死亡率。發(fā)現(xiàn)和鑒定靈敏的、特異性高的食道癌分子標(biāo)志物將有助于早期診斷和發(fā)展對晚期食道癌患者的高效的靶向性治療。

作為一個重要的發(fā)育相關(guān)信號通路，hedgehog信號通路對維持組織極性和干細胞群體起到重要作用。hedgehog通路組分也在多種上皮腫瘤中持續(xù)有活性，包括肺癌，胰腺癌，其他胃腸道腫瘤和前列腺癌[4-10]。為了更好地闡明hedgehog信號激活在食道癌發(fā)生和發(fā)展過程的作用，本研究檢測了hedgehog靶基因patched1（PTCH1）和配體蛋白sonic hedgehog（SHH）在食道鱗狀細胞癌中及配對的癌旁組織中的表達，現(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院胸外科2012～2014年經(jīng)手術(shù)切除、病理確診為食道鱗狀細胞癌患者30例的標(biāo)本及其癌旁組織，其中男25例，女5例，年齡42～79歲，平均年齡為（61.4±9.2）歲。所有患者術(shù)前均未行放化療治療，病理類型為鱗狀細胞癌，其中高～中分化20例，低分化10例，分期Ⅱ級21例，Ⅲ級9例。另選擇距腫瘤邊緣2 cm處經(jīng)病理證實為正常組織的食道黏膜作為對照。所有患者均知情同意，且研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 免疫組織化學(xué)

標(biāo)本均經(jīng)4%多聚甲醛固定、石蠟包埋，切厚度為5 μm片，烤片備用。根據(jù)免疫組織化學(xué)試劑盒Universal Quick Kit（美國VECTOR公司）步驟，應(yīng)用S-P免疫組化二步法，使用底物試劑盒VECTOR NOVARED Substrate Kit顯色，脫水，透明和封片后在顯微鏡下進行觀察。SHH抗體、PTCH1抗體購自美國Santa Cruz生物技術(shù)公司。

1.3 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

細胞以出現(xiàn)紅色顆粒為陽性。對陽性細胞計數(shù)是隨機取5個高倍視野進行計數(shù)，并取細胞計數(shù)平均值。免疫組織化學(xué)得分（0、0.5、1、1.5、2、3分）是由染色強度（0分：沒有染色；1分：輕微染色；2分：中度染色；3分：重度染色）乘以染色密度（0分：陽性細胞比例＜10%；0.5分：陽性細胞比例10%～30%；1分：陽性細胞比例＞30%）。染色的結(jié)果分為陰性（免疫組織化學(xué)得分=0）和陽性（免疫組織化學(xué)得分＞0）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0對數(shù)據(jù)進行分析，正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以率表示，采用Fisher確切概率χ2檢驗，配對計數(shù)資料的比較采用Fisher確切概率法McNemar檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

PTCH1在10例 （33.3%）的腫瘤組織有陽性表達，而在正常的食道組織中無PTCH1的表達 （P＜0.01）（圖1，見封四）。在腫瘤組織中組織無SHH的表達。進一步分析顯示PTCH1的表達與吸煙，飲酒不相關(guān)（P＞0.05）（表1），說明吸煙或是飲酒可能不是直接引起hedgehog通路激活的原因。PTCH1表達與食道鱗狀細胞癌的腫瘤分化、分期或是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)（P＞0.05）（表1）。

表1 食道鱗狀細胞癌臨床資料與PTCH1蛋白表達的相關(guān)性（例）

3 討論

hedgehog信號通路的主要傳導(dǎo)機制從果蠅到人類是相對保守的。七次跨膜蛋白smoothened（SMO）是該途徑的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵分子，另一個跨膜蛋白Patched（PTCH）在沒有hedgehog配體的情況下會抑制 SMO的功能。在有 hedgehog配體的情況下，hedgehog和它的受體PTCH結(jié)合，釋放PTCH對SMO的抑制，SMO傳導(dǎo)信號最終到Gli轉(zhuǎn)錄因子。作為轉(zhuǎn)錄因子，Gli通過與靶基因的起始區(qū)特異序列直接結(jié)合來調(diào)控其表達。有報道在幾種食道癌細胞系和食道癌標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)SHH和信號通路靶基因的表達增加[10-12]。Gli的表達與腫瘤浸潤的深度，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后差相關(guān)[11]。研究還表明進行放化療的患者Gli在細胞核表達要比Gli在細胞質(zhì)表達的患者的預(yù)后差[13]。

在我國食道鱗狀細胞癌是食道癌主要的亞型。在食道鱗狀細胞癌中發(fā)現(xiàn)高頻率的myc基因擴增和偶爾的kras基因的突變。且在食道鱗狀細胞癌中cyclinD1的表達上升是很普遍的[14-15]。本研究收集了30例食道鱗狀細胞癌和癌旁組織。結(jié)果顯示，鱗狀細胞癌組織中PTCH1的表達顯著高于癌旁組織（P＜0.01），提示食道鱗狀細胞癌表現(xiàn)出分子水平上的異質(zhì)性。但是30例食道鱗狀細胞癌組織中，只在10例（33.3%）腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)PTCH1的陽性表達，低于Zhang等[16]報道的104例食道鱗狀細胞癌中60%GLi1的陽性表達，分析其原因可能是①實驗中的食道鱗狀細胞癌的取材的地區(qū)不同；②檢測的通路分子不同，本研究中檢測的通路靶基因為PTCH1，Zhang等[16]的研究中鑒定的通路靶基因為GLi1；③本實驗中的標(biāo)本例數(shù)較少。事實上，食道鱗狀細胞癌中已報道的各種分子變化的頻率都不高。所以在分子水平上對食道鱗狀細胞癌進行分類需要更多的研究，包括在更大的范圍內(nèi)研究每一例腫瘤的多個分子的變化。

已有的研究表明hedgehog信號通路的活性與SHH的表達的升高相關(guān)[12]。在本次研究中，沒有發(fā)現(xiàn)SHH的表達。這些結(jié)果說明本次實驗的標(biāo)本例數(shù)較少或是hedgehog通路中其他的變化導(dǎo)致了信號通路的激活。其可能的機制有Indian hedgehog的表達升高，信號通路負(fù)調(diào)節(jié)子的過甲基化[如HIP，Su（Fu）]，信號通路下游分子基因的擴增（如Gli轉(zhuǎn)錄因子）。有研究表明胃癌、食道癌和直腸癌中HIP啟動子的過甲基化導(dǎo)致HIP的表達下降[17]。在肺癌細胞中研究發(fā)現(xiàn)由于過甲基化而導(dǎo)致Su（Fu）基因的沉默[18]。盡管每個組織中hedgehog信號通路激活的原因需要進一步的研究，然而SHH的表達提高并不是激活hedgehog通路的唯一機制?；谶@些發(fā)現(xiàn)，可以預(yù)測對于hedgehog通路激活的食道癌的治療策略要具體情況具體對待。例如，對于過表達SHH而引發(fā)hedgehog通路激活的腫瘤可以用SHH中和抗體或是SMO拮抗劑來治療；對于Gli1或是Su（Fu）分子變化而引發(fā)的腫瘤可以用Gli1的抑制劑來治療；而對于hedgehog通路沒有激活的腫瘤用hedgehog通路抑制劑來治療可能沒有任何作用。

[1]Pennathur A，Gibson MK，Jobe BA，et al.Oesophageal carcinoma[J].Lancet，2013，381（9864）：400-412.

[2]赫捷，陳萬青.2012中國腫瘤登記年報[M].北京：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社，2012.

[3]Brown LM，Devesa SS，Chow WH.Incidence of adenocarcinoma of the esophagus among white Americans by sex，stage，and age[J].J Natl Cancer Inst，2008，100（16）：1184-1187.

[4]Yoon C，Park do J，Schmidt B，et al.CD44 expression denotes a subpopulation of gastric cancer?cells in which Hedgehog signaling promotes chemotherapy resistance[J]. Clin Cancer Res，2014，20（15）：3974-3988.

[5]Peng L，Hu J，Li S，et al.Aberrant methylation of the PTCH1 gene promoter region in aberrant crypt foci[J].Int J Cancer，2013，132（2）：E18-E25.

[6]Jiang WG，Ye L，Ruge F，et al.Expression of Sonic Hedgehog （SHH）in human lung cancer and the impact of SHH-mediated biological function of lung cancer cells and tumor growth[J].Anticancer Res，2015，35（3）：1321-1331.

[7]Memmi EM，Sanarico AG，Giacobbe A，et al.p63 Sustains self-renewal of mammary cancer stem cells through regulation of Sonic Hedgehog signaling[J].Proc Natl Acad Sci USA，2015，112（11）：3499-3504.

[8]Mimeault M，Rachagani S，Muniyan S，et al.Inhibition of hedgehog signaling improves the anti-carcinogenic effects of docetaxel in prostate cancer[J].Oncotarget，2015，6（6）：3887-3903.

[9]Maréchal R，Bachet JB，Calomme A，et al.Sonic hedgehog and Gli1 expression predict outcome in resected pancreatic adenocarcinoma[J].Clin Cancer Res，2015，21（5）：1215-1224.

[10]Ma X，Sheng T，Zhang Y，et al.Hedgehog signaling is activated in subsets of esophageal cancers[J].Int J Cancer，2006，118（1）：139-148.

[11]Mori Y，Okumura T，Tsunoda S，et al.Gli-1 expression is associated with lymph node metastasis and tumor progression in esophageal squamous cell carcinoma[J].Oncology，2006，70（5）：378-389.

[12]Berman DM，Karhadkar SS，Maitra A，et al.Widespread requirement for Hedgehog ligand stimulation in growth of digestive tract tumours[J].Nature，2003，425（6960）：846-851.

[13]Yoshikawa R，Nakano Y，Tao L，et al.Hedgehog signal activation in oesophagealcancerpatientsundergoing neoadjuvant chemoradiotherapy[J].Br J Cancer，2008，98（10）：1670-1674.

[14]Lin J，Beerm DG.Molecular biology of upper gastrointestinal malignancies[J].Semin Oncol，2004，31（4）：476-486.

[15]Okano J，Snyder L，Rustgi AK.Genetic alterations in esophageal cancer[J].Methods Mol Biol，2003，222：131-145.

[16]Zhang L，Zhou Y，Cheng C，et al.Genomic analyses reveal mutational signatures and frequently altered genes in esophagealsquamous cell carcinoma [J].Am J Hum Genet，2015，96（4）：597-611.

[17]Taniguchi H，Yamamoto H，Akutsu N，et al.Transcriptional silencing of hedgehog-interacting protein by CpG hypermethylation and chromatic structure in human gastrointestinal cancer[J].J Pathol，2007，213（2）：131-139.

[18]Chi S，Huang S，Li C，et al.Activation of the hedgehog pathway in a subset of lung cancers [J].Cancer Lett，2006，244（1）：53-60.

Expression of sonic hedgehog and patched1 in esophageal squamous cell carcinomas and adjacent tissues

ZHANG Man1CUI Hongwei2SHI Yingxu3YANG Ling2

1.Department of Thoracic Surgery,Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University,Inner Mongolia Autonomous Region,Huhhot 010050,China;2.Clinical Medical Research Center,Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University,Inner Mongolia Autonomous Region,Huhhot 010050,China;3.Department of Clinical Laboratory, Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University,Inner Mongolia Autonomous Region,Huhhot010050,China

Objective To examine expression of sonic hedgehog(SHH)and patched1(PTCH1)in esophageal squamous cell carcinomas and paired adjacent tissues.Methods From 2012 to 2014,in Department of Thoracic Surgery,the Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University,30 samples from esophageal squamous cell carcinomas and paired adjacent tissues diagnosed by pathologist were selected,expression of SHH and PTCH1 were detected by immunohistochemistry method.Results Among 30 esophageal squamous cell carcinomas tissues,10 cases (33.3%)had patched1 positive expression,no expression of SHH was detected in tumor tissues,no expression of PTCH1 and SHH was detected in adjacent tissues.Statistical analysis revealed that PTCH1 expression was not associated with smoking, drinking,differentiation,stage and lymph node metastasis of cancer(P＞0.05).Conclusion Expression of sonic hedgehog is not the reason for activation of the hedgehog pathway.

Esophageal squamous cell carcinoma;Adjacent normal tissues;Sonic hedgehog;Patched1

R735.1

A

1673-7210(2015)11(b)-0091-03

2015-07-02本文編輯：蘇 暢）

內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金項目（2013MS1129）；內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院一般科研項目（NYFYYB2014012）。

張滿（1984-），男，碩士；研究方向：胸部腫瘤臨床及基礎(chǔ)研究。

楊凌 （1981-），女，博士；研究方向：腫瘤中hedgehog通路研究。