金芳玲 蔡忠芳 葛陽麗 張 曉夏 冰
1.浙江省東陽市人民醫(yī)院放療科,浙江東陽 322100;2.浙江省杭州市第一人民醫(yī)院放療科,浙江杭州 310000
miRNA-34a靶向抑制Rb/E2F1通路激活增強結(jié)腸癌放療敏感性
金芳玲1蔡忠芳1葛陽麗1張 曉1夏 冰2
1.浙江省東陽市人民醫(yī)院放療科,浙江東陽 322100;2.浙江省杭州市第一人民醫(yī)院放療科,浙江杭州 310000
目的探討MiRNA-34a在結(jié)腸癌細胞化療敏感性中的作用及機制。方法構(gòu)建miRNA-34a過表達的慢病毒載體,轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細胞株HT29細胞,經(jīng)放療處理后,采用氯丁膠新型交聯(lián)劑(MTT)、平板克隆和Western blot檢測miRNA-34a過表達后對HT29細胞放療敏感性和Rb/E2F1通路的影響。 結(jié)果慢病毒載體轉(zhuǎn)染HT29細胞后miRNA-34a表達出現(xiàn)顯著上調(diào)[(5.91±1.47)倍],miRNA-34a組HT29細胞對放療的敏感性顯著增強,細胞存活率和克隆形成能力出現(xiàn)顯著下降,Rb蛋白磷酸化和E2F1蛋白表達水平也受到miRNA-34a過表達的抑制。結(jié)論miRNA-34a靶向抑制Rb/E2F1通路激活增強結(jié)腸癌放療敏感性,證實miRNA-34a-Rb/E2F1通路是結(jié)腸癌臨床放射治療相關(guān)的有效分子靶點。
MiRNA-34a;Rb/E2F1通路;放射治療;結(jié)腸癌
結(jié)腸癌(colon cancer)是我國最常見的消化系統(tǒng)腫瘤之一。據(jù)統(tǒng)計,結(jié)腸癌發(fā)病率位居我國惡性腫瘤第3位,其致死率居第5位,表現(xiàn)出易轉(zhuǎn)移和高復(fù)發(fā)的特點[1]。輔助治療常用于提高手術(shù)治療的成功率和生存率(主要是化學(xué)藥物和放射治療)。其中放療雖然能夠在短時間內(nèi)導(dǎo)致腫瘤體積縮小甚至消退,但經(jīng)過緩解期后,腫瘤對放療的敏感性下降,從而出現(xiàn)復(fù)發(fā)甚至轉(zhuǎn)移,被稱為放療抵抗。探索有效的分子靶點以增強結(jié)腸癌的放療敏感性已經(jīng)成為當前的研究熱點。
微小RNA(micro RNA,miRNA)是一種廣泛存在于真核生物細胞內(nèi),長約22個核苷酸,能與特定靶基因信使RNA(messenger RNA,mRNA)的3'UTR配對結(jié)合來調(diào)控靶基因表達的非編碼RNA[2]。已經(jīng)可以明確放療誘導(dǎo)miRNA的差異表達,如非小細胞肺癌細胞在受到放療誘導(dǎo)后,miRNA-34家族能被抑癌基因p53直接轉(zhuǎn)錄生成而誘導(dǎo)細胞凋亡[3]。此外,有研究指出E2F相關(guān)通路是miRNA-34誘導(dǎo)癌細胞凋亡的靶標蛋白[4]。但對于miRNA-34a在結(jié)腸癌放療敏感性中的作用及其機制尚未見研究報道。本研究通過慢病毒過表達載體的轉(zhuǎn)染來上調(diào)結(jié)腸癌細胞內(nèi)miR-34a的表達,采用氯丁膠新型交聯(lián)劑(MTT)和細胞克隆形成探究miRNA-34a表達水平改變后對結(jié)腸癌細胞放療敏感性的作用及其對Rb/E2F1通路的調(diào)控作用,為結(jié)腸癌的臨床治療提供實驗依據(jù)。
1.1 細胞和試劑
人結(jié)直腸癌細胞株HT29購自中國科學(xué)院上海細胞庫;細胞培養(yǎng)試劑(DMEM培養(yǎng)基,胎牛血清、青霉素和鏈霉素、胰蛋白酶)購自美國Gibco公司;TRI-zol試劑和Realtime PCR試劑盒購自美國Invitrogen公司;hsa-miRNA-34a過表達慢病毒載體和轉(zhuǎn)染增強劑polybrene由上海吉瑪基因公司設(shè)計合成 (載體為pRI-CMVGFP-miRNA vector);Western blot相關(guān)試劑(上樣緩沖液,蛋白marker,電泳液和轉(zhuǎn)膜液,顯色液等)購自碧云天公司;第一抗體[兔抗人anti-p-Rb、anti-E2F1和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)]和辣根過氧化物酶(HRP)標記的第二抗體(羊抗兔)購自Cell signalling Technology公司,其他常用試劑購自Sigma公司。
1.2 實驗方法
1.2.1 細胞培養(yǎng) 人結(jié)腸癌細胞株HT29培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1000 U/mL青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基,放置于37℃、5%CO2的恒溫細胞培養(yǎng)箱內(nèi),每2~3天更換培養(yǎng)液,待細胞融合>80%后使用胰蛋白酶消化細胞,種板培養(yǎng)或傳代。
1.2.2 miR-34a轉(zhuǎn)染 HT29細胞培養(yǎng)到密度>80%后,使用胰蛋白酶消化重懸,加入DMEM完全培養(yǎng)基稀釋到1×105個/mL,取2 mL細胞種到6孔板中,置于37℃、5%CO2的恒溫細胞培養(yǎng)箱內(nèi)。待細胞融合>30%后更換無血清培養(yǎng)基,進行慢病毒轉(zhuǎn)染。使用嘌呤霉素對最佳病毒滴度進行篩選,按照1 μg慢病毒載體(pRI-CMVGFP-miRNA 34a vector)/500 μL DMEM的配比混合均勻,加入polybrene(5 μg/mL)增強病毒轉(zhuǎn)染效率,室溫孵育30 min。將混合物加入6孔板中,混勻后繼續(xù)培養(yǎng),轉(zhuǎn)染12 h后更換DMEM完全培養(yǎng)液,置于37℃、5%CO2的恒溫細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)用于后續(xù)實驗。
1.2.3 miR-34a表達檢測 培養(yǎng)HT29細胞使用QIAGEN公司miRNA提取試劑盒,提取總miRMA后,使用TaqMan MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將上述提取的miRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,反應(yīng)條件:16℃30 min,42℃30 min,85℃5 min;以TaqMan MicroRNA檢測試劑盒對上述制備得到的cDNA進行Real time PCR反應(yīng),反應(yīng)條件:95℃10 min,95℃15 s及60℃1 min,共40個循環(huán)。PCR完成后,在羅氏LC480軟件上分析基因的擴增情況,得到相應(yīng)的Ct值。以U6為內(nèi)參來校正PCR模板的拷貝數(shù),每組設(shè)3個復(fù)孔,基因相對表達量采用2-ΔΔCt方法計算,空白對照組為未經(jīng)任何處理的HT29細胞,陰性對照組為空白病毒載體轉(zhuǎn)染的HT29細胞,miRNA-34a過表達組為慢病毒載體(pRI-CMVGFP-miRNA 34a vector)轉(zhuǎn)染的HT29細胞。
1.2.4 Western blot miRNA-34a過表達組使用慢病毒載體(pRI-CMVGFP-miRNA 34a vector)轉(zhuǎn)染24 h、陰性對照組使用空白慢病毒載體轉(zhuǎn)染24 h、空白對照組的HT29細胞不做處理同時培養(yǎng)24 h后,去除培養(yǎng)基,加入預(yù)冷的PBS洗滌細胞,加入10 uL的RIPA裂解液,10 min后提取總蛋白,BCA法定量蛋白濃度,各組取50 μg蛋白進行10%SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜到PVDF膜,用5%milk-TBS將膜封閉1 h,加入相應(yīng)的第一抗體,靜置于4℃過夜。次日使用TBST漂洗,HRP標記的二抗室溫孵育1 h,顯色拍照。
1.2.5 MTT檢測細胞的增殖 細胞分組及處理同“1.2.4”項下,轉(zhuǎn)染后的HT29細胞密度>80%后使用胰蛋白酶消化細胞,制成單細胞懸液,按1×106個/孔的密度接種于6孔板中,置于培養(yǎng)箱中孵育12 h后,釆用Varian 2300EX直線加速器6MV-X線垂直輻射結(jié)腸癌細胞(上蓋1 cm有機玻璃填充物),所用劑量率為3Gy/min,源皮距SSD100cm,照射野10cm×10cm。照射結(jié)束后更換培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)細胞。不同時間點內(nèi)按照10 μL/孔的濃度加入MTT試劑,37℃孵育1 h后,酶標儀讀取每孔的吸光度值。
1.2.6 細胞輻射處理后檢測對克隆形成的影響 細胞分組及處理同 “1.2.4”項下,1×106個/孔的密度接種HT29細胞于6孔板中,分別給予0、2、4、6、8 Gy劑量的X線輻射,輻射結(jié)束后更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細胞。當培養(yǎng)板孔中出現(xiàn)明顯的結(jié)腸癌細胞克隆時,去除培養(yǎng)液,預(yù)冷的PBS洗滌細胞,甲醇固定30 min,結(jié)晶紫染色30 min,烘箱烘干后,光學(xué)顯微鏡計算視野內(nèi)克隆數(shù) (>50個細胞),計算公式如下:克隆形成率(planting efficiency,PE)=克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%;存活分數(shù)(surviving fraction,SF)受照射細胞的克隆形成率/對照細胞的克隆形成率×100%。運用GraphPad Prism 5.0軟件進行L-Q模型和多IE單擊模型曲線擬合,繪制劑量存活曲線,計算增敏比。
1.3 統(tǒng)計學(xué)方法
采用Graphpad Prism 5.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)處理分析,計量資料以均數(shù)±標準差()表示,組間比較采用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 miRNA-34a轉(zhuǎn)染增強HT29細胞內(nèi)miRNA-34a表達
在miRNA-34a的慢病毒表達載體轉(zhuǎn)染HT29細胞24 h后,圖1的GFP熒光檢測結(jié)果可見,miRNA-34a轉(zhuǎn)染和陰性對照組的HT29細胞中可見GFP綠色熒光蛋白,表明慢病毒轉(zhuǎn)染成功。提取HT29細胞總miRNA進行Real time PCR驗證,陰性對照組(NS)的miRNA-34a表達水平為(1.02±0.07)倍,轉(zhuǎn)染后的HT29細胞的miRNA-34a表達水平增加到 (5.91± 1.47)倍;陰性對照組與空白對照組的miRNA-34a表達比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。因此可以明確,miRNA-34a表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HT29細胞后能夠顯著上調(diào)miRNA-34a的表達。見表1。
圖1 空白對照組、陰性對照組和miRNA-34a過表達組的HT29細胞的熒光照片
表1 Realtime PCR檢測空白對照組、陰性對照組和miRNA-34a過表達組的HT29細胞的miRNA-34a表達水平()
表1 Realtime PCR檢測空白對照組、陰性對照組和miRNA-34a過表達組的HT29細胞的miRNA-34a表達水平()
注:與空白對照組比較,*P<0.01
組別 miR-34a mRNA表達水平空白對照組陰性對照組miRNA-34a過表達組1.00 1.02±0.07 5.91±1.47*
2.2 miRNA-34a過表達增強結(jié)腸癌細胞的放療敏感性
采用MTT法對miRNA-34a過表達后HT29細胞對體外放療敏感性的改變進行檢測,結(jié)果顯示,使用3 Gy/min劑量率垂直輻射結(jié)腸癌細胞后,miRNA-34a過表達組的生長曲線從培養(yǎng)的第3天開始出現(xiàn)顯著差異,miRNA-34a過表達后的HT29細胞生存分數(shù)要顯著低于空白對照組,其中在第6天空白對照組的細胞存活分數(shù)為 (43.76±3.23)%,miRNA-34a過表達組細胞的生存率為(13.2±3.19)%(P<0.01);陰性對照組的細胞存活分數(shù)為 (41.57±3.10)%,miRNA-34a過表達組細胞的生存率為(13.2±3.19)%(P<0.01)。表明miRNA-34a過表達組的細胞對射線的敏感性要明顯高于對照組細胞。見圖2。
圖2 miRNA-34a過表達前后HT29細胞對放療敏感性的變化
2.3 miRNA-34a過表達抑制放療處理結(jié)腸癌細胞的克隆形成
結(jié)腸癌細胞的克隆形成檢測結(jié)果顯示經(jīng)過放療處理后,miRNA-34a過表達HT29細胞的單個細胞增殖能力明顯強于對照細胞,不同劑量組的克隆數(shù)統(tǒng)計結(jié)果顯示,miRNA-34a過表達顯著抑制放療處理結(jié)腸癌細胞的克隆形成。采用GraphPad Prism 5.0軟件進行曲線擬合,計算放射增敏比=1.533。見表2。
表2 兩組不同劑量X線照射后克隆形成率和存活分數(shù)比較()
表2 兩組不同劑量X線照射后克隆形成率和存活分數(shù)比較()
注:與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01
0 Gy克隆形成率(%)組別 存活分數(shù)(%)2 Gy克隆形成率(%)存活分數(shù)(%)4 Gy克隆形成率(%)存活分數(shù)(%)6 Gy克隆形成率(%)存活分數(shù)(%)8 Gy克隆形成率(%)存活分數(shù)(%)空白對照組miRNA-34a組72.2±5.3 66.4±1.3 100.0 100.0 45.3±8.7 32.3±1.2 56.3 45.6 22.7±0.9 10.4±0.1*21.2 12.1 12.9±0.3 1.5±0.5**10.9 8.7*5.6±0.1 0.1±0.0**2.3 0.1**
2.4 miRNA-34a過表達抑制Rb磷酸化水平和E2F1蛋白表達
最近的研究顯示Rb/E2F1蛋白是miRNA-34a調(diào)控的關(guān)鍵靶分子。Western blot結(jié)果顯示,與空白對照組及陰性對照組比較,miRNA-34a過表達組的p-Rb和E2F1蛋白條帶灰度明顯降低,但空白對照組和陰性對照組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖3),使用Image Pro Plus6.0的條帶分析結(jié)果如圖4所示,以GAPDH表達量作為蛋白定量分析內(nèi)參,miRNA-34a過表達組的p-Rb和E2F1蛋白表達水平明顯降低(與空白對照組比較,P<0.01;與陰性對照組比較,P<0.01),表明miRNA-34a可能通過抑制Rb磷酸化水平和E2F1蛋白表達而增強HT29細胞的放療敏感性。
圖3 Western blot檢測空白對照組、陰性對照組和miR-34a過表達組的HT29細胞中p-Rb和E2F1蛋白表達(GAPDH用作內(nèi)參)
圖4 Image Pro Plus 6.0分析Western blot檢測條帶的光密度(以GAPDH表達量作為蛋白定量分析內(nèi)參)
隨著放療技術(shù)的發(fā)展進步,其已成為結(jié)腸癌輔助治療的有效手段之一。但是在臨床使用中由于癌細胞對放療敏感性的降低,導(dǎo)致療效降低和結(jié)腸癌的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。為增強癌細胞的放療敏感性,一方面通過開發(fā)新型的放療技術(shù)或治療方案以達到最佳的輔助治療效果,另一方面,通過分子生物技術(shù)揭示癌細胞的放療抵抗機制以用于臨床。隨著蛋白組學(xué)和高通量技術(shù)的發(fā)展進步,后者的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用成為可能[5-6]。
研究發(fā)現(xiàn),miRNA作為人體內(nèi)最大種類的表達調(diào)控因子,在人體細胞內(nèi)具有多種生物功能,包括參與調(diào)控細胞的增殖、凋亡和遷移等,尤其是miRNA在癌細胞惡性生物學(xué)行為中的作用更是成為了當前的研究熱點[7]。已有研究者證實在結(jié)腸癌患者體內(nèi)miRNA表達譜已經(jīng)出現(xiàn)顯著差異,并且對其中差異化表達明顯的miRNA進行初步篩選,證實miRNA表達與結(jié)腸癌的治療和預(yù)后存在顯著相關(guān)[8]。而且已經(jīng)有多項研究明確,癌細胞在受到放射治療后,會導(dǎo)致miRNA表達變化[9]。例如Wang等[10]的研究發(fā)現(xiàn),肺癌細胞受到放射刺激后,多種miRNA表達異常,其中miRNA-21過表達能夠促進肺鱗癌細胞的凋亡。miRNA-34a是一種最近鑒定的與多種癌癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的miRNA。例如,Yan等[11]發(fā)現(xiàn)miRNA-34a能夠通過下調(diào)c-Met表達而抑制黑色素瘤細胞的增殖,此外也有多項研究證實miRNA-34a與癌細胞的耐藥性相關(guān)[12-13]。為進一步闡明miRNA-34a在結(jié)腸癌放療中的作用,本研究構(gòu)建miRNA-34a過表達的慢病毒載體,并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌HT29細胞,通過Real time PCR證實轉(zhuǎn)染成功導(dǎo)致miRNA-34a的表達顯著上調(diào),并通過功能學(xué)研究揭示了miRNA-34a過表達后結(jié)腸癌HT29細胞對X線照射的敏感性增強,表現(xiàn)在細胞增殖能力和存活分數(shù)下降上,克隆形成能力受到miRNA-34a抑制。此外,還發(fā)現(xiàn)miRNA-34a增強結(jié)腸癌細胞的放療敏感性可能與Rb/E2F1通路相關(guān),表現(xiàn)在miRNA-34a過表達后HT29細胞內(nèi)Rb磷酸化和E2F1表達水平均出現(xiàn)顯著上調(diào),這與相關(guān)研究[13-14]的結(jié)果一致。
然而,在癌細胞的增殖分化和侵襲轉(zhuǎn)移中,往往存在多種基因網(wǎng)絡(luò)或信號通路的共同參與,例如在miRNA-34a相關(guān)的調(diào)控通路中也不僅是Rb/E2F1通路,還有研究報道TREM2、SIRT2等多種蛋白的表達也受到miRNA-34a的調(diào)控[15-16],因此還需要對結(jié)腸癌中的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進行深入研究,具有重要的理論和實踐價值。
綜上所述,本研究對miRNA-34a在結(jié)腸癌放療敏感性中的作用進行了初步闡明,并對其調(diào)控機制進行了檢測,推動結(jié)腸癌放療抵抗“miRNA-靶基因”作用模式的發(fā)展,為放療技術(shù)和方案的發(fā)展提供有價值的實驗證據(jù)。
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miRNA-34a increases the radiotherapy sensitivity of colon cancer by targeting Rb/E2F1 pathway
JIN Fangling1CAI Zhongfang1GE Yangli1ZHANG Xiao1XIA Bing2
1.Department of Radiotherapy,the People's Hospital in Dongyang City of Zhejiang Province,Dongyang 322100,China; 2.Department of Radiotherapy,the Frist People's Hospital in Hangzhou City of Zhejiang Province,Hangzhou 310000, China
Objective To investigate effect and mechanism of miRNA-34a in the chemosensitivity of colon cancer cells.Methods Lentiviral vector for miRNA-34a overexpression was constructed and transfected into human colon cancer cell line HT29 cells.After radiation treatment,the radiosensitivity of HT29 cell was determined by MTT and colony.Rb/E2F1 pathway was measured by Western blot.Results miRNA-34a expression in lentiviral vector-transfected HT29 cells increased to (5.91±1.47)folds.The sensitivity of miRNA-34a overexpression of HT29 cells to radiotherapy was enhanced by miRNA-34a overexpression.The cell viability and clonogenic capacity were inhibited by miRNA-34a.Rb protein phosphorylation and E2F1 protein expression were also inhibited by overexpression of miRNA-34a.Conclusion miRNA-34a enhances radiation sensitivity of colon cancer by the inhibition of Rb/E2F1 pathway, confirming that miRNA-34a-Rb/E2F1 pathway is associated with colorectal cancer radiation therapy as an effective molecular target.
miRNA-34a;Rb/E2F1 pathway;Radiation therapy;Colon cancer
R735.3+3
A
1673-7210(2015)11(b)-0013-05
2015-04-19本文編輯:趙魯楓)
浙江省自然科學(xué)基金項目(Y13H160069)。