楊曉慶 蘇 健

北京市醫(yī)療器械檢驗(yàn)所，北京 100700

miR-155在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中的調(diào)控作用

楊曉慶 蘇 健▲

北京市醫(yī)療器械檢驗(yàn)所，北京 100700

目的探討miR-155對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）向成骨分化能力的影響。 方法從C57/BL6J小鼠骨髓中分離BMSCs，BMSCs按照2×105個(gè)/mL的濃度接種，過(guò)夜貼壁后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，通過(guò)miR-155模擬劑及miR-155抑制劑改變miR-155在BMSCs中的表達(dá)，同時(shí)設(shè)立miRNA模擬劑的同型對(duì)照和miRNA抑制劑的同型對(duì)照。采用qRT-PCR檢測(cè)不同處理后BMSCs中骨標(biāo)志基因RUNX2、骨鈣蛋白（OCN）、骨橋蛋白和Ⅰ型膠原（Col-Ⅰ）的表達(dá)；通過(guò)堿性磷酸酶（ALP）染色和ALP活性分析觀察ALP的表達(dá)和酶活性；通過(guò)茜素紅染色檢測(cè)細(xì)胞外鈣鹽結(jié)節(jié)的形成。 結(jié)果地塞米松使miR-155在BMSCs中的表達(dá)上調(diào)（13.56±0.45）倍（P＜0.01），miR-155在BMSCs向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)第4天時(shí)表達(dá)顯著下調(diào) （P＜0.01）。轉(zhuǎn)染miR-155模擬劑的BMSCs成骨誘導(dǎo)第12天時(shí)RUNX2、OCN和Col-Ⅰ的表達(dá)明顯低于其同型對(duì)照（P＜0.01），ALP活性明顯低于其同型對(duì)照（P＜0.01），ALP染色和茜素紅染色的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)也明顯少于其同型對(duì)照。轉(zhuǎn)染miR-155抑制劑的BMSCs成骨誘導(dǎo)第12天時(shí)RUNX2、OCN和Col-Ⅰ的表達(dá)明顯高于其同型對(duì)照（P＜0.05或P＜0.01），ALP活性明顯高于其同型對(duì)照，ALP染色和茜素紅染色的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)也明顯多于其同型對(duì)照。結(jié)論轉(zhuǎn)染miR-155模擬劑能夠明顯抑制BMSCs向成骨細(xì)胞分化，轉(zhuǎn)染miR-155抑制劑則能夠明顯促進(jìn)BMSCs分化為成骨細(xì)胞。miR-155作為成骨分化的負(fù)性調(diào)節(jié)分子可能成為骨質(zhì)疏松癥等成骨分化異常相關(guān)疾病的有效干預(yù)靶點(diǎn)。

地塞米松；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；成骨分化；miR-155；骨質(zhì)疏松癥

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)破壞、骨脆性增加和易骨折為特征的全身代謝性骨病。糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥是繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的主要類型[1]，其預(yù)防和治療是骨科領(lǐng)域亟待解決的嚴(yán)重問(wèn)題。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）成骨分化能力下降與骨質(zhì)疏松癥發(fā)生密切相關(guān)[2-3]。成骨分化是一個(gè)高度有序的調(diào)控過(guò)程，起始于成骨關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子RUNX2的活化，導(dǎo)致堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）的表達(dá)和活性增高，最終引起以細(xì)胞外基質(zhì)中出現(xiàn)鈣沉積為特征的終末成骨細(xì)胞形態(tài)的改變。與礦化相關(guān)的基因包括骨鈣蛋白（osteocalcin，OCN）、骨橋蛋白和Ⅰ型膠原（Col-Ⅰ）等。microRNA（miRNA）是一類長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的非編碼RNA分子，通過(guò)與靶基因mRNA的堿基配對(duì)結(jié)合導(dǎo)致其降解或翻譯阻遏。miRNAs在骨質(zhì)疏松癥中表達(dá)異常[4-6]。地塞米松能夠損害BMSCs的成骨分化[7]，高濃度的地塞米松可改變BMSCs中miRNA的表達(dá)[8]，目前，miRNAs在地塞米松抑制成骨分化中的作用還不清楚。本研究以小鼠BMSCs向成骨細(xì)胞分化為模型，研究地塞米松誘導(dǎo)高表達(dá)的miR-155對(duì)BMSCs成骨分化能力的影響，為臨床上糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防和治療提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

DMEM培養(yǎng)液、小鼠BMSCs培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素和鏈霉素購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；β-甘油磷酸鈉、地塞米松、Vit C和茜素紅均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；ALP染色試劑盒購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所；ALP活性測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京建成生物制品有限公司；脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑及轉(zhuǎn)染用培養(yǎng)液opti-MEM購(gòu)于Invitrogen公司；miR-155模擬劑及抑制劑由上海吉瑪生物制藥有限公司合成。

1.2 小鼠骨髓MSCs的分離培養(yǎng)

C57/BL6J小鼠，清潔級(jí)，8周齡，雌雄各半，共20只，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（京）2009-0004。C57/BL6J小鼠斷頸處死，在無(wú)菌條件下分離雙側(cè)股骨，剪去干髓端，剔除附著的肌肉和結(jié)締組織，然后用1 mL注射器吸取小鼠BMSCs培養(yǎng)液5 mL沖洗股骨髓腔，收細(xì)胞懸液，吹打均勻后調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/mL接種于T25培養(yǎng)瓶中，于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，24 h后去除未貼壁的懸浮物，換新鮮小鼠BMSCs培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度約達(dá)90%時(shí)，以0.25%的胰蛋白酶消化，按照1∶3的比例傳代培養(yǎng)。

1.3 BMSCs的成骨誘導(dǎo)分化及鑒定

成骨誘導(dǎo)分化體系參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行。成骨分化的鑒定：ALP染色及ALP活性實(shí)驗(yàn)鑒定早期成骨分化，茜素紅染色鑒定晚期成骨分化形成的細(xì)胞外鈣鹽沉積物；qRT-PCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因RUNX2、OCN和Col-Ⅰ的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.1 成骨誘導(dǎo)體系 取第3代BMSCs過(guò)夜貼壁后，待細(xì)胞長(zhǎng)到70%～80%的匯合度時(shí)，加入成骨誘導(dǎo)液（DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液中含有50 μg/mL的Vit C、10 mmol/L的β-甘油磷酸鈉、1 nmol/L的地塞米松）繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2 d換新鮮誘導(dǎo)液，同時(shí)設(shè)立未加地塞米松處理的對(duì)照BMSCs。

1.3.2 ALP染色 按照ALP染色試劑盒說(shuō)明書操作。BMSCs成骨誘導(dǎo)12 d時(shí)終止誘導(dǎo)，用平衡鹽溶液洗細(xì)胞2次，用4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞10 min，棄固定液，每孔加入數(shù)滴新鮮配制的ALP染色液，37℃染色2 h，流水沖洗，光鏡下觀察并拍照。拍照時(shí)放大倍數(shù)為200倍。

1.3.3 ALP活性分析 根據(jù)ALP活性測(cè)定試劑盒，通過(guò)ELISA方法，用堿性磷酸酶黃色（pNPP）液體底物系統(tǒng)對(duì)ALP活性進(jìn)行測(cè)定。以細(xì)胞裂解物的總蛋白量對(duì)ALP活性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。紫外分光光度計(jì)測(cè)定405 nm波長(zhǎng)處的吸光度值，并按照公式計(jì)算ALP活性值，ALP活性（U/gprot）=[（測(cè)定管吸光度值/標(biāo)準(zhǔn)管吸光度值）×標(biāo)準(zhǔn)管對(duì)硝基酚量]/總蛋白克數(shù)。

1.3.4 茜素紅染色 按照試劑說(shuō)明書進(jìn)行操作。BMSCs成骨誘導(dǎo)分化16 d終止誘導(dǎo)，用平衡鹽溶液洗細(xì)胞2次，用75%乙醇溶液固定10 min，棄固定液，每孔加入500 μL的0.1%茜素紅-Tris-HCL染色液（pH=8.2）染色30 min，蒸餾水沖洗后，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。拍照時(shí)放大倍數(shù)為200倍。

1.4 miR-155模擬劑和抑制劑的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

BMSCs按照2×105個(gè)/mL的濃度接種，過(guò)夜貼壁后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別轉(zhuǎn)染miR-155模擬劑及miR-155抑制劑，同時(shí)設(shè)立miRNA模擬劑的同型對(duì)照和miRNA抑制劑的同型對(duì)照。具體操作按照脂質(zhì)體2000試劑盒（Invitrogen）說(shuō)明書進(jìn)行，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞放37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h后，吸除轉(zhuǎn)染液，換新鮮培養(yǎng)液或成骨誘導(dǎo)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5 總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR檢測(cè)成骨基因的表達(dá)

收集細(xì)胞，用Trizol（Invitrogen）提取總RNA，按照miScript Reverse Transcription Kit（QIAGEN）操作說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。按照SYBR GreenⅠ試劑盒（TaKaRa）說(shuō)明書進(jìn)行qRT-PCR。在Stepone Plus熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）上進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性10 s，60℃退火40 s，循環(huán)35次。mRNA檢測(cè)以GAPDH為內(nèi)參照。miRNA檢測(cè)以U6為內(nèi)參照。U6的逆轉(zhuǎn)錄引物為5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCAC TGGATACGACAAAATA-3'，PCR引物上游為5'-TCCGATCGTGAAGCGTTC-3'，下游為5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。目的基因和miRNA的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs向成骨誘導(dǎo)分化及鑒定

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BMSCs表型為CD29、CD44和CD106陽(yáng)性，CD31和CD34陰性。成骨誘導(dǎo)第12天，ALP染色顯示成骨誘導(dǎo)的細(xì)胞被染成藍(lán)色（圖1A，封四）。成骨誘導(dǎo)第16天，茜素紅染色顯示成骨誘導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)中形成許多橘色、橘紅色鈣鹽結(jié)節(jié) （圖1B，封四）。qRT-PCR分析顯示，以誘導(dǎo)0天的表達(dá)值為對(duì)照，成骨分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子RUNX2在誘導(dǎo)第4天表達(dá)上調(diào)達(dá)（2.11±0.22）倍（P＜0.05），在誘導(dǎo)第8天表達(dá)最高，達(dá)（11.70±0.12）倍（P＜0.01）；成骨分化晚期標(biāo)志基因OCN和Col-Ⅰ于誘導(dǎo)第8天表達(dá)上調(diào)分別達(dá)（1.83±0.06）倍和（3.46±0.41）倍（P＜0.01），到第 16天持續(xù)顯著上調(diào)分別達(dá) （9.49±0.91）倍和（15.06±1.46）倍（P＜0.01）（圖2）。

2.2 miR-155模擬劑對(duì)BMSCs成骨分化的影響

2.2.1 地塞米松對(duì)miR-155表達(dá)的影響及miR-155在成骨分化中的表達(dá) 高濃度地塞米松培養(yǎng)BMSCs 2 d后，miRNA特異性qRT-PCR分析顯示，與未經(jīng)地塞米松處理的對(duì)照BMSCs比較，高濃度地塞米松培養(yǎng)使BMSCs中miR-155表達(dá)上升（13.56±0.45）倍（P＜0.01）（圖3A），miR-155在BMSCs向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)的第4天表達(dá)下降（0.25±0.02）倍（P＜0.01）（圖3B）。

2.2.2 miR-155模擬劑對(duì)成骨相關(guān)基因的影響 以miR-155模擬劑和其同型對(duì)照瞬時(shí)轉(zhuǎn)染BMSCs，24 h后qRT-PCR顯示，與miRNA模擬劑的同型對(duì)照比較，miR-155模擬劑轉(zhuǎn)染使BMSCs中miR-155表達(dá)上調(diào)達(dá)（23.88±1.64）倍（P＜0.01）（圖3C）。miR-155模擬劑轉(zhuǎn)染BMSCs 24 h后進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，誘導(dǎo)第12天時(shí)qRT-PCR分析顯示，與miRNA模擬劑的同型對(duì)照比較，miR-155模擬劑成骨相關(guān)基因RUNX2的表達(dá)量從（11.72±1.63）下降到（4.06±0.80）（P＜0.01），OCN從（6.31±0.56）下降到（2.14±0.27）（P＜0.01），Col-Ⅰ從（15.56±1.39）下降到（2.14±0.27）（P＜0.01）（圖3D）。

2.2.3 miR-155模擬劑對(duì)ALP表達(dá)及活性的影響

成骨誘導(dǎo)第12天ALP染色顯示，miR-155模擬劑ALP染色陽(yáng)性細(xì)胞明顯少于其同型對(duì)照 （圖4A，封四）。ALP活性分析顯示miR-155模擬劑的ALP活性明顯低于其同型對(duì)照（P＜0.01）（圖4B，封四）。

2.2.4 miR-155模擬劑對(duì)細(xì)胞外鈣化基質(zhì)形成的影響 成骨誘導(dǎo)第16天茜素紅染色顯示，miR-155模擬劑形成的橘紅色細(xì)胞外礦化基質(zhì)明顯少于其同型對(duì)照（圖4C，封四）。

2.3 miR-155抑制劑對(duì)BMSCs成骨分化的影響

圖2 qRT-PCR檢測(cè)成骨基因表達(dá)

2.3.1 miR-155抑制劑轉(zhuǎn)染效率及抑制效率鑒定miR-155的抑制劑和其同型對(duì)照瞬時(shí)轉(zhuǎn)染BMSCs 24 h后，qRT-PCR測(cè)定顯示，與miRNA抑制劑的同型對(duì)照比較，miR-155的抑制劑轉(zhuǎn)染使BMSCs中miR-155表達(dá)下降（0.28±0.03）倍（P＜0.01）（圖5A）。

2.3.2 miR-155抑制劑對(duì)成骨標(biāo)志基因的影響 miR-155抑制劑轉(zhuǎn)染BMSCs，24 h后進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)第12天時(shí)qRT-PCR分析顯示，與miRNA抑制劑的同型對(duì)照比較，轉(zhuǎn)染miRNA抑制劑的成骨細(xì)胞中成骨分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子RUNX2的相對(duì)表達(dá)量從（8.97±0.40）上升到（17.35±1.02）（P＜0.01），OCN的相對(duì)表達(dá)量從（5.14±0.12）上升到（9.72±0.99）（P＜0.05），Col-Ⅰ的相對(duì)表達(dá)量從 （9.33±1.09）上升到（18.58± 1.01）（P＜0.05）（圖5B）。

2.3.3 miR-155抑制劑對(duì)ALP染色和活性的影響

成骨誘導(dǎo)第12天，ALP染色顯示，miR-155抑制劑的ALP染色陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)明顯多于其同型對(duì)照（圖6A，封四）。ALP活性分析顯示，轉(zhuǎn)染miR-155抑制劑的成骨細(xì)胞中ALP活性明顯高于其同型對(duì)照 （P＜0.01）（圖6B，封四）。

2.3.4 miR-155抑制劑對(duì)細(xì)胞外鈣化基質(zhì)形成的影響 成骨誘導(dǎo)第16天茜素紅染色顯示，轉(zhuǎn)染miR-155抑制劑后形成的橘紅色細(xì)胞外礦化基質(zhì)明顯多于其同型對(duì)照（圖6C，封四）。

3 討論

激素性骨質(zhì)疏松癥是臨床繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的最常見(jiàn)類型[7-9]。大量應(yīng)用糖皮質(zhì)激素可刺激脂肪分化，抑制成骨分化，降低骨形成速率以及骨密度，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[10-15]。作為最常見(jiàn)糖皮質(zhì)激素之一，地塞米松能激活BMSCs表面的糖皮質(zhì)激素受體，導(dǎo)致BMSCs向脂肪分化，減少其向成骨細(xì)胞分化[9-15]。

圖3 過(guò)表達(dá)miR-155促進(jìn)成骨分化

圖5 下調(diào)miR-155表達(dá)促進(jìn)成骨分化

最近大量的研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs在調(diào)控成骨細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用[16-18]，而地塞米松導(dǎo)致BMSCs中miRNAs的表達(dá)明顯改變。miRNA芯片分析發(fā)現(xiàn)，較高濃度的地塞米松處理后導(dǎo)致BMSCs中包括miR-155在內(nèi)的9個(gè)miRNAs表達(dá)明顯上調(diào)[8]。地塞米松是否通過(guò)誘導(dǎo)這些miRNAs表達(dá)來(lái)發(fā)揮其對(duì)成骨分化的抑制作用目前還不清楚。與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相一致[8]，本研究結(jié)果也提示，地塞米松能夠明顯上調(diào)BMSCs中miR-155的表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-155在調(diào)控BMSCs向成骨細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用，miR-155能夠明顯抑制BMSCs的成骨分化，表現(xiàn)為成骨相關(guān)基因的抑制，ALP染色陽(yáng)性率和ALP活性的明顯下降，細(xì)胞外形成的鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量明顯減少。而將BMSCs中內(nèi)源性miR-155的表達(dá)抑制后能夠明顯促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞的分化。提示，地塞米松可能通過(guò)上調(diào)miR-155及其他一些miRNAs的表達(dá)，發(fā)揮其抑制成骨分化的作用。

miR-155最早作為癌基因被發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞增殖和炎性反應(yīng)相關(guān)。在EB病毒陽(yáng)性的B細(xì)胞株中，miR-155能夠通過(guò)靶向一系列BMP信號(hào)通路級(jí)聯(lián)分子SMAD1、SMAD5、RUNX2等，抑制BMP2、BMP6和BMP7誘導(dǎo)的ID3表達(dá)[18]。在融合性大B細(xì)胞淋巴瘤中，miR-155被發(fā)現(xiàn)能夠直接靶向BMP反應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子Smad5，調(diào)控細(xì)胞周期阻滯[19]。在MC3T3-E1中抑制miR-155的表達(dá)能夠部分減輕腫瘤壞死因子-α對(duì)BMP-2誘導(dǎo)成骨分化的抑制作用[20]。在BMSCs中miR-155是否通過(guò)調(diào)控BMP/Smads通路發(fā)揮抑制成骨分化的作用還有待進(jìn)一步研究。

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Regulation effect of miR-155 in the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells

YANG Xiaoqing SU Jian▲
Beijing Institute of Medical Device Testing，Beijing 100700，China

Objective To investigate the effect of miR-155 on the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs).Methods BMSCs were isolated from C57/BL6J cultured mouse,and were inoculated according to the concentration of 2×105/mL,then BMSCs were transfected by miR-155 mimics and miR-155 inhibitors after the cells sticking wall,at the same time,the same type of contrast were set up.The expression of marker gene in BMSCs, such as RUNX2,OCN and Col-Ⅰwere detected by qRT-PCR after different transfection;the expression of ALP and enzyme activity were determined by ALP staining，and ALP activity assay;extracellular calcium nodule formation was assessed by alizarin red staining.Results miR-155 was up-regulated at（13.56±0.45）folds（P＜0.01）in dexamethasone-treated BMSCs，and its expression was significantly elevated at day 4 of osteogenic differentiation in BMSCs（P＜0.01）.The expression levels of osteogenic-related genes RUNX2，OCN and Col-Ⅰ，ALP activity in miR-155 mimictransfected BMSCs after induction for 12 days were significantly lower than the control of miR-155 mimic（P＜0.01），and the number of positive cell after ALP staining and alizarin red staining were significantly less than the control of miR-155 mimic.In contrast，the expression levels of RUNX2，OCN and Col-Ⅰ increased in miR-155 inhibitorstransfected BMSCs after induction for 12 days（P＜0.05 or P＜0.01）;the activity of ALP were significantly higher than the control of miR-155 inhibitors（P＜0.01）,and the number of positive cell after ALP staining and alizarin red staining were significantly more than the control of miR-155 inhibitors.Conclusion The osteoblastic differentiation of BMSCs can remarkably inhibit by miR-155 mimic transfection and significantly promoted by miR-155 inhibitor transfection.As a novel negative regulator in osteogenic differentiation，miR-155 may be an effective intervention targets for osteoporosis and other osteogenic differentiation disorder-related diseases.

Dexamethasone;Bone marrow mesenchymal stem cells;Osteogenic differentiation;miR-155;Osteoporosis

R68

A

1673-7210（2015）11（c）-0038-05

2015-08-05本文編輯：任 念）

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