丁 超 李 奇 林荔軍 孫永建

新型復(fù)合纖維蛋白膠的磷酸鈣骨水泥的生物安全性研究

丁 超 李 奇 林荔軍 孫永建

目的研究新型復(fù)合纖維蛋白膠的磷酸鈣骨水泥的生物相容性和生物安全性，探討其用于臨床修復(fù)骨缺損的可行性。方法制備新型復(fù)合纖維蛋白膠的磷酸鈣骨水泥，獲取材料浸提液。選擇急性毒性試驗、溶血試驗、微核試驗、細胞毒性試驗，對新型復(fù)合人工骨材料進行生物相容性和安全性評價。結(jié)果該磷酸鈣骨水泥材料浸提液未引起小鼠急性毒性反應(yīng)；各實驗組肉眼下未見明顯溶血反應(yīng)，溶血率＜5%；微核實驗顯示，各實驗組微核率與陰性對照組無差別（P＞0.05）；浸提液對小鼠MC3T3成骨細胞的生長分化無明顯影響，細胞毒性分級為Ⅰ級。結(jié)論新型復(fù)合纖維蛋白膠的磷酸鈣人工骨材料具有良好的生物相容性和生物安全性。

磷酸鈣骨水泥纖維蛋白膠生物相容性生物安全性

隨著與老齡化、戶外運動、交通事故等有關(guān)的骨損傷的增加，骨骼的重建及骨缺損的修復(fù)日漸成為骨科臨床的一個重要難題[1]。替代骨缺損的生物材料眾多，但各有優(yōu)缺點。目前的治療方法有自體骨移植、同種異體骨移植、生物材料填充等，治療效果和模式都不很理想。磷酸鈣骨水泥（CPBC）具有自固化特點，可以任意塑形，有良好的生物相容性、可降解性和骨傳導(dǎo)性等。目前，CPBC已獲準進行臨床試驗，但在臨床應(yīng)用中面臨問題，由于某些情況下手術(shù)部位難以徹底止血，骨水泥注入后原位固化時需要具有合適的凝固時間和良好的抗稀散性能[2-3]；另外，CPBC具有易脆性和相對較低的抗壓強度，難以用于負重骨、段性骨缺損的治療[4-5]。因此，本實驗針對這些缺點，研制了具有良好物理學(xué)性能的復(fù)合纖維蛋白膠（FG）的β－TCP/MCPM復(fù)合人工骨材料，研究其生物相容性和安全性。

1 材料和方法

1.1 實驗試劑與材料

FG（廣州倍繡生物技術(shù)有限公司，分為生物膠主體、主體溶解液、催化劑及催化劑溶解液部分），β-磷酸三鈣（上海瑞邦生物材料有限公司），磷酸二氫鈣（東泰化工贈）。

1.2 磷酸鈣骨水泥/纖維蛋白膠復(fù)合人工骨的制備

將β-TCP和MCPM按3∶1配比充分混合后，與500 mmol/L檸檬酸溶液按固液比1∶0.3的重量體積比混合，再用雙腔推液器同時加入相同體積的纖維蛋白原溶液和凝血酶溶液。二者按凝固后體積比為2∶1的比例均勻混合。

1.3 材料浸提液的獲取

取CPBC骨水泥試樣置于細胞培養(yǎng)瓶，于高壓蒸汽滅菌鍋中進行30 min滅菌處理。將生理鹽水按0.2 g/mL加入培養(yǎng)瓶，置于37℃恒溫箱中浸提72 h，過濾除菌后分裝，密封，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。將塊狀CPBC按0.2 g/mL的量置于新配置的DMEM/F-12培養(yǎng)液中，37℃恒溫箱中浸提72 h，過濾除菌分裝，密封，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 急性毒性實驗

取體質(zhì)量（20±2）g的小鼠20只，分為材料浸提液組和生理鹽水組，每組雌、雄各5只，分別靜脈注射浸提液原液和生理鹽水，取上述磷酸鈣骨水泥材料浸提液和生理鹽水浸提液每只注射1 mL。注射24 h、48 h和72 h后小鼠稱重，并觀察小鼠。

1.5 溶血試驗

將新鮮抗凝人血用生理鹽水稀釋成2%人血懸液。在不同的試管中分別加入材料浸提液、50%材料浸提液、10%材料浸提液、生理鹽水（陰性對照）和雙蒸水（陽性對照），每組各5份，每管2 mL。再在每管分別加入2%新鮮健康人血懸液2 mL，37℃水浴1 h，肉眼觀察有無溶血。1 000 r/min離心5 min。取上清液1 mL，加入0.1%Na2CO3溶液4 mL，在752型分光光度計540 nm處測定各樣本光密度并計算溶血率。溶血率=（樣品吸光度-陰性對照吸光度）/（陽性對照吸光度-陰性對照吸光度）。

1.6 微核試驗

取健康昆明種小鼠，體質(zhì)量25～30 g，雌雄各半，隨機分為5組，每組各5只。其中3組分別腹腔注射不同劑量的材料浸提液（0.1、0.2、0.4 mL），另2組為陰性對照組（生理鹽水）和陽性對照組（環(huán)磷酰胺100 m/g）。采用4次給藥法，每次間隔24 h，于第4次給藥后6 h處死動物。取股骨髓制片，瑞特氏（Wright）染色。選擇細胞分布均勻、完整、著色適當?shù)膮^(qū)域在油鏡下計數(shù)，每只動物觀察1 000個嗜多染紅細胞，計數(shù)其中含微核的嗜多染紅細胞數(shù)，計算微核細胞率。

1.7 細胞毒性實驗

取MC3T3成骨細胞（南方醫(yī)科大學(xué)解剖實驗室贈），經(jīng)復(fù)蘇、傳代后，于對數(shù)生長期胰酶消化，制成密度為5×104cells/mL的細胞懸液，接種于96孔板，細胞貼壁后棄培養(yǎng)液，加入不同濃度的DMEM/ F-12材料浸提液（浸提液組、50%浸提液組、10%浸提液組），單純培養(yǎng)液組為陰性對照，含0.64%苯酚的培養(yǎng)液組為陽性對照。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于24、48、72 h后取出，每孔加入0.5% MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜150 μL，震蕩5 min，酶標儀490 nm下測定每孔OD值。計算細胞相對增殖率，RGR=（試驗組OD值-空白OD值）/（陰性對照組OD值-空白OD值），并進行細胞毒性分級。RGR≥100%為0級；75%～99%為Ⅰ級；50%～74%為Ⅱ級；25%～49%為Ⅲ級；1%24%為Ⅳ級；0為Ⅴ級。

2 結(jié)果

2.1 全身急性毒性試驗分析

全身急性毒性試驗分析顯示，浸提液組小鼠的平均體重在注射24、48、72 h后的變化與生理鹽水組基本一致，并且小鼠在注射浸提液后也未出現(xiàn)死亡或昏迷、呼吸抑制、呼吸困難、四肢活動受限等中毒反應(yīng)，表明該復(fù)合人工骨材料沒有急性全身毒性（表1）。

2.2 溶血試驗

溶血試驗肉眼下觀察示，各實驗組和陰性對照組無明顯溶血，陽性對照組可見有明顯溶血，溶血率檢測示各組溶血率均未超過5%，達到《生物材料和醫(yī)療器材生物學(xué)評價技術(shù)要求》（表2）。

表2 各組溶血率（n=5）Table2 Hemolytic rate in each group(n=5)

2.3 微核試驗

各實驗組動物股骨髓嗜多染紅細胞的微核率經(jīng)χ2檢驗，與陰性對照組無顯著性差異（P＞0.05），陰性對照組與陽性對照組差異顯著（P＜0.05）。說明新型復(fù)合人工骨材料的浸提液無細胞遺傳毒性作用（表3）。

表3 微核試驗結(jié)果Table3 The results of micronucleus test

2.4 細胞毒性試驗

細胞毒性試驗顯示，各實驗組和陰性對照組小鼠MC3T3成骨細胞生長分化良好，細胞密度較高，貼壁生長，多為長梭形和多角形，并見圓形分裂狀態(tài)細胞，陽性對照組細胞出現(xiàn)生長分化停止，細胞縮小變類圓形，出現(xiàn)較多漂浮狀死細胞（圖1）。加入MTT后成活的MC3T3成骨細胞中形成結(jié)晶（圖2）。酶標儀測試各組吸光度值及相對增殖率值，結(jié)果顯示各實驗組對MC3T3成骨細胞的細胞毒性均為Ⅰ級，符合《生物材料和醫(yī)療器材生物學(xué)評價技術(shù)要求》的規(guī)定（表4）。

圖1 小鼠MC3T3成骨細胞形態(tài)觀察（200×）Fig.1 Morphological observation of mouse MC3T3 osteoblasts(200×)

圖2 加入MTT后MC3T3細胞形態(tài)（200×）Fig.2 Morphology of MC3T3 after MTT added(200×)

表4 細胞毒性試驗結(jié)果（n=5）Table4 The results of cell toxicity test(n=5)

3 討論

磷酸鈣骨水泥作為骨的替代材料已有較長的歷史，已有部分產(chǎn)品用于臨床修復(fù)骨缺損[6-8]。生物材料在具有合理的物理性能的同時，還需進行生物相容性的評價。完整的生物學(xué)評價應(yīng)包括初級急性毒性篩選、動物體內(nèi)應(yīng)用和臨床試用3級試驗，以保證使用安全。如何快速準確地評價材料的生物相容性和生物安全性，對于研制新材料和縮短研制周期起著重要的作用[9]。生物材料的評價方法有多種，本研究的材料生物學(xué)評價主要參考了國際標準化組織（ISO）頒布的ISO10993系列標準，國家醫(yī)藥管理局頒布的GB/T16886系列，以及1982年美國國家標準學(xué)會和牙科協(xié)會（ANSI/ADA）公布的評價生物相容性實驗標準草案，選擇急性毒性試驗、溶血試驗、微核試驗、細胞毒性試驗對新型復(fù)合纖維蛋白膠的磷酸鈣人工骨材料進行生物相容性和安全性評價。

生物材料中一些易溶出物質(zhì)是引起炎癥的主要原因[10]。為研究這些溶出物的細胞毒性，可采用浸提液法。該法是將試樣投入培養(yǎng)液或蒸餾水中，在適當條件下進行浸泡，制備出含有溶出物的浸泡液，再將浸提液加在含有細胞的培養(yǎng)皿繼續(xù)培養(yǎng)，觀察溶出物對細胞的影響[11]。本研究通過觀察材料浸提液對細胞及動物的影響，評價材料的生物安全性。對于體外血液相容性評價，需選用合理的血液與材料接觸模型、敏感而又特異的檢測指標，而目前對于血液材料接觸模型、檢測指標及方法尚無明確的標準[12]。本研究急性毒性實驗結(jié)果顯示，實驗組與陰性對照組無明顯差異，說明該材料浸提液沒有對小鼠產(chǎn)生明顯的毒性反應(yīng)。溶血率檢測示各組溶血率均未超過5%，達到標準要求，符合上海市非直接接觸血液的醫(yī)用生物材料生物性能測試試行規(guī)格中規(guī)定的標準。根據(jù)ISO以及我國GB/T16886中有關(guān)生物材料生物學(xué)評價的要求中推薦首先使用短期遺傳毒性試驗做篩選，規(guī)定短期遺傳毒性試驗陰性者可不做致癌試驗。因此，本實驗選擇微核實驗來評價CPBC的遺傳毒性，結(jié)果示實驗組微核率與陰性對照組差異不顯著，陰性對照組與陽性對照組差異顯著。說明該復(fù)合人工骨材料的浸提液無細胞遺傳毒性作用。體外細胞實驗是初級急性毒性篩選的一個重要方面，是一種快速、簡便、重復(fù)性好又廉價的檢測材料生物相容性方法，在評價材料生物相容性方面的地位已得到公認[13]。細胞毒性試驗的方法有多種，本實驗采用ISO 10993及GB/T16886中推薦的-四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法，四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法（MTT法）是由Mosroann在1983年提出，最初應(yīng)用于免疫學(xué)領(lǐng)域，近年來應(yīng)用于生物相容性評價中[14-15]。該法簡便迅速，不接觸同位素，而敏感性與同位素法接近。細胞毒性試驗的結(jié)果評判，需將細胞相對增殖率換算成毒性分級，規(guī)定細胞毒性≤Ⅰ級為合格。本研究結(jié)果顯示，各實驗組的細胞毒性均為Ⅰ級，符合生物安全性及相容性要求。

實驗結(jié)果顯示該復(fù)合材料具有良好的生物相容性和生物安全性，達到生物相容性和生物安全性要求，基本滿足作為注射型人工骨材料臨床應(yīng)用的安全性需要，也為進一步進行動物體內(nèi)試驗提供了理論基礎(chǔ)。

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Biocompatibility and Biosafety Research of New Compound of Fibrin Glue and Calcium Phosphate Bone Cement

DING Chao,LI Qi,LIN Lijun,SUN Yongjian.The Fifth Affiliated Hospital Orthopaedics,Southern Medical University, Conghua 510900,China.Corresponding author:DING Chao(E-mail:nfwydingchao@163.com)

ObjectiveTo explore the biocompatibility and biosafety of new compound of fibrin glue and calcium phosphate bone cement,and to investigate the clinical feasibility for bone reconstruction.MethodsThe new compound of fibrin glue and calcium phosphate bone cement was prepared and the extract liquid was obtained.The acute toxicity test, hemolysis test,micronucleus test,the cytotoxic test were used for the biocompatibility and biosafety evaluation of the new compound.ResultsThe CPBC extract liquid did not cause acute toxicity in mice;No hemolytic reaction was observed in experimental groups by visual inspection and the hemolytic rate was less than 5%;Micronucleus test showed no significant differences between experimental group and negative control group;The extract liquid had no significant impact on growth and differentiation of mice MC3T3 osteoblasts,and the cell toxicity classification was class I.ConclusionThe new compound of fibrin glue and calcium phosphate bone cement have good biocompatibility and biosafety.

Calcium phosphate bone cement;Fibrin glue;Biocompatibility;Biosafety

H,Nakamura M.A study on

tandard for cytotoxicity assay of biomaterials[J].Biomed Mater Eng,1994,4 (4):327-332.

R318.08

A

1673－0364（2015）05－0301－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2015.05.004

2015年4月11日；

2015年6月7日）

510900廣東省從化市南方醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院骨科。

丁超（E-mail：nfwydingchao@163.com）。