曹 蕊 肖 苒 傅 歆 嚴 笠

懸滴培養(yǎng)法維持瘢痕疙瘩成纖維細胞表面標志CD105的表達及其功能

曹 蕊 肖 苒 傅 歆 嚴 笠

目的探討懸滴培養(yǎng)法對維持體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細胞表面標志的作用，并初步研究CD105調(diào)節(jié)細胞功能的作用。方法以耳部瘢痕疙瘩標本3例培養(yǎng)成纖維細胞，將第5代細胞分別常規(guī)貼壁培養(yǎng)和懸滴培養(yǎng)1周，對同一患者來源常規(guī)培養(yǎng)的第4代（P4）、第5代（P5）以及懸滴培養(yǎng)的第5代細胞（P5HD），采用多色流式細胞儀檢測表面標志CD105、CD90、CD73和CD44的表達；并采用Real-time PCR的方法，檢測上述表面標志，以及瘢痕疙瘩成纖維細胞相關(guān)功能基因CTGF、Col IA1和Col IA2的mRNA表達。結(jié)果流式檢測顯示CD105+和CD73+CD90+CD105+細胞比例在P4和P5HD組均高于P5組，統(tǒng)計學分析顯示有顯著性差異，但P4和P5HD組之間無差異；而CD73+、CD90+和CD44+各組細胞比例無差異。Real-time PCR結(jié)果顯示，各組細胞CD105的mRNA表達與流式結(jié)果一致；且各組CTGF和Col IA1表達差異與CD105一致。結(jié)論懸滴培養(yǎng)法有助于維持體外瘢痕疙瘩成纖維細胞CD105，及其與纖維化和膠原合成相應功能基因的表達，從而保持細胞的生物學功能，但機制有待于進一步的研究。

瘢痕疙瘩成纖維細胞懸滴培養(yǎng)法白細胞分化抗原105

瘢痕疙瘩是皮膚創(chuàng)傷的病理性愈合，具有腫瘤浸潤性生長的特性，病程遷延不愈，復發(fā)率達50%~ 80%，臨床尚無一種安全有效的治療方法[1]。其發(fā)生機制仍不清楚，研究表明，成纖維細胞是其最重要的致病功能細胞，可持續(xù)增殖產(chǎn)生過量的細胞外基質(zhì)，使得纖維化不斷向周邊擴散。而瘢痕疙瘩來源的成纖維樣細胞中包含了間充質(zhì)樣干細胞，可能是其致病機制之一[2]。同時，體外實驗中觀察發(fā)現(xiàn)，瘢痕疙瘩成纖維細胞與正常細胞的差異與細胞對生長環(huán)境的反應相關(guān)，不同培養(yǎng)基和接種密度可以影響細胞的基因表達，提示培養(yǎng)條件對細胞行為的關(guān)鍵作用[3]。因此，在瘢痕疙瘩的研究中，為了防止長期體外培養(yǎng)引起細胞的改變，獲得可靠的研究數(shù)據(jù)，一般采用培養(yǎng)5代以內(nèi)的細胞進行研究。

懸滴培養(yǎng)法是常用于誘導胚胎干細胞形成擬胚體的一種培養(yǎng)方法，由液體懸滴形成的圓形底部有利于細胞在重力作用下發(fā)生聚集，形成細胞小球，為擬胚體的形成提供良好的環(huán)境。近年來，將其用于骨髓干細胞、脂肪干細胞和毛乳頭細胞等多種細胞的體外培養(yǎng)和誘導分化，發(fā)現(xiàn)該方法有利于細胞更好地保持其表型以及定向分化[4-6]。但懸滴培養(yǎng)法在瘢痕疙瘩成纖維細胞培養(yǎng)中的應用，及其對細胞表型和功能的影響，尚未見文獻報道。

本研究將懸滴培養(yǎng)應用于瘢痕疙瘩成纖維細胞的培養(yǎng)，并檢測了該方法對細胞表面干細胞標志及其相關(guān)功能基因表達的影響，嘗試在體外構(gòu)建能長久保持細胞原有表型和生物學功能的培養(yǎng)環(huán)境，便于瘢痕疙瘩致病機制的研究。

1 材料和方法

1.1 組織和細胞標本

本實驗采用3例瘢痕疙瘩組織，均取自我院行手術(shù)治療的耳部瘢痕疙瘩患者，年齡分別為19、21和24歲，其中1例為手術(shù)后復發(fā)患者。采用組織貼壁法進行上述標本的原代成纖維細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清和雙抗的DMEM，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，每3天更換培養(yǎng)基，細胞采用0.25%胰酶消化以1∶4進行傳代。

1.2 試劑和儀器

細胞培養(yǎng)常規(guī)采用DMEM高糖培養(yǎng)基（Hyclone公司，USA），加入10%胎牛血清（Gibco公司，USA）、青-鏈霉素（Hyclone公司，USA）100 u/ml、0.25%胰酶（Sigma公司，USA）；懸滴培養(yǎng)基配方包含DMEM∶F12（Ham）=1∶1（Gibco公司，USA），20% KnockoutTMSR血清替代物（Gibco公司，USA），1% Gluta-Max supplement，10 μM β巰基乙醇，1%非必需氨基酸，40 ng/mL bFGF；人間充質(zhì)干細胞表面標志多色流式檢測試劑Human MSC Analysis Kit（BD公司，USA）。M-MLV Reverse Transcriptase（Invitrogen，USA）；Fast Sta rt Universal SYBR Green Realtime PCR Master Mix試劑盒（Roche公司，Switzerland）。

流式細胞儀為BD AriaⅡ（BD公司，USA），實時熒光定量PCR儀為Roche 480（Roche公司，SWISS）。

1.3 懸滴培養(yǎng)方法

將上述培養(yǎng)的第4代細胞以0.25%胰酶消化、計數(shù)后，以含10%胎牛血清的DMEM中和胰酶作用，離心、去上清，以懸滴培養(yǎng)基重懸細胞，使其濃度為150 cells/μL，以每滴20 μL接種到100 mm培養(yǎng)皿的蓋子上（圖1a），并小心翻轉(zhuǎn)蓋子扣到培養(yǎng)皿上，使液滴倒懸，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d后，采用常規(guī)培養(yǎng)基將含有細胞團的液滴沖洗到培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)1周后進行相應的檢測。

1.4 流式細胞儀檢測細胞表面標志

同一患者來源的普通培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)的第4代（P4）、第5代（P5），以及第5代懸滴培養(yǎng)的細胞（P5HD），采用胰酶消化、中和、離心、去上清，以PBS清洗、離心，加入100 μL流式分析緩沖液重懸細胞，每管按Human MSC Analysis Kit說明書加入相應體積的直標抗體，并設置相應的同型對照和陽性對照管，冰浴30 min，清洗后離心，以0.5 mL流式分析緩沖液重懸細胞，上機進行多色流式檢測。

1.5 RNA提取

同一患者來源的普通培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)的P4、P5和P5HD，加入Trizol，按試劑說明提取總RNA，用紫外分光光度儀檢測總RNA在A260和A280的吸光度，進行RNA濃度和純度的測定。

1.6 cDNA制備

采用M-MLV Reverse Transcriptase合成cDNA第一鏈，以oligo-p(dt)15為引物，總反應體系20 μl，模板RNA為1 μg。

1.7 Real-time PCR

采用Fast Start Universal SYBR Green Realtime PCR Master Mix試劑盒進行實時PCR，反應體系包含1 μL cDNA，SYBR Green Master 10 μL，引物濃度為0.4 μM，總反應體系20 μL（表1）。反應條件：預變性95℃，2 min；變性94℃，10 sec，60℃，10 sec，72℃，20 sec，45個循環(huán)。以GAPDH基因為內(nèi)參基因，采用Roche 480 PCR儀的分析軟件，分析各基因表達的相對定量，獲得各樣本中靶基因mRNA的相對含量。在每一個PCR反應的終點，建立熱變性曲線，并測量PCR產(chǎn)物的解鏈溫度Tm，以驗證反應的特異性。

1.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS（Version 17.0）軟件，Oneway-ANOVA檢驗對檢測結(jié)果進行統(tǒng)計學分析，P＜0.05為有顯著性差異。數(shù)據(jù)以x±s表示。

2 結(jié)果

2.1 懸滴培養(yǎng)觀察

細胞于接種第2天在培養(yǎng)皿蓋子的液滴底部聚集成小的細胞球（圖1a），在進入培養(yǎng)皿常規(guī)培養(yǎng)后，細胞球可貼附到皿底部，并以其為中心向周圍呈放射狀生長，類似組織貼壁法培養(yǎng)的瘢痕疙瘩原代細胞的生長方式（圖1b、1c）。

2.2 細胞表面標志流式檢測

在P4、P5和P5HD組細胞中CD73+細胞分別占（99.433 3%±0.230 9%），（99.833 3%±0.115 5%）和（99.900 0%±0.000 0%）；CD90+細胞分別占（99.833 3%± 0.115 5%），（99.066 7%±1.274 1%）和（99.666 7%± 0.305 5%）；CD44+細胞分別占（99.033 3%±0.378 6%），（98.766 7%±0.611 0%）和（99.433 3%±0.305 5%），上述三種標志的陽性細胞比例，各組間無顯著性差異（P＞0.05）（圖2 a）。

CD105+細胞在P4、P5和P5HD組分別占（92.3%±9.245 5%），（75%±3.026 6%）和（95.2%± 7.196 6%），差異顯著（P＜0.05）；其中P4、P5組之間，P5和P5D組之間均有顯著差異（P＜0.05），但P4、P5HD組間無顯著性差異（P＞0.05）（圖2 a）。

對CD73、CD90、CD105進行三色分析，發(fā)現(xiàn)CD73+CD90+CD105+細胞在P4、P5和P5HD組分別為（91.4%±12.113 2%），（57.3%±15.247 3%）和（92.833 3%±8.403 8%），有顯著性差異（P＜0.05）；其中P4、P5組間，P5和P5HD組間差異顯著（P＜0.05），但P4和P5HD組間無顯著性差異（P＞0.05）（圖2b、2c）。

2.3 Real-time PCR檢測

檢測3個患者瘢痕疙瘩成纖維樣細胞不同處理組的CD73、CD90、CD105、CD44，及CTGF、ColⅠA1、ColⅠA2的mRNA表達，結(jié)果示，P4、P5和P5HD組CD73表達分別為（0.103 0±0.041 6）、（0.135 8± 0.087 5）和（0.147 3±0.024 1）（圖3a）；CD90表達分別為（0.326 4±0.055 4）、（0.248 3±0.115 9）和（0.505 2±0.177 1）（圖3b）；各組間無顯著性差異（P＞0.05）。

各組CD105表達分別為（1.104 1±0.438 9）、（0.163 6±0.057 8）和（0.826 1±0.151 1），差異顯著（P＜0.05）；其中P4、P5組間，P5和P5HD組間差異顯著（P＜0.05），但P4和P5HD組間無顯著性差異（P＞0.05）（圖3c）；各組CD44表達分別為（0.162 3±0.018 8）、（0.230 7±0.075 4）和（0.437 0±0.137 2）（圖3d），有顯著性差異（P＜0.05），其中P4、P5組P＞0.05，但P5和P5HD組P＜0.05，P4和P5HD組P＜0.05。

各組CTGF表達分別為（0.509 5±0.212 9）、（0.128 0±0.009 0）和（0.382 8±0.004 5），有顯著性差異（P＜0.05）。其中P4、P5組，P5和P5HD組P＜0.05；但P4和P5HD組間無差異（P＞0.05）（圖4a）；各組ColⅠA1表達分別為（1.403 0±0.525 5）、（0.603 3±0.040 8）和（1.370 0±0.062 5），有顯著性差異（P＜0.05）。其中P4、P5組，P5和P5HD組間P＜0.05；但P4和P5HD組間無差異（P＞0.05）（圖4b）；各組ColⅠA2表達分別為（0.937 3±0.526 2）、（0.352 7±0.058 3）和（0.896 0±0.438 8），無顯著性差異（P＞0.05）（圖4c）。

表1 引物序列Table 1Primer sequences

圖1 懸滴法培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細胞Fig.1Graphic of keloid fibroblasts using hanging-drop culture method

圖2 流式細胞儀檢測各組瘢痕疙瘩成纖維細胞表面間充質(zhì)干細胞標志表達Fig.2Expressions of mesenchymal stem cell surface markers in keloid fibroblasts of each group by flow cytometry

圖3 熒光定量PCR檢測各組瘢痕疙瘩成纖維細胞表面標志基因表達Fig.3Expressions of mesenchymal stem cell surface markers in keloid fibroblasts of each group by Real-time PCR

圖4 熒光定量PCR檢測各組瘢痕疙瘩成纖維細胞相關(guān)功能基因表達Fig.4Expressions of related functional genes in keloid fibroblasts of each group by Real-time PCR

3 討論

在創(chuàng)傷愈合過程中，真皮成纖維細胞負責細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和重塑，是這一過程中最主要的功能細胞，既往研究已證實瘢痕疙瘩成纖維細胞在基因表達、細胞增殖和凋亡、細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生等諸多方面存在異常。但是，在體外培養(yǎng)下，如何保持細胞的表型及其相應的生物學特性，一直是困擾人們的問題。瘢痕疙瘩來源的成纖維樣細胞中包含了間充質(zhì)樣干細胞，與骨髓基質(zhì)干細胞類似，可以表達CD73、CD90、CD105、CD44等間充質(zhì)干細胞的標志[7]，具有多向分化能力[6]。以專用于分析人間充質(zhì)干細胞的流式試劑盒檢測瘢痕疙瘩成纖維樣細胞，發(fā)現(xiàn)在第1代細胞中的CD34-、CD73+、CD90+、CD105+的間充質(zhì)干細胞可達16%[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，在常規(guī)的培養(yǎng)基和普通貼壁培養(yǎng)條件下，瘢痕疙瘩成纖維細胞在培養(yǎng)到第5代時，其CD105+細胞的比例及其mRNA表達均比第4代細胞明顯下降，其他標志CD44、CD73、CD90則無明顯改變，這一表型變化與之前報道的正常人皮膚成纖維的CD105從原代93.42%到第6代84.33%的變化趨勢一致[9]。因此，本研究結(jié)果提示，隨著體外培養(yǎng)時間的延長，來自瘢痕疙瘩的成纖維細胞會逐漸喪失其某些表型。

近年來，懸滴培養(yǎng)法被用于多種細胞的體外培養(yǎng)和誘導分化，與普通的二維貼壁培養(yǎng)法相比較，該方法有利于骨髓干細胞向肝細胞分化，以及脂肪干細胞成骨分化，并能使毛乳頭細胞更好地保持其表型[10]。分析認為，在細胞相互聚集成球狀結(jié)構(gòu)的三維立體環(huán)境中，細胞間的廣泛接觸有助于保持其表型穩(wěn)定，并能更好地維持其分化成熟后的各種功能[3-5]。

我們采用懸滴培養(yǎng)法對第5代細胞培養(yǎng)1周，發(fā)現(xiàn)其CD105+細胞比例及其mRNA表達，與第4代細胞無明顯差異，但比第5代普通培養(yǎng)細胞明顯增加，提示該方法有助于瘢痕疙瘩成纖維細胞在體外維持CD105的表達。

CD105是細胞表面的跨膜同源二聚體蛋白，屬于TβRⅢ，是TGF-β信號通路的輔助受體，在血管內(nèi)皮細胞和造血細胞中高表達，也是骨髓、脂肪和皮膚來源的多種基質(zhì)干細胞的表面標志之一[11]。CD105的表達可隨細胞分化狀態(tài)而改變，例如人脂肪干細胞在未分化時表達CD73和CD105，在成脂誘導分化后，CD73仍可維持，而CD105表達抑制[12]。

CD105是血管形成的關(guān)鍵介質(zhì)，在多種腫瘤的血管內(nèi)皮細胞中高表達，與惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移和復發(fā)有關(guān)[13]。在針對腎、肝纖維化和硬皮病的研究中發(fā)現(xiàn)，患者的組織、成纖維細胞和血漿中CD105高表達，并可通過激活ALK1/Smad1作用于促纖維化的TGF-β信號通路。在硬皮病的成纖維細胞中，ALK1/ Smad1途徑的活化可以導致促纖維化的CTGF和膠原基因的表達[14]。因此，我們利用Real-time PCR檢測了CD105導致纖維化疾病的相關(guān)功能基因CTGF和Ⅰ型膠原亞基（ColⅠA1和ColⅠA2）mRNA的表達，證實隨CD105的表達下調(diào)，第5代常規(guī)培養(yǎng)的成纖維細胞CTGF和ColIA1的表達下降，但第5代懸滴法培養(yǎng)的細胞與第4代常規(guī)培養(yǎng)的細胞相比，CTGF和Ⅰ型膠原基因的mRNA表達無明顯改變。提示懸滴法在維持瘢痕疙瘩成纖維細胞表型的同時，也可以維持其相應的功能基因的表達，有助于保持細胞的生物學功能。此外，CD105有可能通過調(diào)節(jié)膠原合成相關(guān)的基因而發(fā)揮其致病作用，但作用機制有待進一步研究。

[1]郭雷洋,曹莫.瘢痕疙瘩發(fā)病機制的研究進展[J].中國美容醫(yī)學, 2012,21(9):1674-1677.

[2]Moon JH,Kwak SS,Park G,et al.Isolation and characterization of multipotent humankeloid-derived mesenchymal-like stem cells[J].Stem Cells Dev,2008,17(4):713-724.

[3]McFarland KL,Glaser K,Hahn JM,et al.Culture medium and cell density impact gene expression in normal skin and abnormal scar-derived fibroblasts[J].J Burn Care Res,2011,32(4):498-508.

[4]Wang X,Yang P.In vitro Differentiation of mouse embryonic stem(mES)cells using the hanging drop method[J].J Vis Exp, 2008,23(17):825.

[5]張齊好,鄭煒煒,高麗蓮,等.懸滴培養(yǎng)誘導大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞分化為肝樣細胞[J].中國病理生理雜志,2010,26(11):2207-2211. [6]楊靜,張琪.懸滴培養(yǎng)對人脂肪間充質(zhì)干細胞成骨分化的影響[J].解放軍醫(yī)學雜志,2012,37(6):602-605.

[7]Calloni R,Cordero EA,Henriques JA,et al.Reviewing and updating the major molecular markers for stem cells[J].Stem Cells Dev,2013,22(9):1455-1476.

[8]Iqbal SA,Sidgwick GP,Bayat A.Identification of fibrocytes from mesenchymal stem cellsin keloid tissue:a potential source of abnormal fibroblasts in keloid scarring[J].Arch Dermatol Res, 2012,304(8):665-671.

[9]Lorenz K,Sicker M,Schmelzer E,et al.Multilineage differentiation potential of human dermal skin-derived fibroblasts[J].Exp Dermatol,2008,17(11):925-932.

[10]Higgins CA,Richardson GD,Ferdinando D,et al.Modelling the hair follicle dermal papilla using spheroid cell cultures[J].Exp Dermatol,2010,19(6):546-548.

[11]Al-Nbaheen M,Vishnubalaji R,Ali D,et al.Human stromal (mesenchymal)stem cells from bone marrow,adipose tissue and skin exhibit differences in molecular phenotype and differentiation potential[J].Stem Cell Rev,2013,9(1):32-43.

[12]Mohsen-Kanson T,Hafner AL,Wdziekonski B,et al.Expression of cell surface markers during self-renewal and differentiation of human adipose-derived stem cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2013,430(3):871-875.

[13]Duff SE,Li C,Garland JM,et al.CD105 is important for angiogenesis:evidence and potential applications[J].FASEB J,2003, 17(9):984-992.

[14]Morris E,Chrobak I,Bujor A,et al.Endoglin promotes TGF-β/ Smad1 signaling in scleroderma fibroblasts[J].J Cell Physiol, 2011,226(12):3340-3348.

Maintenance of Cell Surface Marker CD105 and Its Function by Hanging-drop Culture Method

CAO Xin,XIAORan,FU Xin,YAN Li.
Plastic Surgery Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College, Beijing 100144,China.Corresponding author:YAN Li(E-mail:yanli@psh.pumc.edu.cn).

ObjectiveTo investigate the maintenance of cell surface markers of keloid fibroblasts by hanging-drop culture method,and to preliminarily study the role of CD105 in regulating function of cells.MethodsThe fibroblasts were isolated from 3 keloid samples of ears,and the passage 5 cells were cultured using the adherent culture and the hangingdrop culture method for 1 week respectively.The passage 4(P4)and 5 cells(P5)cultured by adherent culture method and the passage 5 cells cultured by hanging-drop culture method（P5HD）from the same patient were detected for the expression of cell surface markers including CD105,CD90,CD73 and CD44 by multicolor flow cytometry analysis.The mRNA expressions of surface markers and CTGF,Col IA1,Col IA2 were detected using real-time PCR.ResultsThe positive cell percent of CD105+and CD73+CD90+CD105+in P4 and P5HD group were significantly higher than in P5 group by flow cytometry analysis,but there was no difference between P4 and P5HD group.The positive cell percent of CD73+,CD90+and CD44+among three groups had no difference.The CD105 results of real-time PCR were in accordance with that of flow cytometry analysis.The mRNA expression tendency of CTGF and ColIA1 was similar to CD105.ConclusionThe hangingdrop culture method is helpful to maintain the expression of CD105 surface marker and functional genes related to fibrosis and collagen production,then to keep the biological function of keloid fibroblasts,but the underlying mechanism needs to be discovered.

Keloid;Fibroblasts;Hanging-drop culture;Cluster of differentiation 105

Q813.1+1

A

1673－0364（2015）04－0234－05

10.3969/j.issn.1673-0364.2015.04.004

2015年4月19日；

2015年5月28日）

國家自然科學基金（81171817）。

100144北京市中國醫(yī)學科學院整形外科醫(yī)院研究中心。

嚴笠（E-mail：yanli@psh.pumc.edu.cn）。