張 軍 張耀明 王正輝 張 青 羅花南 鄭國璽 侯 瑾 王波濤 楊葉葉 趙小燕 史艷霞

·論著·

Sox9誘導(dǎo)人臍血干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究

張 軍 張耀明 王正輝 張 青 羅花南 鄭國璽 侯 瑾 王波濤 楊葉葉 趙小燕 史艷霞

目的探討Sox9基因?qū)δ氀杉?xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的影響。方法體外分離培養(yǎng)人臍血干細(xì)胞，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Sox9載體質(zhì)粒，觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)的變化，免疫組化染色觀察collagenⅡ、aggrecan的表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)collagenⅠ、collagenⅡ、aggrecan的mRNA水平變化，Western blot檢測(cè)collagenⅡ的表達(dá)變化。結(jié)果Sox9對(duì)臍血干細(xì)胞形態(tài)無明顯影響，與傳統(tǒng)方法誘導(dǎo)組相比，Sox9轉(zhuǎn)染后可明顯促進(jìn)臍血干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化。結(jié)論Sox9對(duì)臍血干細(xì)胞的軟骨分化有很強(qiáng)的調(diào)控作用，臍血干細(xì)胞可作為組織工程軟骨一種良好的種子細(xì)胞。

臍血干細(xì)胞分化Sox9基因

軟骨自身修復(fù)能力非常有限，組織工程軟骨構(gòu)建為修復(fù)軟骨缺損提供了一條新途徑。但是，軟骨細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中存在老化、去分化現(xiàn)象，隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞逐漸向成纖維細(xì)胞分化。因此，獲得充足的種子細(xì)胞是組織工程軟骨構(gòu)建中的重點(diǎn)之一。間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化潛能，存在于脂肪、臍血、胎盤、牙髓、腺體等組織中。人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞（Human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSC）具有來源豐富、易于采集和保存、無異體排斥、長期傳代不變性等優(yōu)點(diǎn)，具備多向分化潛能，可分化為軟骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞等多種細(xì)胞[1]，在組織工程領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。然而臍血干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化率低，限制了其在軟骨組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用。早期研究表明，Sox9（SRY-related high mobility group-box gene 9）在軟骨分化發(fā)育過程中是一個(gè)不可或缺的調(diào)控因子[2-3]。因此，本研究嘗試將臍血干細(xì)胞過表達(dá)Sox9，與傳統(tǒng)誘導(dǎo)方法進(jìn)行比較，觀察其是否能促進(jìn)臍血干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

高糖DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶（GIBCO公司，美國）；透明質(zhì)酸酶、Ⅱ型膠原酶（Sigma公司，美國）；FBS（Invitrogen公司，美國）；Ⅱ型膠原一抗（小鼠抗人，Neomarker公司，美國）；Aggrecan單克隆抗體（羊抗人，Santa Cruz公司，美國）；Sox9質(zhì)粒（Gene Copoeia公司，美國）；RT-PCR mix（Toyoboco公司，日本）；CO2孵箱（Thermo公司，美國）；熒光顯微鏡（Nikon公司，日本）。

1.2 臍血干細(xì)胞的分離培養(yǎng)

本研究經(jīng)西安交通大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。臍血采集后24 h內(nèi)處理，將臍血用PBS以1∶1稀釋，室溫下靜置20 min或至血漿與紅細(xì)胞界面形成后，吸取血漿層，2 000 r/min離心5 min，棄上清，用5 mL α-MEM懸浮細(xì)胞，按2∶1的體積比加到淋巴細(xì)胞分離液（密度1.077 g/mL）表面，使兩者間形成一清晰界面。2 000 r/min離心20 min，離心后輕輕吸取懸于分離液面的白膜層，D-Hank's洗滌，1 000 r/min離心4 min。用5 mL α-MEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，獲得hUCMSCs懸液。按1×106cells/cm2的密度將上述細(xì)胞懸液接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；72 h后更換培養(yǎng)液，之后2 d更換1次培養(yǎng)基。鑒定參照文獻(xiàn)[4]的方法。

1.3 轉(zhuǎn)染Sox9質(zhì)粒

將臍血干細(xì)胞以5×105的密度接種于6孔板內(nèi)，細(xì)胞長至80%～90%時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。參照LipofectamineTM2000說明書進(jìn)行操作。

1.4 臍血干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化

取第3代hUC-MSCs進(jìn)行誘導(dǎo)分化。實(shí)驗(yàn)分為3組：陰性對(duì)照組（未處理組），Sox9轉(zhuǎn)染組，傳統(tǒng)方法誘導(dǎo)組（高糖DMEM培養(yǎng)基中加入5%胎牛血清，100 nM地塞米松，50 μg/mL抗壞血酸，10 ng/mL TGF-β，10 ng/mL IGF-Ⅰ，1×ITS+）；誘導(dǎo)后4%多聚甲醛固定，常規(guī)切片，甲苯胺藍(lán)染色，光鏡觀察。

1.5 RT-PCR檢測(cè)基因的表達(dá)

按照試劑盒說明提取總RNA，使用cDNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，將反轉(zhuǎn)錄的cDNA按照以下體系（25 μL體系）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

β-actin引物序列：正義鏈5'-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3'，反義鏈5'-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3'；Aggrecan引物序列：5'-GCAGTCTTCCAACCCAA-3'，反義鏈5'-ACATCT CCAGCCTCCTTA-3'；CollagenⅠ引物序列：5'-CTTGGTCTCGTCACAGATCA-3'，反義鏈5'-CTTTTAACGGAGGATGTGCTATTTGGC-3'；CollagenⅡ引物序列：5'-GGAGCAGCAAGAGCAAGGAGAAG-3'，反義鏈5'-TGGACAGCAGGCGTAGGAAGG-3'；Sox9引物序列：5'-GAACGCACATCAAGACGGAG-3'，反義鏈5'-TCTCGTTGATTTCGCTGCTC-3'。反應(yīng)條件：94℃2 min，94℃30 sec，53℃30 sec，72℃30 sec，循環(huán)35次。反應(yīng)產(chǎn)物于1%凝膠中進(jìn)行電泳。凝膠成像系統(tǒng)分析各電泳條帶的吸光度，得出mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 免疫學(xué)檢測(cè)

細(xì)胞貼壁后4%多聚甲醛固定，Triton室溫下浸泡25 min，0.01 M PBS洗3次，每次5 min；滴加一滴工作用血清（試劑A），常溫孵育15 min，后分別滴加（1∶200）Ⅱ型膠原（CollagenⅡ）、aggrecan單克隆抗體50 μL，4℃冰箱過夜（＞18 h）；加入二抗稀釋液稀釋二抗，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育15 min；0.01 M PBS洗3次；顯微鏡下觀察。

1.7 Western blot檢測(cè)

誘導(dǎo)2周時(shí)，加入單去污細(xì)胞裂解液，4℃下以12 000 g離心3 min，取上清，用Lowry法定量蛋白，依次加入封閉液、抗CollagenⅠ、CollagenⅡ抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，化學(xué)發(fā)光劑反應(yīng)，X線曝光。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)

轉(zhuǎn)染Sox9載體48 h后細(xì)胞形態(tài)無明顯變化，細(xì)胞生長良好；而傳統(tǒng)誘導(dǎo)組細(xì)胞大量脫落，細(xì)胞數(shù)量減少（圖1）。

2.2 臍血干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化

甲苯胺藍(lán)染色顯示，傳統(tǒng)方法誘導(dǎo)2周后可見蛋白多糖的表達(dá)，而Sox9誘導(dǎo)1周后即可見蛋白多糖的明顯表達(dá)（圖2）。

2.3 軟骨細(xì)胞特異性標(biāo)志物的表達(dá)

免疫組化染色證實(shí)臍血干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞的分化，經(jīng)Sox9誘導(dǎo)1周aggrecan、collagenⅡ染色與傳統(tǒng)誘導(dǎo)液誘導(dǎo)2周無明顯差別（圖3）。

采用RT-PCR檢測(cè)軟骨細(xì)胞特異性標(biāo)志物的mRNA表達(dá)水平。臍血干細(xì)胞經(jīng)Sox9載體轉(zhuǎn)染后，Sox9處于較高的表達(dá)水平。蛋白多糖與Ⅱ型膠原的表達(dá)隨培養(yǎng)時(shí)間延長表達(dá)量逐漸增強(qiáng)，1周時(shí)兩者都有較高的表達(dá)，而Ⅰ型膠原始終未明顯表達(dá)。而在傳統(tǒng)誘導(dǎo)組，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，各組基因表達(dá)量逐漸增強(qiáng)，2周時(shí)蛋白多糖與Ⅱ型膠原的表達(dá)與1周時(shí)Sox9組的表達(dá)無明顯差別，并且Ⅰ型膠原、Sox9的表達(dá)量也逐漸增強(qiáng)（圖4）。

Western blot結(jié)果顯示，Sox9轉(zhuǎn)染組1周時(shí)Ⅱ型膠原表達(dá)量很高，而傳統(tǒng)誘導(dǎo)組表達(dá)量很低，兩者有明顯差別。2周時(shí)兩組表達(dá)量無明顯差別（圖5）。

圖1 hUCMSCs形態(tài)觀察（40×）Fig.1Histological observation of hUCMSCs(40×)

圖2 hUCMSCs形態(tài)觀察（甲苯胺藍(lán)染色，40×）Fig.2Histological observation of hUCMSCs (toluidine blue staining,40×)

圖3 hUCMSCs免疫組化染色觀察（100×）Fig.3Immunohistochemical detection of hUCMSCs(100×)

圖4 RT-PCR檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)Sox9、CollagenⅠ、CollagenⅡ和蛋白多糖的基因表達(dá)Fig.4 The mRNA expression of Sox9,collagen I,collagen II and aggrecan at different time point detected by RT-PCR

圖5 Western blot檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)CollagenⅡ的表達(dá)Fig.5The expression of CollagenⅡat different time point detected by Western blot

3 討論

本研究中，我們通過梯度離心法成功從臍血中分離單核細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)類似成纖維細(xì)胞，通過免疫標(biāo)記證實(shí)為臍血干細(xì)胞。加入傳統(tǒng)誘導(dǎo)液后，細(xì)胞大量脫落，數(shù)量明顯減少，而Sox9轉(zhuǎn)染組細(xì)胞形態(tài)無明顯變化，細(xì)胞生長良好。

既往應(yīng)用基因技術(shù)誘導(dǎo)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的研究，主要聚焦于TGF-Β、BMPS等外用生長因子上，軟骨誘導(dǎo)液多含有TGF-Β、IGF等生長因子，往往導(dǎo)致軟骨細(xì)胞表型肥大，不利于軟骨細(xì)胞的誘導(dǎo)分化[6]；且由于生長因子位于細(xì)胞外，其濃度受環(huán)境影響，發(fā)揮的生物學(xué)效應(yīng)難以控制。Sox9是細(xì)胞內(nèi)的調(diào)控因子，本實(shí)驗(yàn)表明Sox9能誘導(dǎo)臍血干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化，同時(shí)抑制了Ⅰ型膠原的表達(dá)，進(jìn)一步表明Sox9具有抑制細(xì)胞肥大的作用。

Sox9屬于Sox家族[5]，主要在成軟骨祖細(xì)胞及軟骨細(xì)胞中表達(dá)。Akiyama等[7]報(bào)道，Sox9在小鼠肢芽間充質(zhì)細(xì)胞中失活，將阻斷其向軟骨細(xì)胞分化，最終導(dǎo)致四肢軟骨組織的缺乏。研究表明，Sox9可以與軟骨分化過程中重要基因的啟動(dòng)子結(jié)合并啟動(dòng)其轉(zhuǎn)錄。這些靶基因包括col9a1、col9a2、col9a3、col2a1、col11a、aggrecan1等[8]，它們的蛋白產(chǎn)物為各型膠原和蛋白聚糖，是軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成成分。這些胞外基質(zhì)蛋白不僅對(duì)維持軟骨組織的結(jié)構(gòu)很重要，而且也參與調(diào)控軟骨細(xì)胞分化[9]。研究表明，Sox9在干細(xì)胞體外分化為軟骨細(xì)胞過程中也扮演重要角色。Furumatsu等[10]在人間充質(zhì)干細(xì)胞中過表達(dá)Smad3后發(fā)現(xiàn)，該基因能通過激活Sox9轉(zhuǎn)錄活性顯著促進(jìn)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)方法誘導(dǎo)組隨誘導(dǎo)時(shí)間延長，Sox9表達(dá)逐漸增強(qiáng)，同時(shí)蛋白多糖、Ⅱ型膠原表達(dá)也逐漸增強(qiáng)，我們推測(cè)誘導(dǎo)液可能通過增強(qiáng)Sox9的表達(dá)促進(jìn)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞的分化。較傳統(tǒng)誘導(dǎo)組相比，Sox9轉(zhuǎn)染組1周時(shí)軟骨細(xì)胞特有的基因蛋白多糖、Ⅱ型膠原已明顯表達(dá)，而誘導(dǎo)液組2周時(shí)其表達(dá)量才逐漸增強(qiáng)。說明Sox9轉(zhuǎn)染后可明顯加快臍血干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞的誘導(dǎo)分化。

大多數(shù)體外誘導(dǎo)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)，采用“三維”培養(yǎng)模式，是為了更好地模擬體內(nèi)軟骨形成過程中細(xì)胞聚集的過程，但該方法的細(xì)胞團(tuán)中心由于營養(yǎng)、氧氣等不足，限制了細(xì)胞或組織的增殖。目前單層培養(yǎng)也有一定的局限性，比如原代軟骨細(xì)胞在單層培養(yǎng)條件下會(huì)失去軟骨細(xì)胞表型。但本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Sox9轉(zhuǎn)染的臍血干細(xì)胞在單層培養(yǎng)條件下顯示出較強(qiáng)的軟骨分化能力，說明Sox9基因?qū)δ氀杉?xì)胞軟骨分化有很強(qiáng)的調(diào)控作用。

綜上所述，臍血干細(xì)胞具有良好的軟骨分化潛能，較傳統(tǒng)誘導(dǎo)方法相比，Sox9誘導(dǎo)可明顯加快臍血干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化，而臍血干細(xì)胞可作為組織工程軟骨構(gòu)建的良好的種子細(xì)胞。

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Chondrogenic Differentiation of Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Induced by Sox9

ZHANG Jun1,ZHANG Yaoming2,WANG Zhenghui3,ZHANG Qing3,LUO Huanan3,ZHENG Guoxi3,HOU Jin3,WANG Botao3,YANG Yeye3,ZHAO Xiaoyan3,SHI Yanxia3.

1 Department of Otolaryngology,the Affiliated Hospital of Yan'an University,Yan'a 717100,China;
2 Department of Otolaryngology,the People's Hospital of Yan Chang County,Yan'an 717100,China;
3 Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery,The Second Hospital,Xi'an Jiaotong University,Xi'an 710004, China.Corresponding author:WANG Zhenghui(E-mail:ehui4298@163.com).

ObjectiveTo investigate the effect of Sox9 gene on inducing the chondrogenic differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells.MethodsHuman umbilical cord mesenchymal stem cells(hUCMSCs)were obtained by microdissection and digestion,and cultured in monolayer.The growth velocity and morphological changes of hUCMSCs were observed after Sox9 transfection.The expression of collagenⅡand aggrecan were detected by immunohistochemistry.The mRNA expression of collagenⅠ,collagenⅡand aggrecan were detected by RT-PCR,and collagenⅡcontent was detected by western blot.ResultsThe Sox9 gene had no significant effect on the morphology of hUCMSCs,and significantly accelerated the differentiation of hUCMSCs to chondrocytes compared with the traditional induction group.ConclusionSox9 gene can regulate the differentiation of hUCMSCs,and hUCMSCs can be used as seed cells for cartilage tissue engineering.

Umbilical cord mesenchymal stem cells;Differentiation;SRY-related high mobility group-box gene 9

Q813.1+1

A

1673－0364（2015）04－0221－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2015.04.001

2015年3月29日；

2015年5月5日）

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81000416）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（西安交通大學(xué)國際合作類）；西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院重點(diǎn)項(xiàng)目基金。

717100陜西省延安市延安大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻喉科二病區(qū)（張軍）；717100陜西省延安市延長縣人民醫(yī)院耳鼻喉科（張耀明）；710004陜西省西安市西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科（王正輝，張青，羅花南，鄭國璽，侯瑾，王波濤，楊葉葉，趙小燕，史艷霞）。

王正輝（E-mail：ehui4298@163.com）。