楊濤++韓磊++馮國(guó)強(qiáng)++宋培培++劉品華

摘要 研究小黑藥全株總黃酮的含量及提取分離，并用Schaal烘箱法、紫外光照法測(cè)試了小黑藥總黃酮和對(duì)照品BHT抗豬油氧化的能力，采用POV抑制率評(píng)價(jià)了抗氧化能力。測(cè)試了總黃酮和蘆丁的還原能力、抑制超氧陰離子自由基（O2-·）的能力、DPPH自由基的清除能力、羥基自由基的清除能力。結(jié)果表明：小黑藥總黃酮有良好的抗豬油氧化的作用，其抗光氧化的效果高于自動(dòng)氧化；還原能力、抑制超氧陰離子自由基（O2-·）的能力、DPPH自由基的清除能力略低于蘆丁，羥基自由基的清除能力高于蘆丁；小黑藥全株總黃酮含量為2.52%。

關(guān)鍵詞 小黑藥；總黃酮；抗氧化性；過(guò)氧化值

中圖分類號(hào) TS202.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2015）17-0311-03

Antioxidant Activity of Total Flavonoids from Sanicula astrantiifolia Wolff

YANG Tao HAN Lei FENG Guo-qiang SONG Pei-pei LIU Pin-hua*

（College of Chemistry and Chemical Engineering，Qujing Normal University，Qujing Yunnan 655011）

Abstract In this paper，the content and the optimum extraction of total flavonoid from Sanicula astrantiifolia Wolff were studied.The antioxidant activity of total flavonoids and the reference substance BHT were detected by Schaal Oven Method and UV photo-induced，and the antioxidant activity was estimated by inhibition ratio of POV.The reduction capacity of total flavonoids and Rutin，the inhibition ratio of total flavonoids to superoxide free radical（O2-·），its DPPH and hydroxyl free radicals-cavenging effect were determined.The results showed that：The total flavonoids from Sanicula astrantiifolia Wolff showed significant inhibitory effects on the oxidation of lard oil，its antioxidant effect was greater than automatic oxidation.The reduction capacity，the inhibition ratio to superoxide free radical（O2-·），its DPPH free radicals-cavenging effect were slightly lower than Rutin，and its hydroxyl free radicals-cavenging effect was greater than Rutin.The content of total flavonoid from Sanicula astrantiifolia Wolff was 2.52%.

Key words Sanicula astrantiifolia Wolff；total flavonoids；antioxidant activity；peroxide value

小黑藥（Sanicula astrantiifolia Wolff）具有補(bǔ)肺益腎、治療肺結(jié)核、腎虛腰痛、頭昏等功效[1]。云南民間常食用小黑藥，以提高免疫力和鎮(zhèn)痛、止咳等[2]?，F(xiàn)代食品工業(yè)中也通過(guò)小黑藥改善產(chǎn)品質(zhì)量，提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，在油脂及相關(guān)產(chǎn)業(yè)中得到積極應(yīng)用[3-5]。筆者研究了小黑藥中的總黃酮含量、抗豬油氧化效果及抗氧化性能，旨在探索小黑藥中的活性成分及功能，為深入開(kāi)發(fā)和利用小黑藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試材。小黑藥（曲靖農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購(gòu)買）；豬油（曲靖農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購(gòu)買新鮮豬肥膘，實(shí)驗(yàn)室火煉法提?。惶J?。ㄖ袊?guó)藥品生物制品檢定所）；Tris（北京西美杰科技有限公司）；1，1-二苯-2-苦基肼（日本和光純樂(lè)工業(yè)株式會(huì)社）；二丁基羥基甲苯（BHT）（鄭州超凡有限公司）；氯化亞鐵（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）；硫氰酸鉀（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）；鄰苯三酚（AR）；硫酸亞鐵（AR，廣東臺(tái)山化工廠）；水楊酸（AR，天津市化學(xué)試劑工廠）等。試劑均為分析純。

1.1.2 儀器。紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（TU-1810型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；XPA系列光化學(xué)反應(yīng)儀（南京胥江機(jī)電廠）；恒溫培養(yǎng)箱（29SN-DP-501，天津?qū)嶒?yàn)儀器廠）；電子天平（AL204-IC型，梅特勒-托利多儀器上海有限責(zé)任公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52AAA型，上海伊利儀器制造有限公司）；萬(wàn)能高速粉碎機(jī)（DFY-800C型，溫嶺市林大機(jī)器有限公司）；電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱（型號(hào)：DHG-9075A，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；離心機(jī)（低速離心機(jī)，常州國(guó)華電器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法endprint

1.2.1 小黑藥總黃酮的提取。小黑藥全株干粉用75%乙醇回流提取4次，每次提取時(shí)間為3 h，將回流提取液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓濃縮，用石油醚萃取濃縮液3次除去大量的葉綠素、蠟等物質(zhì)。下層進(jìn)一步濃縮制樣，用硅膠層析柱分離，先用石油醚∶乙酸乙酯=6∶4（v/v）洗脫除盡葉綠素，然后用75%乙醇洗脫黃酮，用減壓濃縮回收乙醇。濃縮液加入1%堿式醋酸鉛，使黃酮類物質(zhì)沉淀，用離心機(jī)分離沉淀，沉淀用無(wú)水乙醇分散后用10%硫酸調(diào)pH值為1～2，溫?zé)岱纸猓闉V得到清液，清液用飽和碳酸鈉溶液調(diào)pH值為6～7，再減壓濃縮后用聚酰胺柱層析法進(jìn)行分離，先用蒸餾水洗脫，再用無(wú)水乙醇洗脫，將無(wú)水乙醇洗脫物旋干后用無(wú)水乙醇溶解離心清液即為小黑藥待測(cè)總黃酮溶液。

1.2.2 最大波長(zhǎng)的確定。于10 mL容量瓶中加入質(zhì)量濃度為0.336 0 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液2.00 mL、5%亞硝酸鈉0.6 mL、無(wú)水乙醇3.0 mL，搖勻后放置6 min，然后加入10%硝酸鋁溶液0.6 mL，搖勻后放置6 min，再加入8.6%氫氧化鈉3.0 mL，并用50%乙醇定溶至刻度。在400.00～600.00 nm的范圍掃描，最大吸收處為508 nm。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。在10 mL容量瓶中，分別加入0.336 0 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（質(zhì)量濃度）0、0.30、0.60、0.90、1.20、1.50、1.80、2.10 mL，按1.2.2方法顯色，在508.00 nm處測(cè)定吸光度，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程如下：

y=0.008 2x+0.002 7，R2=0.999 4

1.2.4 小黑藥待測(cè)總黃酮含量的測(cè)定。小黑藥待測(cè)總黃酮溶液1.00 mL置10 mL容量瓶中用無(wú)水乙醇定容至刻度，在10 mL容量瓶中加入稀釋后的總黃酮溶液0.30 mL，按1.2.2方法顯色，并測(cè)定508 nm吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程得出樣液總黃酮含量相當(dāng)于蘆丁的含量為28.386 1 mg/mL?？紤]到試驗(yàn)與蘆丁的對(duì)比，把待測(cè)總黃酮溶液稀釋到濃度0.336 0 mg/mL得總黃酮測(cè)試液。

1.2.5 回收率試驗(yàn)。于10 mL容量瓶中加入小黑藥待測(cè)總黃酮溶液0.25 mL、0.336 0 mg/mL蘆丁溶液2.00 mL；于10 mL容量瓶中加入小黑藥待測(cè)總黃酮溶液0.25mL；取0.336 0 mg/mL蘆丁對(duì)照品溶液2.00 mL。3個(gè)處理均按1.2.2方法顯色，并在508 nm處測(cè)定吸光度，分別由回歸方程計(jì)算得黃酮含量為A、B、C。計(jì)算得到總黃酮回收率為96.24%。公式如下：

回收率（%）=■×100

1.2.6 小黑藥全株總黃酮含量的測(cè)定。準(zhǔn)確稱取小黑藥全株干粉2.000 9 g，用75%乙醇提取4次，每次提取時(shí)間為3 h，將回流提取液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮后制樣，用硅膠層析柱分離，先用石油醚∶乙酸乙酯=6∶4（v/v）洗脫除去葉綠素，然后用75%乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮制樣，再過(guò)聚酰胺柱，先用蒸餾水洗脫，再用無(wú)水乙醇洗脫，乙醇洗脫液減壓除去溶劑，用無(wú)水乙醇定容于25 mL容量瓶中，從中取0.30 mL溶液于10 mL容量瓶中，按1.2.2方法顯色，在508 nm處測(cè)吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算總黃酮。

1.2.7 過(guò)氧化值的測(cè)定。按照GB/T5009.37中方法配制鐵標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液和使用溶液等，然后用分光光度計(jì)按標(biāo)準(zhǔn)中的方法檢測(cè)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。油樣過(guò)氧化值檢測(cè)按照GB/T5009.37中比色法檢測(cè)?；貧w方程如下：

y=0.027 3x-0.011 3，R2=0.999 0

1.2.8 光照誘導(dǎo)氧化法。分別取3支50 mL比色管，加入50.000 0 g豬油。第一管加入0.010 0 g小黑藥總黃酮，第二管加入0.010 0 g二丁基羥基甲苯（BHT），第三管作為空白對(duì)照。放入光化學(xué)反應(yīng)儀，于室溫條件下用100 W紫外燈照射，每隔30 min分別取樣0.500 0 g于10 mL容量瓶中，按GB/T5009.37中比色法檢測(cè)，每組平行做3次。

1.2.9 烘箱誘導(dǎo)氧化法。分別取3支50 mL比色管，加入50.000 0 g豬油。第一管中加入0.010 0 g小黑藥總黃酮，第二管加入0.010 0 g二丁基羥基甲苯（BHT），第三管作為空白對(duì)照。將上述3支比色管置于60 ℃恒溫箱內(nèi)，每48 h分別取樣0.500 0 g于10 mL容量瓶，按GB/T5009.37中比色法檢測(cè)，每組平行做3次。

1.2.10 評(píng)價(jià)方法。按文獻(xiàn)[2，6]中相對(duì)防效值和Pb值的計(jì)算方法做適當(dāng)修改，按下列公式計(jì)算POV抑制率（%），POV抑制率越大說(shuō)明抗氧化效果越好。POV抑制率下降越小說(shuō)明抗氧化持續(xù)時(shí)間能力就越大。

抑制率（POV）（%）=■×100

1.2.11 還原能力的測(cè)定。分別取總黃酮測(cè)試液0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL，于25 mL的比色管中，并補(bǔ)充水至0.50 mL（即得質(zhì)量濃度為67.20、134.40、201.60、268.80、336.00 μg/mL總黃酮溶液），采用不加鐵氰化鉀的為對(duì)應(yīng)空白樣（共6份）。分別加入0.2 mol/L磷酸緩沖液（pH=6.6）2.50 mL和1%鐵氰化鉀2.50 mL混合均勻，于50 ℃水浴中反應(yīng)20 min后快速冷卻，加入10%三氯乙酸溶液2.50 mL，混合均勻（澄清無(wú)需離心）。取清液2.50 mL于試管中，加入蒸餾水2.50 mL，再加入0.1%三氯化鐵溶液0.50 mL，混合均勻，于室溫下靜置反應(yīng)10 min，1 cm石英比色皿在700 nm處測(cè)定吸光度值。質(zhì)量濃度為0.336 0 mg/mL的對(duì)照樣蘆丁其還原能力測(cè)定方法同上。

1.2.12 抑制O2-·試驗(yàn)。分別取總黃酮測(cè)試液0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mL，于25 mL比色管中，補(bǔ)充水至5 mL。各加入pH=8.2的Tris-HCl緩沖溶液4.70 mL、3 mmol/L鄰苯三酚溶液0.30 mL（試驗(yàn)樣液測(cè)試時(shí)濃度分別為3.36、6.72、10.08、13.44、16.80、20.16 μg/mL），用純水作空白，測(cè)試溫度13 ℃（測(cè)試液體溫度），用1 cm石英比色皿在320.00 nm波長(zhǎng)下測(cè)試，吸光值為Ax，以10 mmol/L鹽酸緩沖溶液0.30 mL代替鄰苯三酚溶液測(cè)定的吸光值為Axo。用純水代替試驗(yàn)樣液（加水5 mL）測(cè)得的吸光值為Ao，用純水代替試驗(yàn)樣液和鄰苯三酚（加水5.3 mL）測(cè)得的吸光值為Aox。質(zhì)量濃度為0.336 0 mg/mL的對(duì)照樣蘆丁，試驗(yàn)方法同上。試樣對(duì)超氧陰離子自由基的抑制率為：endprint

抑制率（%）=（1-■）×100

1.2.13 清除DPPH試驗(yàn)。于250 mL容量瓶中，加入稱取的DPPH 20 mg，并用無(wú)水乙醇溶解定容，配制成質(zhì)量濃度2×10-4 mol/L的DPPH溶液，于0～4 ℃下避光保存。分別取總黃酮測(cè)試液0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mL于25 mL比色管中，補(bǔ)充乙醇至2.00 mL，然后加入配制好的DPPH溶液2.00 mL混勻（試驗(yàn)樣液質(zhì)量濃度為8.40、16.80、25.20、33.60、42.00、50.40 μg/mL），于室溫暗處放置反應(yīng)30 min，在517 nm下測(cè)得的吸光值為A1，以2.00 mL乙醇代替樣液所測(cè)得的吸光值為A2，以2.00 mL乙醇代替DPPH溶液測(cè)得的吸光值為A3（空白）；質(zhì)量濃度為0.336 0 mg/mL的對(duì)照樣蘆丁，試驗(yàn)方法同上。試樣對(duì)DPPH的清除率為：

清除率（%）=（1-■）×100

1.2.14 清除·OH試驗(yàn)。分別取總黃酮測(cè)試液0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mL，于25 mL的容量瓶中，各加入6 mmol/L硫酸亞鐵2.00 mL、6 mmol/L過(guò)氧化氫2.00 mL，放置25 min后，用6 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液定容至25 mL（即樣液測(cè)試質(zhì)量濃度為1.34、2.69、4.03、5.38、6.72、8.06 μg/mL）。在36～37 ℃恒溫水浴中反應(yīng)15 min，1 cm石英比色皿于510 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)x，以乙醇代替試驗(yàn)樣液測(cè)得吸光度值為Ao（空白管乙醇），以乙醇代替水楊酸-乙醇組測(cè)得吸光度值A(chǔ)xo（空白管），以乙醇代替試驗(yàn)樣液、水楊酸-乙醇的為空白管。質(zhì)量濃度為0.336 0 mg/mL的對(duì)照樣蘆丁，方法同上。試樣對(duì)羥基自由基的清除率為：

清除率（%）=（1-■）×100

2 結(jié)果與分析

小黑藥全株總黃酮含量見(jiàn)表1。表2、表3說(shuō)明小黑藥總黃酮對(duì)油脂的光誘導(dǎo)氧化和自動(dòng)氧化都有抗氧化的效果。光誘導(dǎo)氧化、烘箱法誘導(dǎo)氧化的POV抑制率平均值分別為24.56、8.72%，說(shuō)明總黃酮對(duì)抗光引發(fā)油脂的抗氧化效果高于自動(dòng)氧化的效果。POV抑制率下降的趨勢(shì)說(shuō)明總黃酮抗油脂自動(dòng)氧化的持續(xù)能力優(yōu)于光引發(fā)氧化的能力。與抗氧化劑BHT的POV抑制率對(duì)比表明在同樣使用量的情況下總黃酮的效果不如BHT。但從食用安全性角度考慮總黃酮具有較大的優(yōu)勢(shì)，如果增加總黃酮的量也會(huì)有較好的抗油脂氧化的效果。

抗氧化劑是通過(guò)自身的還原作用給出電子而清除自由基，還原能力越強(qiáng)，抗氧化性越強(qiáng)[7]。通過(guò)測(cè)定還原能力可說(shuō)明抗氧化性的大小[8]。表4說(shuō)明小黑藥總黃酮表現(xiàn)出較好的還原能力，隨著試樣質(zhì)量濃度的增加，還原能力逐漸增強(qiáng)，但效果略低于蘆丁。

超氧陰離子自由基的形成最早，是氧進(jìn)行單電子的還原反應(yīng)首先生成的產(chǎn)物。由它可生成羥自由基（·OH）、過(guò)氧化氫、脂質(zhì)過(guò)氧化物（ROOH）及單線態(tài)氧等其他活性氧，引發(fā)人體許多疾病的生理變化[9]。表5數(shù)據(jù)說(shuō)明隨總黃酮和蘆丁質(zhì)量濃度增大抑制效果提高，在低濃度時(shí)總黃酮的效果略高于蘆丁，高濃度時(shí)略低于蘆丁，對(duì)O2-·抑制效果隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸下降，且趨勢(shì)基本一致。

N，N-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH）是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，在517 nm 波長(zhǎng)處有強(qiáng)吸收（深紫色）。當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，由于與其單電子數(shù)配對(duì)而使其吸收逐漸消失，其褪色程度與其所接受的電子成定量關(guān)系，所以可以較迅速地評(píng)價(jià)物質(zhì)的抗氧化能力[4]。由表6可知，小黑藥總黃酮和蘆丁對(duì)DPPH自由基的清除能力很強(qiáng)，總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除能力隨質(zhì)量濃度的增大逐漸提高，質(zhì)量濃度大于33.60 μg/mL后清除能力趨于穩(wěn)定，雖然蘆丁對(duì)DPPH自由基的清除能力略優(yōu)于總黃酮，但總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除能力隨質(zhì)量濃度的增大，其清除率增加值優(yōu)于蘆丁。

羥自由基是目前所知活性氧中對(duì)生物體毒性最強(qiáng)、危害最大的一種自由基，它可以通過(guò)電子轉(zhuǎn)移、加成以及脫氫等方式與生物體內(nèi)的多種分子作用，造成糖類、氨基酸、

蛋白質(zhì)、核酸和脂類等物質(zhì)的氧化性損傷，使細(xì)胞壞死或突變。由表7可知，總黃酮對(duì)羥基自由基的清除能力在試驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)優(yōu)于蘆丁，且清除率隨質(zhì)量濃度的提高清除能力趨勢(shì)與蘆丁基本一致。

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，小黑藥全株總黃酮含量為2.52%，抗豬油光氧化的效果高于自動(dòng)氧化的效果，對(duì)于油脂產(chǎn)品在貨架期的保質(zhì)是有利的。表現(xiàn)出較好的還原能力、抑制率超氧陰離子自由基能力、清除DPPH自由基和羥基自由基的能力，在食用和保健方面都有較好的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。

4 參考文獻(xiàn)

[1] 云南省衛(wèi)生局革命委員會(huì).云南中草藥[M].昆明：云南人民出版社，1971：98-99.

[2] 劉品華，楊光紅，田雪蓮，等.小黑藥抗油脂氧化及抑菌效果研究[J].食品工業(yè)科學(xué)，2011，32（10）：187-189.

[3] 嚴(yán)奉偉，秦霞，高夢(mèng)祥.菜籽多酚在豬油中的抗氧化作用[J].食品工業(yè)科技，2008（12）：94-97.

[4] 劉品華，金亞蓉，劉明研，等.臭參地上部分總黃酮含量及抗氧化活性的研究[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，27（5）：1894-1898.

[5] 陳莉華，左林艷，唐玉堅(jiān).微波輔助乙醇提取姜辣素及其對(duì)油脂的抗氧化性研究[J].食品科學(xué)，2011，32（4）：69-73.

[6] 劉明研，楊光紅，陳蘭昕，等.大蒜抗油脂氧化效果的研究[J].食品工業(yè)，2012，33（12）：121-124.

[7] 何玲玲，王新，劉彬，等.板栗多糖的分離純化及抗氧化活性研究[J].食品與機(jī)械，2010，26（2）：72-75.

[8] 曹煒，盧珂，陳衛(wèi)軍，等.不同種類蜂蜜抗氧化活性的研究[J].食品科學(xué)，2005，26（8）：352-356.

[9] 肖軍霞，黃國(guó)清，仇宏偉，等.紅樹(shù)莓花色苷的提取及抗氧化活性研究[J].食品科學(xué)，2011，32（8）：15-18.endprint