蘇鈺琴++蔣向軍++莫燕蘭++李翠蘭++盤飛蘭

摘要 以桂優(yōu)蔓性千斤拔種子苗為外誘導(dǎo)材料，采用秋水仙素進行多倍體離體誘導(dǎo)。結(jié)果表明，0.10%秋水仙素處理10 h，誘導(dǎo)率可達到20.0%，效果最好。四倍體植株相對粗壯，葉片大而厚實且皺，可作為四倍體的輔助篩選。

關(guān)鍵詞 千斤拔；種子苗；秋水仙素；四倍體；染色體檢測

中圖分類號 Q949.753.3；S567 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-5739（2015）17-0087-02

千斤拔為豆科千斤拔屬植物Moghania philippinens（Merr.et Rolfe）Li.的根，為《中華人民共和國藥典》（2005年版））附錄Ⅲ收載[1]。別名蔓千斤拔、吊馬樁、吊馬墩、一條根、老鼠尾、鉆地風(fēng)（四川）等，以根入藥。我國云南、四川、貴州、湖北、湖南、廣西、廣東、海南、江西、福建和臺灣各省區(qū)均有分布[2]。主治風(fēng)濕骨痛、腰肌勞損、慢性腎炎、跌打損傷、癰腫、偏癱、陽痿、婦女白帶多等癥，是婦科千金片、金雞沖劑、壯腰健腎丸等中成藥的主要原料藥[3-5]。已有的研究表明，千斤拔皂苷對修復(fù)神經(jīng)損傷、治療老年性癡呆、抗炎鎮(zhèn)痛、增強免疫、抗疲勞、抗缺氧有明顯作用，中國醫(yī)科院、中國藥科大學(xué)等都設(shè)置了專門的新藥研究課題，澳大利亞等國已進入藥理試驗階段?，F(xiàn)有常規(guī)二倍體千斤拔藥材的單株產(chǎn)量較低，根部纖維含量較高，不利于其中有效成分的提取。

通過倍數(shù)性育種手段使千斤拔基因組多倍化，可以獲得株型大、藥材產(chǎn)量高、出膏率高的品種。目前尚未發(fā)現(xiàn)有多倍體千斤拔及其培育方法的相關(guān)報道。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 外植體。桂優(yōu)蔓性千斤拔優(yōu)良品種所結(jié)實的飽滿種子。

1.1.2 培養(yǎng)基。種子萌發(fā)培養(yǎng)基為1/2MS+0.2%活性炭，增殖培養(yǎng)基為MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+糖3%+瓊脂5%，生根培養(yǎng)基1/2MS+NAA 0.5 mg/L+糖3%+瓊脂5%+0.2%活性炭，pH值均為5.8。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體的準備。選取桂優(yōu)蔓性千斤拔優(yōu)良植株所結(jié)實的飽滿種子，在超凈工作臺上先用75%酒精處理30 s，再用0.1%升汞處理5～8 min，最后用無菌水沖洗4～6次，用經(jīng)過滅菌的濾紙吸干外植體表面的水分，將種子轉(zhuǎn)接到MS+0.2%活性炭培養(yǎng)基中。

1.2.2 秋水仙素處理。采用過濾滅菌配制濃度分別為0.05%、0.10%、0.15%的秋水仙素溶液，將萌發(fā)的健壯種子苗進行暗培養(yǎng)7 d后，放到秋水仙素溶液中分別培養(yǎng)5、10、15 h后，以浸泡無菌水作為對照組，每個組合處理30株種苗。將苗用無菌水洗干凈，轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)40 d后開始萌發(fā)新芽，在超凈工作臺上將誘導(dǎo)后長出的新芽轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中。

1.2.3 氣孔鑒定。取同一生長時期的葉片，用解剖針在葉片的下表面取一小片白色薄膜，放在載玻片的水滴中，展平，蓋上蓋玻片，顯微鏡觀察。

1.2.4 染色體檢測。取目標(biāo)植株的根尖、莖尖0.5～2.0 cm，固定液（甲醇∶乙酸=3∶1）處理15 min以上，流動水沖洗15 min，解離液（濃鹽酸∶95%酒精=1∶1）處理2～10 min，流動水洗15 min以上，剪取0.1 mm分生組織用卡寶品紅染色后壓片，顯微鏡檢、拍照，觀察染色體數(shù)目。

2 結(jié)果與分析

2.1 多倍體誘導(dǎo)

從表1可以看出，隨著秋水仙素濃度的提高和處理時間的延長，處理材料受抑制程度大，當(dāng)秋水仙素溶液濃度為0.15%，處理時間為15 h時，處理材料僅有15%的存活率，多數(shù)處理材料由于受到秋水仙素的毒害作用，雖轉(zhuǎn)入了增殖培養(yǎng)基中，但慢慢褐化失去活力。

濃度過高或過低多倍體誘導(dǎo)率都有所降低。在高濃度下，處理時間越長，材料存活率越低，因此秋水仙素濃度和處理時間要合理的搭配才能提高誘導(dǎo)率。對照組未發(fā)現(xiàn)有多倍體植株，說明秋水仙素有效誘導(dǎo)了多倍體千斤拔的產(chǎn)生。由此得出：0.10%秋水仙素處理10 h，誘導(dǎo)率可達到20.0%，效果最好。

2.2 氣孔觀察

取同一生長時期的葉片，在相同放大倍數(shù)下觀察到四倍體千斤拔植株的氣孔明顯比二倍體植株的大（圖1）。

2.3 四倍體千斤拔形態(tài)學(xué)特征

四倍體千斤拔植株的外觀形態(tài)和二倍體有明顯差異（圖2），株型較大，生長旺盛，葉片大而厚實且皺，莖桿比較粗壯；而二倍體植株和葉片小而平整，且較薄，莖桿較細。

2.4 四倍體千斤拔染色體鑒定

采用壓片法對再生植株進行染色體檢測（圖3），結(jié)果表明，經(jīng)過秋水仙素誘導(dǎo)后的部分再生植株的染色體2n=4x=44，為四倍體；未經(jīng)任何處理的二倍體植株染色體數(shù)2n=2x=22。

3 結(jié)論與討論

染色體檢測比較費時，處理植株數(shù)量很大時，很難做到每個植株都檢測。因此，先通過外觀篩選出株型較大、葉片厚且皺、莖桿粗壯的為目標(biāo)植株，再對目標(biāo)植株進行染色檢測，最終篩選出四倍體植株。

秋水仙素有劇毒，在組織培養(yǎng)的過程中對外植體有毒害的作用，明顯地抑制不定芽的分化甚至導(dǎo)致外植體的死亡，這與鄭永強等[6]的結(jié)論相同。千斤拔植株對秋水仙素較敏感，經(jīng)過秋水仙素誘導(dǎo)的材料轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基上，極易發(fā)生褐化現(xiàn)象，最后慢慢枯死。后面可以進一步研究其他多倍體誘變劑對千斤拔誘導(dǎo)的效果，或是添加其他物質(zhì)能夠不影響秋水仙素誘導(dǎo)效果的前提下降低其多誘導(dǎo)材料的毒害作用。

4 參考文獻

[1] 國家藥典委員會.中國藥典[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2005.

[2] 許鴻源，梁瓊月，周鳳玨，等.蔓性千斤拔的快速繁育[J].種子，2010，29（2）：89-91.

[3] 饒偉文，黃建楷，溫志芳，等.千斤拔的品種調(diào)查與質(zhì)量研究[J].中草藥，1999，30（3）：219.

[4] 廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳.廣西中藥材標(biāo)準（1990年版）[S].南寧：廣西科學(xué)技術(shù)出版社，1992：297.

[5] 張麗霞，彭建明，馬潔.千斤拔研究進展[J].中藥材，2007，30（7）：887-890.

[6] 鄭永強，徐坤.秋水仙素在植物體細胞染色體加倍中的應(yīng)用研究進展[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2003，19（5）：89-91.endprint