曾 薇，古桂花，李建新，尹為華，袁勁松*

（北京大學(xué)深圳醫(yī)院，深圳518036）

檳榔是棕櫚科（Palmae）植物檳榔Areca catechu L.的干燥成熟種子，作為一種全世界廣泛使用的嗜好品，其消費(fèi)量?jī)H次于煙草、酒精和咖啡因。 嚼食檳榔能使人產(chǎn)生輕微的欣快感和興奮性，長(zhǎng)期嚼食還有一定的成癮性和毒性， 早在1988年KK Wary 就發(fā)現(xiàn)，體外實(shí)驗(yàn)中檳榔粗提物在100 μg/mL可提高小鼠腎細(xì)胞的分裂速率，250 μg/mL 時(shí)便可誘導(dǎo)腎細(xì)胞DNA 斷裂[1]。 另有文獻(xiàn)報(bào)道，長(zhǎng)期咀嚼檳榔的人比不咀嚼檳榔的人患慢性腎臟疾病的可能性更大[2]，他們的收縮壓、血清尿素氮、肌酐以及尿酸的水平顯著高于正常人[3-4]。 檳榔中的生物堿是主要毒性成分，其中含量最高的是檳榔堿。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)檳榔粗提物及檳榔堿存在肝毒性[5]，并發(fā)現(xiàn)其對(duì)腎功能也有一定的影響，本研究比較了不同濃度的檳榔堿對(duì)小鼠腎功能以及細(xì)胞損傷的影響。

1 材料

1.1 試驗(yàn)藥物

氫溴酸檳榔堿對(duì)照品采購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所，純度99.5%，批號(hào)：111684-200401，分別加生理鹽水配制成0.25、0.5、1.0 mg/mL 的低、中、高劑量組備用。

1.2 動(dòng)物

SPF 級(jí)昆明種小鼠，40 只， 雌雄各半， 體質(zhì)量23～25 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（動(dòng)物合格證編號(hào)：0094066）。 在溫度（22±2）℃，通風(fēng)良好的屏障級(jí)環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d。

1.3 試劑

Cr 測(cè)定試劑盒、BUN 測(cè)定試劑盒（美國(guó)BECKMAN COULTER 公司）。

1.4 儀器

BP211D 電子天平 （德國(guó)SARTORIUS 公司）；5810R 低溫離心機(jī)（德國(guó)EPPENDORF 公司）；AU5421全自動(dòng)生化分析儀 （美國(guó)BECKMAN COULTER 公司）；DM4000B 正立顯微鏡（德國(guó)LEICA 公司）。

2 方法

2.1 分組與給藥

將40 只小鼠隨機(jī)分為4 組，雌雄各半，每組10只。 A 為正常對(duì)照組，生理鹽水灌胃20 mL/(kg·d)；B、C、D 分別為檳榔堿低、中、高劑量組，給藥劑量分別為5、10、20 mg/(kg·d)。 每天稱體質(zhì)量，并根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整用藥劑量，連續(xù)給藥28 d。

2.2 腎臟血清功能指標(biāo)的測(cè)定

小鼠股動(dòng)脈取血約1 mL， 待血液自然凝固后2 000 r/min 離心5 min 分離得血清， 使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組血清中血尿素氮（BUN）、血肌酐（Cr）以及尿素氮/肌酐比值（BUN/Cr）含量的變化。

2.3 腎臟形態(tài)及重量系數(shù)的比較

乙醚麻醉小鼠，解剖取其腎臟，觀察腎臟大小、質(zhì)量、外型、硬度的變化，記錄單側(cè)腎臟質(zhì)量，計(jì)算單側(cè)腎臟質(zhì)量系數(shù)：

腎臟質(zhì)量系數(shù)=單側(cè)腎濕質(zhì)量/體質(zhì)量×100%

2.4 腎臟病理組織學(xué)觀察

解剖小鼠摘取腎臟， 取同側(cè)腎臟相同部位，以10%中性福爾馬林固定液固定， 常規(guī)石蠟包埋，切片， 片厚約4 μm，HE 染色， 制作腎臟病理組織切片，光鏡下作腎臟組織病理學(xué)觀察。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有計(jì)量資料以“±s”表示，單因素方差分析，組間進(jìn)行兩兩比較。

3 結(jié)果

3.1 每周給藥劑量與體質(zhì)量的變化

記錄每天給藥之前的體質(zhì)量，平均選取每周的第1 天進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見表1。 發(fā)現(xiàn)在任一時(shí)間段內(nèi)給藥組與正常組比較，體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 給藥過程中各組小鼠的體質(zhì)量變化比較 （±s，n=10，g）

表1 給藥過程中各組小鼠的體質(zhì)量變化比較 （±s，n=10，g）

組 別正常對(duì)照組檳榔堿低劑量組檳榔堿中劑量組檳榔堿高劑量組給藥劑量（mg/kg）— 5 1 0 20 1 d 24.03±1.37 23.90±1.48 24.21±1.91 24.55±1.29 8 d 26.54±2.90 26.63±2.55 27.65±2.91 27.04±3.36a 15 d 28.61±4.39 29.00±3.27 30.50±4.82 28.52±3.87 22 d 29.25±3.54 32.86±3.18 32.55±5.55 32.23±4.65 29 d 31.27±3.86 33.57±4.26 33.06±3.11 33.08±4.87

3.2 血清腎功能生化指標(biāo)的變化

與正常對(duì)照組比較， 實(shí)驗(yàn)組的Cr、BUN 均有顯著性升高（P＜0.01），升高程度呈現(xiàn)劑量依賴性，說明檳榔堿會(huì)對(duì)小鼠的腎功能產(chǎn)生影響。BUN/Cr 比值在檳榔堿高劑量組中有顯著升高，說明高劑量的檳榔堿有可能對(duì)腎臟產(chǎn)生不利影響。 結(jié)果見表2。

表2 不同劑量的檳榔堿對(duì)小鼠腎功能生化指標(biāo)的影響（±s，n=10）

表2 不同劑量的檳榔堿對(duì)小鼠腎功能生化指標(biāo)的影響（±s，n=10）

注：與正常對(duì)照組比較**P＜0.01。

組 別正常對(duì)照組檳榔堿（低）檳榔堿（中）檳榔堿（高）Cr(μmol/L)25.9±0.67 28.4±1.04**30.58±1.30**31.93±1.16**給藥劑量（mg/kg）— 5 1 0 20 BUN(mmol/L)6.77±0.20 7.80±0.35**8.29±0.30**9.34±0.32**BUN/Cr 0.26±0.01 0.28±0.02 0.28±0.02 0.29±0.02**

3.3 腎臟形態(tài)及質(zhì)量系數(shù)的變化

將腎臟取出后肉眼觀察，正常對(duì)照組與給藥組的腎臟肉眼觀察沒有明顯的差異。 對(duì)腎臟系數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行組內(nèi)及組間差異顯著性分析， 結(jié)果P＞0.05，說明在此實(shí)驗(yàn)條件下，檳榔堿對(duì)小鼠腎臟的相對(duì)質(zhì)量影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果見表3。

表3 不同劑量的檳榔堿對(duì)小鼠腎臟系數(shù)的影響（±s，n=10）

表3 不同劑量的檳榔堿對(duì)小鼠腎臟系數(shù)的影響（±s，n=10）

給藥劑量（mg/kg）— 5 1 0 20體質(zhì)量（g）31.27±3.86 33.57±4.26 33.06±3.11 33.08±4.87左腎重（g）0.196±0.015 0.210±0.032 0.208±0.025 0.196±0.035腎臟系數(shù)（%）0.630±0.046 0.620±0.025 0.630±0.035 0.590±0.027組 別正常對(duì)照組檳榔堿（低）檳榔堿（中）檳榔堿（高）

3.4 腎臟病理組織學(xué)變化

光鏡下正常小鼠腎臟的腎小球、 近曲小管、遠(yuǎn)曲小管、出球微動(dòng)脈及入球小動(dòng)脈結(jié)構(gòu)清晰，髓質(zhì)內(nèi)集合小管排列規(guī)則。 檳榔堿低劑量組小鼠腎小球旁可見局部血管擴(kuò)張， 充血伴有出血及血栓形成，部分腎小球呈退變萎縮性改變，腎髓質(zhì)內(nèi)集合管間可見較多小血管擴(kuò)張充血伴有少量小淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。 檳榔堿中劑量組小鼠腎臟在局部可見少量腎小球呈退變萎縮性改變， 部分腎小球旁可見擴(kuò)張、充血的小血管，腎髓質(zhì)內(nèi)集合管間可見部分小血管呈充血改變，可見少量散在的小淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。 檳榔堿高劑量組小鼠腎臟部分區(qū)域可見退變萎縮的腎小球，局部腎小球旁可見有出血，周邊腎小管結(jié)構(gòu)破壞；腎皮質(zhì)內(nèi)局部出血，腎小管結(jié)構(gòu)破壞，可見脫落散在的腎小管上皮； 腎髓質(zhì)內(nèi)集合管間可見出血，出血區(qū)可見有少量炎細(xì)胞（見封三彩圖圖1）。

4 討論

本研究從生化檢驗(yàn)學(xué)和組織病理形態(tài)學(xué)兩個(gè)角度探討了不同劑量檳榔堿對(duì)小鼠腎臟毒性的影響。 結(jié)果表明，與正常對(duì)照組相比，檳榔堿各劑量組小鼠血清Cr 和BUN 水平均有顯著升高。Cr 和BUN是反映腎損傷的指標(biāo)，當(dāng)兩者升高時(shí)，其與腎損傷程度呈正相關(guān)。血清Cr 的濃度變化主要由腎小球?yàn)V過率決定，濾過能力下降，則Cr 濃度升高，其高出正常值提示腎臟受損，因此血清Cr 能較準(zhǔn)確地反映腎實(shí)質(zhì)受損的情況。BUN 是蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)生的氨在肝臟經(jīng)鳥氨酸循環(huán)生成的終產(chǎn)物， 經(jīng)腎小球?yàn)V過，大部分隨尿排出，小部分被腎小管重吸收入血，由于腎臟代償功能強(qiáng)，60%～70%腎單位功能受損時(shí)，BUN 才高于正常。 另外BUN/Cr 比值升高也在一定程度上反映了腎小球?yàn)V過功能的損害程度。

暴露于檳榔堿的小鼠腎臟的質(zhì)量系數(shù)沒有顯著性差異，可能是由于給藥時(shí)間不夠長(zhǎng)，而檳榔對(duì)腎臟的損傷是一個(gè)慢性過程的結(jié)果。 而腎臟組織病理學(xué)結(jié)果提示， 檳榔堿對(duì)灌胃28 d 的小鼠腎臟存在一定的損害作用，說明咀嚼檳榔引起慢性腎臟疾病是一個(gè)漫長(zhǎng)的過程，這也與文獻(xiàn)報(bào)道[1]相符，現(xiàn)階段的文獻(xiàn)對(duì)檳榔腎臟毒性的研究多屬于對(duì)長(zhǎng)年咀嚼檳榔人群的流行病學(xué)研究。Hsu YH 等[6]回顧性考察了27 482 名志愿者連續(xù)7年的檳榔咀嚼史，對(duì)咀嚼檳榔與發(fā)生慢性腎臟病的關(guān)系做了多元線性回歸分析，認(rèn)為二者存在相關(guān)性。 事實(shí)上，成人如果平均每天咀嚼50 顆檳榔， 那么引起機(jī)體代謝性堿中毒， 由腎臟消耗鉀引起低鉀血癥并導(dǎo)致腎機(jī)能不全的可能性更大[6]。 另外咀嚼檳榔比不咀嚼檳榔的人群患高蛋白尿的幾率更高， 這可能與檳榔堿具有中樞擬交感作用，具有使心率加快、頸總動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈血流量增加的作用， 從而導(dǎo)致高蛋白尿有關(guān)[7]。 因此本實(shí)驗(yàn)也是基于大量流行病學(xué)資料的基礎(chǔ)研究。

此外，課題組前期還做了檳榔粗提物及檳榔堿對(duì)小鼠的肝毒性研究，結(jié)果顯示檳榔堿會(huì)導(dǎo)致血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶及堿性磷酸酶升高，并對(duì)小鼠的肝細(xì)胞有促凋亡作用[5]。 據(jù)文獻(xiàn)記載，氫溴酸檳榔堿對(duì)小鼠5 mg/kg 腹腔給藥14 d 即可破壞肝細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)， 并抑制脾臟單核細(xì)胞的有絲分裂，20 mg/kg 便有明顯的促細(xì)胞凋亡現(xiàn)象[8]。 中醫(yī)認(rèn)為肝腎同源，其生理病理密切相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)是基于檳榔對(duì)小鼠肝毒性的后續(xù)研究，結(jié)果表明檳榔能造成小鼠腎臟毒性，但較肝臟毒性輕微，這對(duì)于臨床上治療具有咀嚼檳榔飲食習(xí)慣的腎性疾病患者具有一定的指導(dǎo)作用， 但其致毒機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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