楊拉維 王亞紅 楊 騰 陳 婷 何惠娟 劉 剛

楊拉維 王亞紅 楊 騰 陳 婷 何惠娟 劉 剛:廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院 廣東湛江 524001

近年來，肺癌的死亡率日益升高，調查發(fā)現肺癌已經取代肝癌成為國際上惡性腫瘤死亡的第一大原因［1］。研究表明，大氣污染物是肺癌的主要危險因素［2］，其中大氣顆粒物是我國城市空氣中的主要污染物之一。直徑小于或等于2.5 μm 的細顆粒物(PM2.5)在大氣顆粒物中占相當大的比重，約為70%，是空氣中對人體健康危害最大的一類，隨著工業(yè)的發(fā)展和機動車的增加，大氣中顆粒物污染越來越嚴重，如果長期吸入顆粒物污染的空氣，必將嚴重危害人類健康［3－4］。

細胞自身代謝和外源性的刺激都產生活性氧(ROS)，ROS可損害各種細胞成分，包括蛋白質、脂質和核酸，大量的研究表明ROS 能引起DNA 氧化損傷［5－6］，DNA 氧化損傷和癌癥的發(fā)生是密切相關的。

細胞內8－羥基鳥嘌呤(8 －oxoG)是氧化損傷的產物之一，具有高的致突變性，8 －oxoG 與許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。細胞內特異識別并切除8 －oxoG 的酶稱為8 －羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶，簡稱OGG1［7－8］。OGG1 基因位于人染色體3P25 區(qū)域，屬于管家基因［9］。OGG1 基因編碼產物OGG1 蛋白是一個帶有AP 裂解酶活性的雙功能DNA 糖苷酶。研究結果表明OGG1 的活性與腫瘤的發(fā)生密切相關［10－11］。

本實驗室前期研究了不同城市PM2.5 的成分和細胞炎癥的關系［12］，發(fā)現不同成分的PM2. 5 能誘導DNA 損傷，研究了OGG1 和肺癌的關系［13］，發(fā)現OGG1 和肺癌有顯著的相關性，因此，我們研究OGG1 對PM2.5 造成人肺上皮細胞DNA 損傷的保護作用，并探討可能的保護機制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

(QJS －120F 智能中流量多級顆粒采樣器(錦州利誠)，QJS－100 中流量多級顆粒切割器(錦州利誠)，CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司)，酶標儀(Thermo)，FACSCalibur 流式細胞儀(BD 公司)，共聚焦顯微鏡(Leica，Bensheim，Germany)，Beas － 2b 細胞，DMEM 高糖(Hyclone)，胎牛血清(杭州四季青)，脂質體2000 轉染試劑盒(Jnvitrogen，USA)，MTT(Sigma)，DCFH(Sigma)，彗星實驗檢測試劑盒CometAssay?Kit (Trevigen，USA).

1.2 PM2.5 的采集和制備

采集PM2.5 使用QJS－120F 中流量多級顆粒采樣器，配置QJS－100 中流量多級顆粒物切割器，采樣地點廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學研究中心六樓，采樣流量100 L/min，連續(xù)采集72 h。將載有PM2.5 顆粒樣品的纖維濾膜放入超純水中，超聲振蕩15 min 以洗脫顆粒物，然后將樣品真空冷凍干燥24 h，稱重，加入一定量PBS 配制成儲備液，高壓滅菌，4 ℃保存，臨用前震蕩混勻。

1.3 細胞轉染及染毒

人肺上皮細胞(beas－2b)用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，細胞融合80% 時用0.25%胰蛋白酶消化傳代或用于實驗。將前期研究已構建的OGG1 過表達載體按照Lipofectamine 2000 說明書操作，轉染進beas－2b，并通過Western blot 檢測beas－2b 內OGG1 表達水平。將正常beas－2b 細胞和轉染了OGG1 過表達載體細胞分別正常培養(yǎng)到細胞融合80% 時，分別加入終濃度為100 μg/ml 的PM2.5，染毒24 h。

1.4 細胞內活性氧水平

分別收集染毒后的細胞，0.25%胰酶消化離心收集細胞，用PBS 漂洗兩次，加入終濃度為5 μmol/L 的DCFH －DA 染色液，37 ℃作用30 min，PBS 漂洗兩次，流式細胞儀測定細胞內二氯熒光素的平均熒光強度，檢測轉染OGG1 對細胞內活性氧水平的影響。

1.5 細胞DNA 損傷的檢測

分別收集染毒后的細胞，用冰冷PBS 重懸細胞到1 ×105/ml，按1∶10(體積比)將細胞(1×105/ml)和融化的低熔點瓊脂糖LMA(37 ℃)混合，并取50 μl 加到玻片孔，將玻片放入4 ℃冰箱避光10 min 使LMA 凝固，將玻片浸泡在裂解液中，置于冰上或4 ℃裂解30 ～60 min。甩干玻片多余的裂解液，將玻片浸入新制的解旋液中避光解旋20 ～60 min。加950 ml 預冷的電泳液，將玻片放入玻片孔處，21 V，電泳30 min。將玻片取出置于水中5 min，兩次，然后置于70%酒精中5 min，低于45 ℃下干燥10 ～15 min，加入100 μl 稀釋好的SYBR Green 到凝膠孔里，置于冰箱5 min，在室溫避光干燥玻片，最后用熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡觀察。

1.6 統(tǒng)計分析

采用SPSS15.0 軟件進行分析，所有實驗均重復至少3 次。結果表示為(±SD)。

2 結果

2.1 OGG1 抑制PM2.5 誘導的細胞內活性氧水平升高

免疫印跡的實驗結果表明OGG1 過表達載體成功轉染進了beas－2b 細胞，并且編碼OGG1 蛋白的產生，使轉染組細胞的OGG1 蛋白水平明顯高于未轉染組。流式細胞儀的檢測結果表明PM2.5 能誘導細胞內ROS 的水平升高，并且OGG1 能夠顯著的抑制PM2.5 導致的細胞ROS 升高(p＜0.01)(見圖1)。這種對ROS 的抑制能力可能和OGG1 對8－oxoG 切除能力相關。

2.2 OGG1 抑制PM2.5 誘導的DNA 損傷

單細胞凝膠電泳的實驗結果表明PM2.5 能夠導致beas－2b細胞DNA 的損傷，損傷可能是由于PM2.5 誘導產生的細胞內高濃度的ROS 所導致的，對比對照組，OGG1 過表達能夠顯著的抑制PM2.5 導致的DNA 損傷(p＜0.01)(見圖2)。OGG1 對DNA損傷的保護可能是同其抑制細胞內ROS 作用相關。

圖1 免疫印跡檢測OGG1 的過表達及OGG1 對beas－2b 細胞ROS 的影響

圖2 彗星實驗檢測OGG1 對PM2.5 造成beas－2b 細胞DNA 損傷的修復作用

3 討論

近些年來，隨著工業(yè)的發(fā)展和機動車的增加，空氣污染越來越嚴重。作為空氣質量最重要的指標，PM2.5 指數已經在全國各大城市實行了實時監(jiān)測。國內最近統(tǒng)計研究表明，惡性腫瘤中肺癌的死亡病例數排第一位［14］，越來越多的研究表明，PM2.5與哮喘、肺癌等一系列的肺部疾病的產生存在相關性。本實驗研究表明，PM2.5 能夠誘導細胞內活性氧的產生，能夠導致細胞DNA 的損傷，這與之前的研究報道一致［15－16］。不同來源的PM2.5 的成分已經被研究得非常清楚，主要是多環(huán)芳烴(PAHs)和過渡金屬元素［17］，隨著對PM2.5 研究的深入，如何保護機體、減少PM2.5 對機體造成的損傷顯得非常重要。

OGG1 是非常重要的堿基切除修復酶之一，在清除8 － oxoG，保護細胞功能方面發(fā)揮重要的作用。研究表明細胞核中的OGG1 的表達和蛋白活性都高于線粒體，線粒體中的氧化損傷和突變積累比細胞核更快。

致癌物苯并芘Bap 是多環(huán)芳烴的重要成分之一，有研究表明Bap 能夠降低OGG1 的活性，誘導肺癌的產生［18］，也有研究表重金屬導致的基因突變與OGG1 的活性降低有關［19］，因此PM2.5的致癌很可能與PM2.5 降低OGG1 的活性相關。

本研究表明，OGG1 的過表達對PM2.5 造成的DNA 損傷有明顯的修復和減輕作用，但對于該修復和保護作用的具體分子機制還沒有研究清楚，可能是和清除細胞內的ROS、保護線粒體的功能相關，PM2.5 是如何對線粒體造成的損傷以及OGG1 保護線粒體功能的分子機制需要后續(xù)試驗進行驗證。而基于OGG1 對PM2.5 造成的DNA 損傷有明顯的修復和減輕作用，OGG1 可能成為PM2.5 導致的肺部疾病的一個治療靶點。

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