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        OGG1 對PM2.5 造成人肺上皮細胞DNA 損傷的修復作用

        2015-11-27 07:07:02楊拉維王亞紅何惠娟
        現代醫(yī)院 2015年8期
        關鍵詞:顆粒物肺癌檢測

        楊拉維 王亞紅 楊 騰 陳 婷 何惠娟 劉 剛

        楊拉維 王亞紅 楊 騰 陳 婷 何惠娟 劉 剛:廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院 廣東湛江 524001

        近年來,肺癌的死亡率日益升高,調查發(fā)現肺癌已經取代肝癌成為國際上惡性腫瘤死亡的第一大原因[1]。研究表明,大氣污染物是肺癌的主要危險因素[2],其中大氣顆粒物是我國城市空氣中的主要污染物之一。直徑小于或等于2.5 μm 的細顆粒物(PM2.5)在大氣顆粒物中占相當大的比重,約為70%,是空氣中對人體健康危害最大的一類,隨著工業(yè)的發(fā)展和機動車的增加,大氣中顆粒物污染越來越嚴重,如果長期吸入顆粒物污染的空氣,必將嚴重危害人類健康[3-4]。

        細胞自身代謝和外源性的刺激都產生活性氧(ROS),ROS可損害各種細胞成分,包括蛋白質、脂質和核酸,大量的研究表明ROS 能引起DNA 氧化損傷[5-6],DNA 氧化損傷和癌癥的發(fā)生是密切相關的。

        細胞內8-羥基鳥嘌呤(8 -oxoG)是氧化損傷的產物之一,具有高的致突變性,8 -oxoG 與許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。細胞內特異識別并切除8 -oxoG 的酶稱為8 -羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶,簡稱OGG1[7-8]。OGG1 基因位于人染色體3P25 區(qū)域,屬于管家基因[9]。OGG1 基因編碼產物OGG1 蛋白是一個帶有AP 裂解酶活性的雙功能DNA 糖苷酶。研究結果表明OGG1 的活性與腫瘤的發(fā)生密切相關[10-11]。

        本實驗室前期研究了不同城市PM2.5 的成分和細胞炎癥的關系[12],發(fā)現不同成分的PM2. 5 能誘導DNA 損傷,研究了OGG1 和肺癌的關系[13],發(fā)現OGG1 和肺癌有顯著的相關性,因此,我們研究OGG1 對PM2.5 造成人肺上皮細胞DNA 損傷的保護作用,并探討可能的保護機制。

        1 材料與方法

        1.1 主要儀器與試劑

        (QJS -120F 智能中流量多級顆粒采樣器(錦州利誠),QJS-100 中流量多級顆粒切割器(錦州利誠),CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司),酶標儀(Thermo),FACSCalibur 流式細胞儀(BD 公司),共聚焦顯微鏡(Leica,Bensheim,Germany),Beas - 2b 細胞,DMEM 高糖(Hyclone),胎牛血清(杭州四季青),脂質體2000 轉染試劑盒(Jnvitrogen,USA),MTT(Sigma),DCFH(Sigma),彗星實驗檢測試劑盒CometAssay?Kit (Trevigen,USA).

        1.2 PM2.5 的采集和制備

        采集PM2.5 使用QJS-120F 中流量多級顆粒采樣器,配置QJS-100 中流量多級顆粒物切割器,采樣地點廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學研究中心六樓,采樣流量100 L/min,連續(xù)采集72 h。將載有PM2.5 顆粒樣品的纖維濾膜放入超純水中,超聲振蕩15 min 以洗脫顆粒物,然后將樣品真空冷凍干燥24 h,稱重,加入一定量PBS 配制成儲備液,高壓滅菌,4 ℃保存,臨用前震蕩混勻。

        1.3 細胞轉染及染毒

        人肺上皮細胞(beas-2b)用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)液,于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng),細胞融合80% 時用0.25%胰蛋白酶消化傳代或用于實驗。將前期研究已構建的OGG1 過表達載體按照Lipofectamine 2000 說明書操作,轉染進beas-2b,并通過Western blot 檢測beas-2b 內OGG1 表達水平。將正常beas-2b 細胞和轉染了OGG1 過表達載體細胞分別正常培養(yǎng)到細胞融合80% 時,分別加入終濃度為100 μg/ml 的PM2.5,染毒24 h。

        1.4 細胞內活性氧水平

        分別收集染毒后的細胞,0.25%胰酶消化離心收集細胞,用PBS 漂洗兩次,加入終濃度為5 μmol/L 的DCFH -DA 染色液,37 ℃作用30 min,PBS 漂洗兩次,流式細胞儀測定細胞內二氯熒光素的平均熒光強度,檢測轉染OGG1 對細胞內活性氧水平的影響。

        1.5 細胞DNA 損傷的檢測

        分別收集染毒后的細胞,用冰冷PBS 重懸細胞到1 ×105/ml,按1∶10(體積比)將細胞(1×105/ml)和融化的低熔點瓊脂糖LMA(37 ℃)混合,并取50 μl 加到玻片孔,將玻片放入4 ℃冰箱避光10 min 使LMA 凝固,將玻片浸泡在裂解液中,置于冰上或4 ℃裂解30 ~60 min。甩干玻片多余的裂解液,將玻片浸入新制的解旋液中避光解旋20 ~60 min。加950 ml 預冷的電泳液,將玻片放入玻片孔處,21 V,電泳30 min。將玻片取出置于水中5 min,兩次,然后置于70%酒精中5 min,低于45 ℃下干燥10 ~15 min,加入100 μl 稀釋好的SYBR Green 到凝膠孔里,置于冰箱5 min,在室溫避光干燥玻片,最后用熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡觀察。

        1.6 統(tǒng)計分析

        采用SPSS15.0 軟件進行分析,所有實驗均重復至少3 次。結果表示為(±SD)。

        2 結果

        2.1 OGG1 抑制PM2.5 誘導的細胞內活性氧水平升高

        免疫印跡的實驗結果表明OGG1 過表達載體成功轉染進了beas-2b 細胞,并且編碼OGG1 蛋白的產生,使轉染組細胞的OGG1 蛋白水平明顯高于未轉染組。流式細胞儀的檢測結果表明PM2.5 能誘導細胞內ROS 的水平升高,并且OGG1 能夠顯著的抑制PM2.5 導致的細胞ROS 升高(p<0.01)(見圖1)。這種對ROS 的抑制能力可能和OGG1 對8-oxoG 切除能力相關。

        2.2 OGG1 抑制PM2.5 誘導的DNA 損傷

        單細胞凝膠電泳的實驗結果表明PM2.5 能夠導致beas-2b細胞DNA 的損傷,損傷可能是由于PM2.5 誘導產生的細胞內高濃度的ROS 所導致的,對比對照組,OGG1 過表達能夠顯著的抑制PM2.5 導致的DNA 損傷(p<0.01)(見圖2)。OGG1 對DNA損傷的保護可能是同其抑制細胞內ROS 作用相關。

        圖1 免疫印跡檢測OGG1 的過表達及OGG1 對beas-2b 細胞ROS 的影響

        圖2 彗星實驗檢測OGG1 對PM2.5 造成beas-2b 細胞DNA 損傷的修復作用

        3 討論

        近些年來,隨著工業(yè)的發(fā)展和機動車的增加,空氣污染越來越嚴重。作為空氣質量最重要的指標,PM2.5 指數已經在全國各大城市實行了實時監(jiān)測。國內最近統(tǒng)計研究表明,惡性腫瘤中肺癌的死亡病例數排第一位[14],越來越多的研究表明,PM2.5與哮喘、肺癌等一系列的肺部疾病的產生存在相關性。本實驗研究表明,PM2.5 能夠誘導細胞內活性氧的產生,能夠導致細胞DNA 的損傷,這與之前的研究報道一致[15-16]。不同來源的PM2.5 的成分已經被研究得非常清楚,主要是多環(huán)芳烴(PAHs)和過渡金屬元素[17],隨著對PM2.5 研究的深入,如何保護機體、減少PM2.5 對機體造成的損傷顯得非常重要。

        OGG1 是非常重要的堿基切除修復酶之一,在清除8 - oxoG,保護細胞功能方面發(fā)揮重要的作用。研究表明細胞核中的OGG1 的表達和蛋白活性都高于線粒體,線粒體中的氧化損傷和突變積累比細胞核更快。

        致癌物苯并芘Bap 是多環(huán)芳烴的重要成分之一,有研究表明Bap 能夠降低OGG1 的活性,誘導肺癌的產生[18],也有研究表重金屬導致的基因突變與OGG1 的活性降低有關[19],因此PM2.5的致癌很可能與PM2.5 降低OGG1 的活性相關。

        本研究表明,OGG1 的過表達對PM2.5 造成的DNA 損傷有明顯的修復和減輕作用,但對于該修復和保護作用的具體分子機制還沒有研究清楚,可能是和清除細胞內的ROS、保護線粒體的功能相關,PM2.5 是如何對線粒體造成的損傷以及OGG1 保護線粒體功能的分子機制需要后續(xù)試驗進行驗證。而基于OGG1 對PM2.5 造成的DNA 損傷有明顯的修復和減輕作用,OGG1 可能成為PM2.5 導致的肺部疾病的一個治療靶點。

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