王 康,李 韻,肖少紅

湖北省煙草產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站,武漢市硚口區(qū)寶豐路6號(hào) 430030

HPLC-FLD柱前衍生法同時(shí)測(cè)定煙草中黃曲霉毒素 B1、B2、G1和 G2

王 康,李 韻,肖少紅

湖北省煙草產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站,武漢市硚口區(qū)寶豐路6號(hào) 430030

通過溶劑萃取、免疫親和柱純化富集、三氟乙酸柱前衍生、高效液相色譜(HPLC)法分離及熒光檢測(cè)器檢測(cè),建立了同時(shí)測(cè)定煙草及煙草制品中黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2的免疫親和檢測(cè)方法.結(jié)果表明:①該方法可在20 min內(nèi)完成測(cè)定,4種目標(biāo)物能夠得到很好的分離,線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)r值均大于0.99.②方法的回收率為85%～117%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.2%～9.4%(n=6),其中B1的檢出限和定量限分別為0.10和0.34 μg/kg.

煙草;黃曲酶毒素;柱前衍生;高效液相色譜法(HPLC)

黃曲霉毒素(Aflatoxin,簡(jiǎn)稱AFT)是20世紀(jì)60年代初發(fā)現(xiàn)的一類劇毒的真菌代謝產(chǎn)物,主要由黃曲霉菌(Aspergillus flavus)和寄生曲霉菌(Aspergillus parasiticus)等侵染農(nóng)產(chǎn)品后產(chǎn)生[1],是目前已知最強(qiáng)的致癌物之一.1993年,AFT被世界衛(wèi)生組織癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為一級(jí)致癌物[2].目前發(fā)現(xiàn)的 AFT 有十幾種,其中B1、B2、G1和G2較為常見,黃曲霉毒素B1(簡(jiǎn)稱AFB1,其余類推)的毒性最強(qiáng).黃曲霉毒素廣泛地存在于霉變的大米、花生、玉米、棉籽等農(nóng)產(chǎn)品中,是食品安全和食品國際貿(mào)易的巨大威脅[3-4].煙葉在貯藏過程中,也面臨著霉變的威脅.

AFT的檢測(cè)方法主要有薄層層析法[5]、高效液相色譜-熒光檢測(cè)法(High performance liquid chromatography-fluorescencedetection,HPLC-FLD)[6-7]和酶聯(lián)免疫法[8]等.薄層層析法過程復(fù)雜且靈敏度差,酶聯(lián)免疫法存在假陽性和培育合適的抗原抗體困難的問題.HPLC-FLD法測(cè)定準(zhǔn)確、分辨率高,可同時(shí)定性、定量測(cè)定多種AFT成分[9-10],此方法一般要經(jīng)過樣品的凈化和衍生化.目前主要使用免疫吸附柱來純化萃取液并富集AFT[11-13].免疫吸附柱是通過偶聯(lián)的抗體對(duì)AFT進(jìn)行特異性吸附而達(dá)到富集的效果,其富集效率高,選擇性強(qiáng),是目前AFT最為有效的固相萃取柱.衍生化方法可分為柱前衍生和柱后衍生,柱后衍生對(duì)于設(shè)備有較高要求,使用不便,不宜普及.目前,有關(guān)糧油中AFT的檢測(cè)研究報(bào)道很多[14-15],而煙草中AFT檢測(cè)方面的相關(guān)研究很少[16].因此,采用免疫親和柱純化富集、HPLC-FLD柱前衍生法,對(duì)衍生化時(shí)間、色譜條件等進(jìn)行了優(yōu)化,建立了一種簡(jiǎn)單快速、適用于檢測(cè)煙草中AFT的方法,旨在為應(yīng)對(duì)未來更為嚴(yán)格的煙草質(zhì)量安全要求提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

煙草樣品共16個(gè)(其中2012年和2013年湖北省煙草產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站接受的監(jiān)督檢測(cè)樣品留樣各8個(gè)).

AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的標(biāo)準(zhǔn)樣品(3 mg/L苯溶液,上海安譜科學(xué)儀器有限公司);甲醇、乙腈、正己烷(色譜純,德國CNW公司);三氟乙酸(AR,北京百靈威科技有限公司);純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司).

Summit P680A高效液相色譜儀(配有RF2000熒光檢測(cè)器,美國Dionex公司);AL204電子天平(感量0.000 1 g,瑞士Mettler Toledo公司);57044型手動(dòng)固相萃取儀(美國Supelco公司);KQ-800KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);黃曲霉毒素免疫親和柱(1 mL,美國Beacon公司).

1.2 方法

稱取2.00 g煙末樣品,置于30 mL帶蓋塑料瓶中,加入20 mL體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇溶液,常溫超聲提取10 min,每隔2 min振蕩1次;提取結(jié)束后,過濾,取5 mL濾液,加入20 mL純水稀釋,以1 mL/min的流速通過免疫親和柱;然后以20 mL純水分兩次淋洗親和柱;最后用1 mL甲醇洗脫免疫親和柱上富集的AFT.將甲醇洗脫液用氮?dú)庑⌒拇蹈?然后加入100μL三氟乙酸和200μL正己烷,渦旋振蕩后在40℃恒溫箱內(nèi)衍生1 h,加入0.9 mL體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇溶液,取下層溶液進(jìn)行HPLC分析.分析條件為:

色譜柱:Agilent ZORBAX Bonus-RP C18柱(4.6 mmX250 mm,5 μm);柱溫:30℃;流動(dòng)相及洗脫方式:乙腈-水(25∶75,體積比)二元流動(dòng)相等度洗脫分離;流動(dòng)相流速:1.0 mL/min;檢測(cè)方式:熒光檢測(cè)器(Ex 360 nm,Em 440 nm);進(jìn)樣量:100μL.

2 結(jié)果與討論

2.1 條件的優(yōu)化

2.1.1 衍生化條件

分子發(fā)射的熒光與其結(jié)構(gòu)有關(guān)[17].黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2、B2a和 G2a的結(jié)構(gòu)如圖 1 所示.AFB1和AFG1的雙呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)上具有獨(dú)立的不飽和雙鍵,二者在紫外光照射下發(fā)射的熒光較弱[18].在三氟乙酸的作用下,AFB1和AFG1分子可轉(zhuǎn)化為具有強(qiáng)熒光的AFB2a和AFG2a分子[19-20](圖1).AFB2a和AFG2a為AFB1、AFG1與酸反應(yīng)生成的半縮醛結(jié)構(gòu).為提高AFB1、AFG1分子檢測(cè)的靈敏度,可通過衍生化將其轉(zhuǎn)化為AFB2a和AFG2a分子.根據(jù)文獻(xiàn)[21-22]報(bào)道的實(shí)驗(yàn)過程,AFT經(jīng)從免疫親和柱上洗脫后,所得到的甲醇溶液需先用氮?dú)獯蹈?加入三氟乙酸衍生化后再經(jīng)氮?dú)獯蹈?然后定容、上樣分析.但本研究中發(fā)現(xiàn),衍生化后再經(jīng)氮?dú)獯蹈?衍生化的效果較差.這可能與AFB2a和AFG2a分子的穩(wěn)定性低有關(guān),在氮?dú)獯蹈傻倪^程中,衍生化反應(yīng)后得到的半縮醛可再次分解,使衍生化效果減弱[23].為了提高衍生化效果,在本研究中,衍生化后未采用氮?dú)獯蹈?

圖1 黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、B2a和G2a的結(jié)構(gòu)

隨著衍生化過程的推進(jìn),AFB1逐漸轉(zhuǎn)化為AFB2a分子,因此通過監(jiān)測(cè)AFB2a的熒光強(qiáng)度變化可以監(jiān)測(cè)衍生化的反應(yīng)進(jìn)程.圖2是常溫下AFB1衍生過程的熒光監(jiān)控結(jié)果.如圖2所示,隨著反應(yīng)的進(jìn)行,AFB2a分子的生成量逐漸增大,熒光強(qiáng)度也隨之增強(qiáng),最終達(dá)到平衡狀態(tài).如果將平衡狀態(tài)下的AFB1的轉(zhuǎn)化率設(shè)為100%,根據(jù)熒光強(qiáng)度的比值即可計(jì)算出不同時(shí)間AFB1的轉(zhuǎn)化率.根據(jù)文獻(xiàn)[24-25]報(bào)道,加入三氟乙酸后衍生化所需的時(shí)間在15～20 min之間.AFB1在不同衍生化溫度條件下轉(zhuǎn)化率與反應(yīng)時(shí)間的關(guān)系見圖3.可知,在常溫下,衍生化完全需要3 h以上;在45℃條件下,經(jīng)過1 h,即可以衍生化完全.

圖2 25℃時(shí)AFB1衍生化過程中熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化

圖3 不同溫度下衍生化過程中AFB1轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間的變化

2.1.2 色譜條件

流動(dòng)相的組成會(huì)影響分離度和目標(biāo)物保留時(shí)間.考察了流動(dòng)相組成的影響,通過研究甲醇-水、乙腈-水體系發(fā)現(xiàn)AFB2與AFB2a、AFG2與 AFG2a在甲醇-水體系內(nèi)基線無法分離,而在乙腈-水體系內(nèi)分離度較好.通過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到乙腈-水的最佳比例為25∶75(體積比),在20 min內(nèi)可以得到滿意的分離效果.4種黃曲霉毒素的出峰先后順序?yàn)锳FG2、AFG1、AFB2、AFB1(圖4).

圖4 經(jīng)HPLC分離的4種黃曲霉毒素

2.2 方法的驗(yàn)證

2.2.1 工作曲線、檢出限及定量限

配制 AFB1、AFB2、AFG1和 AFG2的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液.分別取一定體積的標(biāo)準(zhǔn)混合儲(chǔ)備液,經(jīng)氮?dú)獯蹈?三氟乙酸衍生化后定容,得到AFT的系列標(biāo)準(zhǔn)混合溶液(AFB1和AFG1轉(zhuǎn)化為 AFB2a和AFG2a的形式存在,為方便計(jì)算,后文中仍然以AFB1和AFG1表示),其中 AFB2的濃度為 0.025、0.050、0.100、0.250、0.500、1.000 和 2.500 ng/mL,AFG2、AFG1、AFB1的濃度均為0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、2.50和5.00 ng/mL.將所得標(biāo)準(zhǔn)混合溶液進(jìn)行HPLC-FLD分析,采用外標(biāo)法定量,以目標(biāo)物的峰面積Y對(duì)其濃度X進(jìn)行回歸分析,并按3倍信噪比(S/N)和10倍信噪比來確定各分析物的檢出限和定量限,得到的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢測(cè)限如表 1 所示.在 0.1～10.0 μg/kg 范圍內(nèi),AFG2、AFG1、AFB1呈現(xiàn)了良好的線性關(guān)系;在0.05～5.00 μg/kg范圍內(nèi),AFB2呈現(xiàn)了良好的線性關(guān)系.其中AFB1的檢出限和定量限分別為0.10和0.34 μg/kg,完全可以滿足歐盟針對(duì)直接食用食物中AFT總量和AFB1分量設(shè)定的限量(最大殘留限量:AFT總量≤4 μg/kg,AFB1≤2 μg/kg)的檢測(cè)要求.考慮到煙草的吸食特性,由卷煙煙氣攝入人體的量比直接食用少得多.

2.2.2 回收率和重復(fù)性

在煙葉樣品中分別添加0.2、1.0和5.0 μg/kg水平的 AFB1、AFB2、AFG1和 AFG2標(biāo)準(zhǔn)品,測(cè)定該 4種AFT的回收率,每種濃度添加進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn),根據(jù)結(jié)果計(jì)算方法的加標(biāo)回收率及加標(biāo)后測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD).結(jié)果(表2)表明,方法的回收率高、重復(fù)性好.

表1 4種黃曲霉毒素的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

圖5為添加5.0 μg/kg水平AFT標(biāo)準(zhǔn)品的煙葉樣品的色譜圖.可以看出,經(jīng)免疫親和柱富集和凈化,煙葉萃取液中的大部分雜質(zhì)均能被有效除去,殘留的雜質(zhì)能與目標(biāo)物有效分離,對(duì)目標(biāo)物無干擾.

表2 方法的加標(biāo)回收率及重復(fù)性(n=6)

圖5 添加5 μg/kg水平黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品的煙葉樣品的HPLC圖

2.3 實(shí)際樣品的測(cè)定結(jié)果

實(shí)際樣品為2012年和2013年的16個(gè)煙草監(jiān)督檢測(cè)樣品的留樣,其中2012年的8個(gè)樣品保存狀態(tài)較差,目測(cè)已有一定程度的霉變.按照1.2節(jié)的步驟處理煙草樣品,經(jīng)HPLC-FLD分析,結(jié)果表明:2013 年的 8 個(gè)樣品中,AFB1、AFB2、AFG1和AFG2均未檢出;2012年的8個(gè)樣品中僅一個(gè)樣品中檢出AFB1,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.44 μg/kg,低于歐盟針對(duì)直接食用食物的限量要求;其他樣品均未檢出該4種AFT.

3 結(jié)論

建立的檢測(cè)黃曲霉毒素 B1、B2、G1和 G2的HPLC-FLD柱前衍生法的檢出限低,回收率(85.4%～117.8%)和重復(fù)性好,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.2%～9.4%(n=6),適用于煙草及煙草制品中黃曲霉毒素 B1、B2、G1和 G2的檢測(cè).

[1]Gourama H,Bullerman L B.Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus:aflatoxigenic fungi of concern in foods and feed[J].J Food Protect,1995,58(12):1395-1404.

[2] 李培武,馬良,楊金娥,等.糧油產(chǎn)品黃曲霉毒素B1檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J].中國油料作物學(xué)報(bào),2005,27(2):77-81.

[3] 孫玲玉,柴同杰.黃曲霉毒素生物降解的研究進(jìn)展[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2012,43(4):645-647.

[4] 吳兆蕃.黃曲霉毒素的研究進(jìn)展[J].甘肅科技,2010,26(18):89-93.

[5] 王宏亮.薄層層析法測(cè)定飼料中黃曲霉毒素B1方法的改進(jìn)[J].糧食與飼料工業(yè),1998(1):40-42.

[6]Blesa J,Soriano J M,Molto J C,et al.Determination of aflatoxins in peanuts by matrix solid-phase dispersion and liquid chromatography[J].J Chromatogr A,2003,1011(1/2):49-54.

[7]FU Zhaohui,HUANG Xuexiang,MIN Shungeng.Rapid determination of aflatoxins in corn and peanuts[J].J Chromatogr A,2008,1209(1/2):271-274.

[8] 陳萍,鄧冬云,歐陽靜茹,等.酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定花生油中的黃曲霉毒素B1[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2012,22(3):658-659.

[9] 李軍,田苗,于一芒,等.免疫親和-光化學(xué)衍生高效液相色譜檢測(cè)花生及花生制品中黃曲霉毒素[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào),2007,26(1):93-96.

[10]趙寧,郭玉梅,姚妍妍,等.高效液相色譜法測(cè)定花生中黃曲霉素的含量[J].科技信息,2009,25:44-45.

[11]Afzali D,Ghanbarian M,Mostafavi A,et al.A novel method for high preconcentration of ultra trace amounts of B1,B2,G1and G2aflatoxins in edible oils by dispersive liquid-liquid microextraction after immunoaffinity column clean-up[J].J Chromatogr A,2012,1247:35-41.

[12]Ghali R,Belouaer I,Hdiri S,et al.Simultaneous HPLC determination of aflatoxins B1,B2,G1and G2in Tunisian sorghum and pistachios[J]. Journal of Food Composition and Analysis,2009,22(7/8):751-755.

[13]ReiteE V,Cichna-MarklM,ChungDH,etal.Immuno-ultrafiltration asanew strategy in sample clean-up of aflatoxins[J].J Sep Sci,2009,32(10):1729-1739.

[14]李書國,陳輝,李雪梅,等.糧油食品中黃曲霉毒素檢測(cè)方法綜述[J].糧油食品科技,2009,17(2):62-65.

[15]韓珍,趙文紅,錢敏,等.黃曲霉毒素檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2011(13):93-96.

[16]陳歡,劉彤,侯宏衛(wèi),等.煙草及煙草制品中黃曲霉毒素的酶聯(lián)免疫測(cè)定方法:中國,103063831A[P].2013-04-24.

[17]趙德豐,高欣欽.熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系[J].染料工業(yè),1995,32(6):1-5.

[18]Braga S M,de Medeiros F D,de Oliveira E J,et al.Developmentand validation ofa method forthe quantitative determination of aflatoxin contaminants in Maytenus ilicifolia by HPLC with fluorescence detection[J].Phytochem Anal,2005,16(4):267-271.

[19]馬良,李培武,張文.高效液相色譜法對(duì)農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素的測(cè)定研究[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào),2007,26(6):774-778.

[20]Quinto M,Spadaccino G,Palermo C,et al.Determination of aflatoxins in cereal flours by solid-phase microextraction coupled with liquid chromatography and post-column photochemicalderivatization-fluorescence detection[J].J Chromatogr A,2009,1216(49):8636-8641.

[21]陳玉波,陳長毅,劉洋,等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定食品中黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2、M1、M2[J].食品科技,2009,34(9):265-267.

[22]何豐瑞,陳艷,李永波.高效液相色譜法測(cè)定袋泡茶葉中的黃曲霉毒素[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2014,24(3):335-336.

[23]Jaimez J,Fente C A,Vazquez B I,et al.Application of the assay of aflatoxins by liquid chromatography with fluorescence detection in food analysis[J]. J Chromatogr A,2000,882(1/2):1-10.

[24]Khayoon W S,Saad B,Yan C B,et al.Determination of aflatoxins in animal feeds by HPLC with multifunctional column clean-up[J].Food Chemistry,2010,118(3):882-886.

[25]Sharma M,Marquez C.Determination of aflatoxins in domestic pet foods(dog and cat)using immunoaffinity columnandHPLC[J].Animalfeedscienceand technology,2001,93(1/2):109-114.

責(zé)任編輯 茹呈杰

Simultaneous Determination of Aflatoxins B1,B2,G1and G2in Tobacco by HPLC-FLD Pre-column Derivatization Method

WANG Kang,LI Yun,and XIAO Shaohong
Hubei Province Tobacco Quality Supervisionamp;Test Station,Wuhan 430030,China

An immunoaffinity detection method for simultaneously determining the aflatoxins B1,B2,G1and G2in tobacco and tobacco products was developed via solvent extraction of sample,purifying and concentrating on immunoaffinity column,pre-column derivatization by trifluoroacetic acid,separation by HPLC,and detection by fluorescence detector.The results showed that:1)The determination could be completed within 20 minutes,the four target aflatoxins were well separated and exhibited good linear relations with correlation coefficients rgt;0.99.2)The recoveries of the method ranged from 85%to 117%with the relative standard deviation (RSD)of 0.2%-9.4% (n=6),and the limits of detection and quantification of aflatoxin B1were 0.10 and 0.34 μg/kg,respectively.

Tobacco;Aflatoxin;Pre-column derivatization;HPLC

TS411.1

A

1002-0861(2015)10-0057-05

10.16135/j.issn1002-0861.20151010

2015-02-09

2015-07-09

王康(1986-),博士,工程師,主要從事煙草化學(xué)研究.E-mail:wangkang4907@163.com

王康,李韻,肖少紅.HPLC-FLD柱前衍生法同時(shí)測(cè)定煙草中黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2[J].煙草科技,2015,48(10):57-61.

WANG Kang,LI Yun,XIAO Shaohong.Simultaneous determination of aflatoxins B1,B2,G1and G2in tobacco by HPLC-FLD pre-column derivatization method[J].Tobacco Scienceamp;Technology,2015,48(10):57-61.