吳 彥,張文娟,李志華,鄭歷史,王萍娟,韋建玉,黃東業(yè),田兆福,李小蘭,杜樹山*

1.廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心,南寧市北湖南路28號(hào) 530001

2.北京師范大學(xué)中藥資源保護(hù)與利用北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京市新街口外大街19號(hào) 100875

3.遼寧中醫(yī)藥大學(xué),遼寧省大連市雙D港生命一路77號(hào) 116600

側(cè)柏葉對(duì)煙草倉(cāng)儲(chǔ)害蟲煙草甲和赤擬谷盜的毒殺作用

吳 彥1,張文娟2,李志華1,鄭歷史3,王萍娟1,韋建玉1,黃東業(yè)1,田兆福1,李小蘭1,杜樹山*2

1.廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心,南寧市北湖南路28號(hào) 530001

2.北京師范大學(xué)中藥資源保護(hù)與利用北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京市新街口外大街19號(hào) 100875

3.遼寧中醫(yī)藥大學(xué),遼寧省大連市雙D港生命一路77號(hào) 116600

為有效防治煙草倉(cāng)儲(chǔ)害蟲,進(jìn)行了新型植物防護(hù)劑的開發(fā)研究.通過(guò)熏蒸和觸殺試驗(yàn)測(cè)試了側(cè)柏葉揮發(fā)油及單體成分活性,并通過(guò)GC/MS分析了側(cè)柏葉揮發(fā)油的化學(xué)成分.結(jié)果顯示:①GC/MS分析共鑒定出側(cè)柏葉揮發(fā)油成分34種,占總成分的93.28%,其主要成分為:α-蒎烯(15.08%)、雪松醇(12.63%)、3-蒈烯(9.68%)和石竹烯(9.02%).②通過(guò)生物活性篩選,側(cè)柏葉揮發(fā)油對(duì)煙草甲和赤擬谷盜觸殺的半數(shù)致死量分別為50.45和48.59μg/頭;對(duì)二者熏蒸活性的半數(shù)致死濃度為145.40和39.25 mg/L.③從側(cè)柏葉揮發(fā)油中得到3種活性成分:α-蒎烯、β-水芹烯和4-萜烯醇.因此,側(cè)柏葉揮發(fā)油及其活性單體對(duì)煙草甲和赤擬谷盜均具有一定的觸殺和熏蒸活性.

煙草;倉(cāng)儲(chǔ)害蟲;煙草甲;赤擬谷盜;側(cè)柏葉;揮發(fā)油;活性

側(cè)柏葉為柏科植物側(cè)柏[Platycaldus orientalis(L.)Franco]的干燥枝葉,主要成分為黃酮類化合物、鞣質(zhì)和揮發(fā)油等[1-2],柏葉揮發(fā)油中富含多種具有殺蟲活性的化合物.目前關(guān)于側(cè)柏葉的研究主要集中在其揮發(fā)油化學(xué)成分分析以及側(cè)柏葉揮發(fā)油對(duì)人肺癌細(xì)胞[3]、細(xì)菌[4]及真菌[5]的抑制作用方面,而對(duì)害蟲的毒殺作用則鮮見報(bào)道.煙葉在貯藏過(guò)程中易遭到害蟲的侵害[6],其中煙草甲(Lasioderma serricorne Fabricius)為優(yōu)勢(shì)種、赤擬谷盜(Tribolium castaneum Herbst)為僅次于優(yōu)勢(shì)種的種類.據(jù)CORESTA估計(jì),煙草甲蟲每年對(duì)貯存煙草造成的損失約為1%[7].我國(guó)在20世紀(jì)90年代曾對(duì)全國(guó)貯煙害蟲的為害程度進(jìn)行了調(diào)查,每年因蟲害引起的煙葉質(zhì)量損失率約為1.64%,其中煙草甲蟲為害引起的質(zhì)量損失遠(yuǎn)大于其他貯煙害蟲[8-9].在煙草倉(cāng)儲(chǔ)常規(guī)的害蟲防治方面目前以磷化氫(磷化鋁)熏蒸最為普遍,但磷化氫(磷化鋁)的長(zhǎng)期使用會(huì)對(duì)環(huán)境和人類健康造成一定影響[10-11].由此,2010年4月,美國(guó)環(huán)保署(EPA)發(fā)布了農(nóng)藥中磷化鋁和磷化鎂熏蒸劑的使用限制[12].近年來(lái)植物源殺蟲劑的研究和開發(fā)受到一定重視,其中揮發(fā)性植物成分如植物精油是目前研究較多的一類植物殺蟲劑,具有高度選擇性,易于分解,對(duì)人畜安全性高等優(yōu)點(diǎn).且多數(shù)對(duì)天敵生物毒性小,對(duì)害蟲卻有引誘、忌避、拒食和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)等作用[13-14].根據(jù)柏科植物精油中富含的殺蟲活性物質(zhì)及殺蟲特性,選擇資源豐富的側(cè)柏葉為靶標(biāo),對(duì)其揮發(fā)油及單體化合物進(jìn)行殺蟲活性試驗(yàn),旨在開發(fā)出新型植物防護(hù)劑,有效防治煙倉(cāng)害蟲.

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

柏科植物側(cè)柏Platycladus orientalis(L.)Franco的干燥枝梢和葉購(gòu)于河北省安國(guó)藥材市場(chǎng).側(cè)柏葉樣本(BNU-CMH-Dushushan-2012-09-10-010)保存于北京師范大學(xué)資源學(xué)院北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新鮮枝葉風(fēng)干1周后備用.

正己烷、乙醚、無(wú)水硫酸鈉等均為分析純(北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司).

Thermo Finngen TRACE DSQ氣-質(zhì)聯(lián)用儀,質(zhì)譜檢索NIST譜庫(kù),GHP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);移液槍(量程范圍0.1～2.5μL、0.5～10μL和10～100μL,大龍創(chuàng)興實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);Bruker Avance DRX 500核磁共振譜儀(美國(guó)布魯克公司).

1.2 方法

1.2.1 樣品處理與分析

取側(cè)柏葉8 kg粉碎后,用揮發(fā)油提取器進(jìn)行提取,時(shí)間為6 h,油水經(jīng)正己烷溶劑萃取,無(wú)水硫酸鈉處理后過(guò)濾,常壓濃縮至不含溶劑,得到無(wú)色揮發(fā)油13.4 mL并于4℃冰箱保存,側(cè)柏葉出油率為0.17%.

1.2.2 化合物的分離

側(cè)柏葉揮發(fā)油10 mL,經(jīng)正相硅膠柱層析,采用正己烷、正己烷-乙酸乙酯、乙酸乙酯依次梯度洗脫分段,獲得25個(gè)餾分段,再經(jīng)石油醚-丙酮(100∶1,體積比)反復(fù)硅膠柱層析分離,最終分別從餾分段3、8和16中獲得3種單體化合物.

1.2.3 生物活性的篩選

1.2.3.1 熏蒸活性的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[14]的方法測(cè)定揮發(fā)油及單體化合物對(duì)煙草甲和赤擬谷盜的熏蒸活性.將10頭供試?yán)ハx(試蟲)放入直徑2.5 cm,高5.5 cm的玻璃瓶中,然后用移液槍吸取10μL樣品的正己烷稀釋液(預(yù)實(shí)驗(yàn)濃度為50%、10%和2%;根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置5個(gè)濃度梯度)滴于置瓶蓋內(nèi)直徑20 mm的濾紙片上,另取正己烷為空白對(duì)照,磷化氫和甲基溴分別作為煙草甲和赤擬谷盜的熏蒸活性陽(yáng)性對(duì)照,揮發(fā)20 s后,迅速擰緊瓶蓋密封,形成密閉空間,瓶口涂有聚四氟乙烯,防止試蟲接觸到含藥劑的濾紙.每處理重復(fù)5次,每重復(fù)10頭.處理后置于溫度(29±1)℃,相對(duì)濕度為70%～80%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,觀察記錄死亡情況,并計(jì)算死亡率與校正死亡率.采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析計(jì)算半致死濃度LC50(mg/L).觀察死亡情況前先用力搖動(dòng)玻璃瓶,再將玻璃瓶倒置,5 min后觀察,蟲體不動(dòng)即為死亡.

死亡率=(死蟲數(shù)/試蟲數(shù))X100%

校正死亡率=(處理組死亡率-對(duì)照組死亡率)/(1-對(duì)照組死亡率)X100%

1.2.3.2 觸殺活性的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[15]的方法測(cè)定揮發(fā)油及其單體化合物對(duì)煙草甲和赤擬谷盜的觸殺活性.將羽化一周左右的成蟲從培養(yǎng)瓶中取出,先用乙醚麻醉,然后用移液槍取0.5μL樣品的正己烷稀釋液(濃度同1.2.3.1節(jié))滴于試蟲的前胸背板上(置于冰袋上操作),處理后放入直徑2.5 cm,高5.5 cm玻璃瓶中,正己烷為空白對(duì)照組,除蟲菊素作為陽(yáng)性對(duì)照組,各樣品設(shè)置5個(gè)濃度,每個(gè)濃度重復(fù)5次,每個(gè)重復(fù)試蟲10頭.處理組、空白對(duì)照組及陽(yáng)性對(duì)照組培養(yǎng)溫濕度條件、時(shí)間和試蟲的死亡情況調(diào)查與計(jì)算同1.2.3.1節(jié),計(jì)算半致死劑量LD50(μg/頭).

2 結(jié)果與分析

2.1 側(cè)柏葉揮發(fā)油的化學(xué)成分分析

GC/MS總離子流色譜見圖1,經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索NIST數(shù)據(jù)庫(kù),比對(duì)各峰的MS碎片并結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)譜圖解析,鑒定出34種化合物,見表1.其中鑒定出的α-蒎烯含量最高,占揮發(fā)油成分的15.08%.

圖1 側(cè)柏葉揮發(fā)油GC/MS總離子流圖

表1 側(cè)柏葉揮發(fā)油化學(xué)成分及其相對(duì)含量

表1(續(xù))

有研究表明,對(duì)于側(cè)柏葉,水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)性成分較完全[4].結(jié)合圖1和表1可知,側(cè)柏葉揮發(fā)油共鑒定出34種化學(xué)成分,占總揮發(fā)油的93.28%,提取較完全,其中主要成分為α-蒎烯、雪松醇、3-蒈烯、石竹烯和α-石竹烯,化合物類型以烯、醛、醇和酯等為主.

有文獻(xiàn)報(bào)道,山東濟(jì)南產(chǎn)側(cè)柏葉揮發(fā)油的成分主要為α-蒎烯(24.89%)、β-雪松烯(20.96%)和4-蒈烯(9.16%)[15].遼寧千山產(chǎn)側(cè)柏葉揮發(fā)油主要成分為β-雪松醇(31.43%)和2,6-二叔丁基對(duì)甲酚(17.46%)[16].新疆產(chǎn)側(cè)柏葉主要成分為α-側(cè)柏烯(17.20%)、α-蒎烯(8.42%)和檸檬烯(4.92%)[17].這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在一定差異.說(shuō)明同種植物品種由于產(chǎn)地(生態(tài)環(huán)境)、生長(zhǎng)年限和采樣時(shí)間等不同導(dǎo)致其組成及含量的差異.

2.2 化合物分離

取側(cè)柏葉揮發(fā)油10 mL,經(jīng)過(guò)反復(fù)硅膠柱層析分離,共得到3種單體化合物,經(jīng)鑒定分別為α-蒎烯[18](0.98 g)、β-水芹烯[19](0.48 g)和4-萜烯醇[20](0.16 g).

2.3 生物活性

2.3.1 熏蒸活性

由表2可知,側(cè)柏葉揮發(fā)油對(duì)煙倉(cāng)害蟲煙草甲和赤擬谷盜均有一定的熏蒸毒殺作用,LC50分別為145.40和39.25 mg/L.在分離的3種化合物中,4-萜烯醇對(duì)兩種煙倉(cāng)害蟲的熏蒸毒性最好,且對(duì)煙草甲的熏蒸毒性是赤擬谷盜的2.88倍.然而,4-萜烯醇對(duì)煙草甲和赤擬谷盜的熏蒸活性均小于對(duì)照藥劑磷化氫和甲基溴.在熏蒸活性測(cè)試中,β-水芹烯對(duì)煙草甲和赤擬谷盜的毒性也較高.從側(cè)柏葉揮發(fā)油中得到的3種化合物中,α-蒎烯對(duì)兩種煙倉(cāng)害蟲的熏蒸活性較弱,其對(duì)赤擬谷盜的毒性強(qiáng)于對(duì)煙草甲的毒性.側(cè)柏葉揮發(fā)油的主要成分α-蒎烯、β-水芹烯和4-萜烯醇對(duì)兩種煙倉(cāng)害蟲的活性均大于側(cè)柏葉揮發(fā)油的活性.

表2側(cè)柏葉揮發(fā)油及單體對(duì)煙草甲和赤擬谷盜的毒性

2.3.2 觸殺活性

與熏蒸活性相比,側(cè)柏葉揮發(fā)油的3種單體化合物的觸殺活性均較弱,且均低于相同實(shí)驗(yàn)條件下的對(duì)照(除蟲菊素)對(duì)煙草甲和赤擬谷盜的觸殺活性.側(cè)柏葉揮發(fā)油的3種單體化合物中觸殺活性最好的是4-萜烯醇,4-萜烯醇對(duì)煙草甲和赤擬谷盜觸殺的LD50分別為5.42和19.67 mg/L.α-蒎烯對(duì)赤擬谷盜的觸殺活性是煙草甲的2.9倍.而β-水芹烯對(duì)煙草甲的觸殺活性高于赤擬谷盜,是赤擬谷盜觸殺活性的1.34倍.除了α-蒎烯對(duì)煙草甲的觸殺活性較弱外,β-水芹烯、4-萜烯醇對(duì)兩種煙倉(cāng)害蟲的觸殺活性均大于側(cè)柏葉揮發(fā)油對(duì)煙草甲和赤擬谷盜的觸殺活性.

3 小結(jié)與討論

通過(guò)GC/MS分析及生物活性篩選發(fā)現(xiàn):①側(cè)柏葉揮發(fā)油成分主要是單萜和倍半萜;②側(cè)柏葉揮發(fā)油及其3種主成分α-蒎烯、β-水芹烯和4-萜烯醇對(duì)煙倉(cāng)害蟲煙草甲和赤擬谷盜均有一定的毒性.因此,將側(cè)柏葉揮發(fā)油及其活性成分開發(fā)為新型植物型熏蒸劑或防護(hù)劑并應(yīng)用于煙草倉(cāng)儲(chǔ)害蟲防治具有重要意義.

本試驗(yàn)中測(cè)定了側(cè)柏葉揮發(fā)油的殺蟲活性,發(fā)現(xiàn)側(cè)柏葉揮發(fā)油及其部分單體化合物對(duì)煙倉(cāng)害蟲煙草甲和赤擬谷盜均具有一定的熏蒸和觸殺毒性.雖然作用效果低于陽(yáng)性對(duì)照,但作為植物防護(hù)劑,具有對(duì)有害生物高效、對(duì)非靶標(biāo)生物安全、易分解、分解產(chǎn)物對(duì)環(huán)境無(wú)損害的特點(diǎn)[7,11,13],在倉(cāng)儲(chǔ)害蟲防治過(guò)程中已成為較理想的化學(xué)農(nóng)藥替代品之一.然而,目前有關(guān)側(cè)柏葉揮發(fā)油對(duì)煙倉(cāng)害蟲的驅(qū)避作用,對(duì)成蟲產(chǎn)卵行為的干擾作用、拒食作用以及對(duì)害蟲種群的抑制作用方面還需進(jìn)一步深入研究,對(duì)煙倉(cāng)害蟲的作用機(jī)理仍需要進(jìn)一步試驗(yàn).

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責(zé)任編輯 董志堅(jiān)

Toxic Activities ofPlatycladus orientalisAgainstLasioderma serricorneand Tribolium castaneumin Stored Tobacco

WU Yan1,ZHANG Wenjuan2,LI Zhihua1,ZHENG Lishi3,WANG Pingjuan1,WEI Jianyu1,HUANG Dongye1,TIAN Zhaofu1,LI Xiaolan1,and DU Shushan*2

1.Technology Center,China Tobacco Guangxi Industrial Co.,Ltd.,Nanning 530001,China
2.Beijing Key Laboratory of Traditional Chinese MedicineProtection and Utilization,Beijing Normal University,Beijing 100875,China
3.College of Pharmacy,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Dalian 116600,Liaoning,China

In order to effectively control the pests in stored tobacco leaves,new botanical protectants were studied and developed.The activities of essential oil and isolated components of Platycladus orientalis were tested via fumigation and contact toxicity assays,and the chemical components in the essential oil were analyzed by GC/MS.The results showed that:1)A total of 34 components were identified in the essential oil,which accounted for 93.28%of total components;and the major components were α-pinene(15.08%),cedrol(12.63%),3-carene(9.68%)and caryophyllene(9.02%).2)By means of bioactivity screening,the essential oil possessed potential contact toxicity against Lasioderma serricorne(LD50=50.45 μg/adult)and Tribolium castaneum(LD50=48.59 μg/adult), and it also possessed fumigation toxicity against Lasioderma serricorne(LC50=145.40 mg/L)and Tribolium castaneum(LC50=39.25 mg/L).3)Three active components,α-pinene,β-phellandrene and 4-terpinenol,were obtained from the essential oil.It was proved that the essential oil of Platycladus orientalis and its active isolated components possessed certain contact and fumigation toxic activities against Lasioderma serricorne and Tribolium castaneum.

Tobacco;Pest in stored tobacco;Lasioderma serricorne;Tribolium castaneum;Platycladus orientalis;Essential oil;Activity

S43

A

1002-0861(2015)10-0031-06

10.16135/j.issn1002-0861.20151005

2014-09-19

2015-07-10

北京市自然科學(xué)資金資助項(xiàng)目quot;竹葉花椒防治藥材倉(cāng)儲(chǔ)害蟲活性物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)理研究quot;(7142093).

吳彥(1972-),博士,副研究員,主要從事天然植物在卷煙減害增香中的應(yīng)用研究及藥理學(xué)研究.E-mail:abelabel@126.com;*

杜樹山,E-mail:dushushan@bnu.edu.cn

吳彥,張文娟,李志華,等.側(cè)柏葉對(duì)煙草倉(cāng)儲(chǔ)害蟲煙草甲和赤擬谷盜的毒殺作用[J].煙草科技,2015,48(10):31-35,56.WU Yan,ZHANG Wenjuan,LI Zhihua,et al.Toxic activities of Platycladus orientalis against Lasioderma serricorne and Tribolium castaneum in stored tobacco[J].Tobacco Scienceamp;Technology,2015,48(10):31-35,56.