萬秀清,喬 嬋,趙淑娟,李 若,李麗杰,郭振楠

牡丹江煙草科學研究所,黑龍江省牡丹江市西地明街425號 157011

黑龍江煙區(qū)煙草馬鈴薯Y病毒株系的分子鑒定

萬秀清,喬 嬋*,趙淑娟,李 若,李麗杰,郭振楠

牡丹江煙草科學研究所,黑龍江省牡丹江市西地明街425號 157011

為明確黑龍江煙區(qū)煙草馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)株系種類及其分布狀況,采用多重PCR技術及測序手段,對采集黑龍江省煙葉產區(qū)的107份疑似PVY樣品進行了鑒定分析.結果表明:4個有代表性的PVY分離物HLJ-SH8、HLJ-SC2、HLJ-SC6和HLJ-MDJ4的基因組序列全長分別為9 698、9 702、9 702和9 698 bp,都包含一個由9 186 bp組成的開放讀碼框(ORF),編碼一個由3 061個氨基酸組成的多聚蛋白.系統(tǒng)進化樹分析結果表明這4個PVY分離物分別為PVYNTN、PVYN、PVYNW和PVYNTN-NW株系,其中PVYNTN-NW株系是侵染黑龍江煙草的優(yōu)勢株系.

黑龍江煙區(qū);馬鈴薯Y病毒(PVY);株系鑒定;多重PCR;測序

煙草馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)是感染危害黑龍江省煙草的主要病毒之一,其寄主范圍廣,能侵染豆科、菊科等34屬163種植物,馬鈴薯、辣椒、番茄和煙草等茄科作物是主要對象[1-4].目前在全國16個煙草種植省(區(qū))均有PVY發(fā)生.隨著煙草馬鈴薯Y病毒病的日趨嚴重,對馬鈴薯Y病毒病的發(fā)生規(guī)律及綜合防治技術也進行了相關的研究,在國內多個煙草種植省(區(qū))已有報道[5-11].而植物病毒存在不同株系,在相同的寄主植物上可引起不同的癥狀,通常依據病毒的生物學特性、寄主范圍、血清學和核酸特異性等來劃分株系.近年來,在歐洲、美洲等地區(qū)陸續(xù)發(fā)現了一系列具有高致病性的PVY新株系,主要包括PVYNTN、PVYNW、PVYN∶O和 PVYNA-NIN株系等[12].目前,中國農科院煙草研究所鑒定出山東煙區(qū)主要有PVYO和PVYN兩個株系[13];吳元華等[14]鑒定出東北煙區(qū)主要有 PVYO、PVYVN、PVYC和 PVYNS4 個株系;國內已被廣泛認同的PVY株系種類有PVYO、PVYN和PVYC3種[15];黑龍江煙區(qū)煙草尚未見有關PVY株系鑒定的系統(tǒng)報道.在國內已有的馬鈴薯Y病毒的株系鑒定中多以P1和CP基因序列為主,但利用基因組序列全長進行株系劃分的報道并不多見.雖然P1基因是整個基因組的易變異基因,CP基因的變異也對株系劃分有一定的意義,但馬鈴薯Y病毒的基因變異是由多個基因共同作用引起的,僅依據P1基因與CP基因對PVY進行株系鑒定存在一定的局限性.為此,采用分子生物學手段及測序技術,對采集的黑龍江煙區(qū)煙草PVY樣品進行分類、測序及分析,旨在合理進行株系劃分,并進一步設計不同株系特異PCR鑒定引物,對感染黑龍江煙草的PVY株系種類、發(fā)生發(fā)展情況及其區(qū)域分布進行長期監(jiān)控,為煙葉生產中PVY病毒的有效防治提供技術支撐.

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

植物病毒總RNA提取試劑盒(德國QIAGEN公司);Ex-taq酶,RNA反轉錄試劑盒(日本TaKaRa公司);DNA純化回收試劑盒E.Z.N.A.?Gel Extraction Kit(美國 OMEGA公司);低熔點瓊脂糖(美國Sigma公司);PVY免疫試紙條(美國Agida公司);其他常用試劑均為國產或進口分析純.

1.2 試驗方法

1.2.1 PVY病毒樣品的采集

于2010年和2011年,在黑龍江煙區(qū)的綏化、肇州、雙城、賓縣及牡丹江采集各種煙草PVY疑似癥狀的樣品共計107份,其中牡丹江16份,綏化19份,賓縣24份,雙城16份,肇州32份.采集樣品時手戴一次性PE手套,避免不同樣品間相互污染.對采集的樣品進行照相并標注,注明樣品采集時間、樣品編號、采集地點和典型癥狀等.

1.2.2 PVY病毒樣品免疫試紙檢測

每個樣品使用一個研磨袋,并進行標記.首先用剪刀剪開研磨袋的頂端,注意不要濺出緩沖液.用酒精擦拭消毒后的剪刀剪下有PVY典型癥狀的煙草葉片并稱取約0.15 g,放入含有3 mL SEB緩沖液的研磨袋中.植物樣本與緩沖液比例為1∶20(g∶mL);把葉片置于研磨袋的研磨線之間,用筆或其他鈍物擠壓煙草葉片,使之完全破碎,再將樣品混合均勻;將標有quot;samplequot;一頭的試紙條的端部浸入到煙草PVY提取緩沖液中,檢測過程中試紙條端部不能離開提取液.(試紙條不使用時需儲存在4℃冰箱里,使用時需將其恢復到室溫).最長反應時間為30 min.當檢測線和控制線均顯示為紅色時,表明為PVY陽性;只有控制線出現而檢測線未出現時為PVY陰性;如果控制線不顯示紅色,表明試驗結果無效或是試紙條失效.經PVY免疫試紙條檢測呈陽性結果的煙草樣品置于-60℃低溫冰箱中保存,備用.

1.2.3 分子生物學鑒定

1.2.3.1 煙草總RNA的提取及cDNA合成

用RNeasy Plant Mini(50)提取試劑盒提取檢測結果為PVY陽性的病毒樣品的總RNA.以Oligo dT-Adaptor Primer為引物,利用 RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0試劑盒進行反轉錄合成cDNA,具體方法參照相關試劑盒使用說明書.

1.2.3.2 PVY株系多重RT-PCR檢測

以合成的cDNA為模板,以健康未染病的煙草葉片為陰性對照,多重PCR擴增引物參照Ali M C[16]設計合成,見表1.多重RT-PCR反應體系:總體積為25 μL,其中 2.5 μL 的 10XExTaq buffer,0.12 μL的TaKaRa Ex Taq酶,19.38 μL無菌水,2 μL引物混合物,1 μL cDNA模板.降落式PCR擴增循環(huán)程序:94℃預變性2 min;94℃變性30 s,64℃復性30 s,72℃延伸90 s,10次循環(huán);94℃變性30 s,62℃復性30 s,72℃延伸90 s,10次循環(huán);94℃變性30 s,60℃復性30 s,72℃延伸90 s,10次循環(huán);最后72℃延伸5 min.取3 μLPCR擴增產物進行2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測.

1.2.3.3 PVY基因組序列全長擴增及分析

通過PVY株系多重RT-PCR檢測,根據各樣品的PCR擴增結果,對樣品進行初步分類,選取有代表性的4個PVY株系樣品進行PVY全序列測定.根據PVY各株系比對結果,在保守區(qū)域設計合成3對PCR擴增引物,3對引物擴增片段全覆蓋PVY基因組,序列見表2.PCR反應體系:5XPCR buffer 5 μL,無菌水 16.5 μL,Ex-taq 酶 0.125 μL,引物各0.25 μL,cDNA 3 μL,總體積為25 μL;PCR擴增條件:94℃預變性2 min;94℃變性40 s,50.7℃復性40 s,72℃延伸2 min,72℃延伸7 min,35個循環(huán).PCR反應完成后進行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收目標條帶,然后直接對回收純化的特異PCR擴增條帶進行測序.測序后對3對PCR擴增的序列進行拼接.

表1 多重RT-PCR檢測引物

表2 PVY全長擴增引物

1.2.3.4 PVY序列分析

在GenBank中下載已經登錄的PVY全基因序列用于PVY病毒序列同源性分析及構建系統(tǒng)進化樹.序列比對采用MEGA5.0軟件中的ClustaW,選擇MEGA5.05軟件并采用鄰接法(Neighbor-joining,NJ)對本實驗所得到的4個PVY基因組全長序列和GenBank上登錄的PVY全長序列構建系統(tǒng)進化樹.本實驗中分離的4個PVY基因組全長間的核苷酸序列與氨基酸序列的一致率用Align plus 4軟件進行比對.

1.2.4 黑龍江省煙草PVY株系區(qū)域分布

根據多重RT-PCR檢測結果,統(tǒng)計分析2010年和2011年采集的煙草PVY各株系在黑龍江煙草種植區(qū)的分布情況.

2 結果與分析

2.1 馬鈴薯Y病毒樣品癥狀及免疫試紙檢測分析

采集的107份煙草病毒樣品典型癥狀如圖1,主要表現癥狀為葉脈壞死、褪綠斑駁、點刻褪綠條帶及明脈等.免疫試紙檢測結果表明:PVY陽性結果(檢測線出現清晰紅色條帶)為97個,陰性結果(檢測線未出現條帶)為10個,陽性檢出率為90.65%.典型免疫試紙條檢測陽性結果如圖2.

圖1PVY樣品癥狀

圖2 PVY免疫試紙檢測結果

2.2 分子生物學檢測分析

2.2.1 PVY分離物總RNA的提取效果

瓊脂糖凝膠電泳結果見圖3.PVY分離物總RNA經1%瓊脂糖凝膠分離,電泳條帶從上至下分別為28S、16S和5S,其中28S rRNA條帶較清晰,表明所提取的RNA質量高、完整性較好,可以用來進行反轉錄及反轉錄后的PCR擴增.

圖3PVY總RNA凝膠電泳圖

2.2.2 PVY多重RT-PCR檢測結果

圖4結果表明:97個煙草PVY陽性樣品的多重RT-PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后,除5個混合侵染樣品外,其余91個樣品顯示4種帶型,分別為1 307+633 bp、1 307+633+441 bp、1 076+633+441 bp和853+441 bp,參照Ali M C[16]的方法,對應的株系類型分別為PVYN、PVYNTN、PVYNTN-NW(SYR-Ⅰ)和 PVYNW,其中 PVYNTN、PVYNTN-NW(SYR-I)和PVYNW為重組株系.

圖4 多重RT-PCR檢測結果

2.2.3 PVY全序列擴增結果

1%的瓊脂糖凝膠電泳結果(圖5)顯示出3條不同的電泳條帶,第一片段的條帶大小約為3 800 bp,第二片段大小約為4 100 bp,第三片段大小約為3 100 bp,條帶單一,符合預期擴增片段大小.對每個片段的PCR擴增產均取50 μL并經瓊脂糖凝膠電泳后回收測序.

圖5 PVY全序列的擴增電泳圖

2.2.4 PVY分離物基因組全序列分析

2.2.4.1 PVY分離物的基因組結構

將回收的3個DNA片段分別測序,測序后用DNAMan拼接得到PVY全基因組序列.4個PVY分離物HLJ-SH8、HLJ-SC2、HLJ-SC6和HLJ-MDJ4的基因組序列全長分別為9 698 bp、9 702 bp、9 702 bp和9 698 bp.4個分離物的基因組序列都僅包含一個由9 186 bp組成的開放讀碼框(ORF),編碼一個由3 061個氨基酸組成的多聚蛋白.HLJ-SH8、HLJ-SC6和HLJ-MDJ4的3'-UTR均由331個堿基組成,HLJ-SC2的3'-UTR由330個堿基組成.各個PVY分離物全序列堿基含量見表3.

2.2.4.2 PVY分離物的同源性分析

對4個PVY分離物核苷酸及氨基酸進行一致性比對,以HLJ-SH8為參照,結果見表4.從表4中可以看出,所分離的4個PVY分離物在核苷酸水平和氨基酸水平都有一定的差異性.

4個PVY分離物序列全長與GenBank中核酸數據進行Blast比對分析,結果表明:HLJ-SH8與PVYNW株系相似性最高,為99%;HLJ-SC2與PVYN株系的分離物NE-11相似性最高,為99%;HLJ-SC6與PVYNTN株系的分離物相似性最高,為99%;HLJ-MDJ4與PVYNTN-NW株系分離物相似性最高,為99%.可以初步判定4個PVY分離物HLJ-SH8、HLJ-SC2、HLJ-SC6和HLJ-MDJ4分別屬于PVYNW株系、PVYN株系、PVYNTN株系和PVYNTN-NW株系.

2.2.4.3 系統(tǒng)進化分析

對從GenBank下載的55個PVY分離物的基因組全序列及本研究中克隆的4個PVY分離物的全基因組序列進行比對分析,構建系統(tǒng)進化樹如圖6.圖6結果表明,PVY分離物可分為8個亞組:PVYN,非重組的PVYNTN和PVYEu-N,重組的PVYNTN、PVYN∶O、PVYNW、PVYNTN-NW、PVYO、PVYC、PVYNP.PVY分離物HLJ-SH8與09-3a親緣性最高,同源性為99%,共同聚類到PVYNW組,說明此分離物屬于PVYNW亞組.PVY分離物HLJ-SC2與NE-11親緣性最高,同源性為99%,共同聚類到PVYN株

系組,說明此分離物屬于PVYN組.PVY分離物HLJ-SC6與HN1親緣性最高,同源性為99%,共同聚類到PVYNTN組,說明此分離物屬于PVYNTN亞組.PVY分離物HLJ-MDJ4與HN2親緣性最高,同源性為99%,與PVYNTN-NW株系分離物聚集到一起,說明此分離物屬于PVYNTN-NW組.HLJ-SC6與湖南PVY分離物HN1同源性很高,在NCBI上Blast比對結果為99%.HLJ-MDJ4與湖南PVY分離物HN2、貴州分離物Guiding-3同源性很高,在NCBI上Blast比對結果均為99%,而與其他已知的PVY分離物全序列比對結果為98%以下,這說明本試驗中分離鑒定的PVYNTN與PVYNTN-NW很有可能起源于我國,至于這兩個PVY株系與國外PVY株系是否有地理性的差異,還需要獲得更多的本地PVY全基因組序列并進行進一步驗證.系統(tǒng)進化樹結果表明,黑龍江省煙草PVY可劃分為PVYNW、PVYN、PVYNTN和PVYNTN-NW4個株系,與多重RT-PCR鑒定結果一致.

表3 PVY分離物的基因組結構

表4 4個PVY分離物間的核苷酸與氨基酸同源性比對 (%)

圖6 4個PVY株系分離物進化樹分析(PVY分離物/基因登錄號)

2.3 黑龍江煙草馬鈴薯Y病毒的區(qū)域分布

根據多重RT-PCR結果對在黑龍江省采集的91個PVY分離物進行區(qū)域分布及各株系發(fā)生情況統(tǒng)計,結果見圖7.

圖7 多重RT-PCR電泳圖

目前,除PVYO與PVYC株系,PVY其他株系在黑龍江省各個煙草種植區(qū)都有分布.其中PVYN的比例為18.75%～36.36%,PVYNTN的比例為3.13%～26.32%,PVYNW的比例為12.5%～46.88%,PVYNTN-NW的比例為21.05%～60.00%.具體株系分布情況見表5.

牡丹江煙區(qū)以PVYNTN-NW為主,綏化4個株系均勻分布,賓縣以PVYN和PVYNW為主,雙城以PVYN與PVYNTN-NW為主,肇州以PVYNW與PVYNTN-NW為主.總體來看PVYNTN-NW比例最高,分布最廣,是感染黑龍江煙草馬鈴薯Y病毒的優(yōu)勢株系,PVYNTN的比例最低.由此表明PVY各重組株系已經在調查的黑龍江煙草種植區(qū)中大范圍流行.

表5 黑龍江省煙草PVY株系區(qū)域分布及發(fā)生率

3 結論與討論

黑龍江煙草種植區(qū)分離鑒定的4個分離物PVYN、PVYNTN、PVYNW和PVYNTN-NW全部為PVY的重組株系,說明馬鈴薯Y病毒的重組株系已經在黑龍江煙區(qū)大范圍流行.值得注意的是,PVYNTN-NW株系已經成為該煙區(qū)的優(yōu)勢株系,這一株系是2010年敘利亞報道的新的馬鈴薯Y病毒株系類型,其基因組全長序列與PVYNTN高度相似.此外,在黑龍江煙草種植區(qū)進行的PVY株系鑒定與調查均沒有發(fā)現PVYO與PVYC株系,也沒有發(fā)現PVYNTN-NW中的SYR-Ⅱ和SYR-Ⅲ型,有待于擴大樣品的采集地點及寄主范圍,進一步對煙草PVY病毒株系種類進行長期檢測及調查.另外,還需分別對分離的幾個PVY株系材料進行接種PVY抗感品種試驗,以獲得不同株系在不同抗感材料上的癥狀差異,并將分子鑒定與生物學癥狀聯系起來,進一步明確PVY致病型與基因型的關系.

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責任編輯 董志堅

Molecular Identification of TobaccoPotato Virus YStrains in Heilongjiang Tobacco Planting Areas

WAN Xiuqing,QIAO Chan*,ZHAO Shujuan,LI Ruo,LI Lijie,and GUO Zhennan
Mudanjiang Tobacco Research Institute,Mudanjiang 157011,Heilongjiang,China

To clarify the kinds and distribution states of tobacco Potato virus Y (PVY)strains in Heilongjiang tobacco planting areas,107 suspected PVY isolates collected from Heilongjiang tobacco planting areas were identified with multiplex polymerase chain reaction(Multiplex-PCR)and sequencing techniques.The results indicated that the full length of genomes in four representative isolates(HLJ-SH8,HLJ-SC2,HLJ-SC6 and HLJ-MDJ4)were 9 698,9 702,9 702 and 9 698 bp,respectively.All of the four isolates contained an open reading frame(ORF)of 9 186 bp in length and encoded a polyprotein of 3 061 amino acids.Phylogenetic analysis indicated that the four isolates were PVYNTN,PVYN,PVYNWand PVYNTN-NWstrains,respectively;among which,PVYNTN-NWstrain was the dominant strain in Heilongjiang tobacco planting areas.

Heilongjiang tobacco planting area;Potato virus Y;Strain identification;Multiplex-PCR;Sequencing

S432.41

A

1002-0861(2015)10-0013-07

10.16135/j.issn1002-0861.20151002

2014-11-28

2015-06-19

黑龍江省煙草專賣局資助項目quot;煙草PVY抗性相關基因功能研究quot;(HN201203).

萬秀清(1972-),碩士,高級農藝師,主要從事煙草分子生物學研究.E-mail:wanxiuqing@aliyun.com.cn;*

喬嬋,E-mail:qiaochan_12@163.com

萬秀清,喬嬋,趙淑娟,等.黑龍江煙區(qū)煙草馬鈴薯Y病毒株系的分子鑒定[J].煙草科技,2015,48(10):13-18,25.WAN Xiuqing,QIAO Chan,ZHAO Shujuan,et al.Molecular identification of tobacco potato virus Y strains in Heilongjiang tobacco planting areas[J].Tobacco Scienceamp;Technology,2015,48(10):13-18,25.