王欣佩，余 煊，雷 帆，邢東明，杜力軍

(清華大學蛋白質科學教育部重點實驗室，生命科學學院醫(yī)學院藥物藥理實驗室，北京 100084)

秀麗隱桿狀線蟲，Caenorhabditis elegans(C．elegans)，屬于線形動物門、線蟲綱。線蟲廣泛的分布在土壤中，以細菌為食，能夠感知氣味、光線、溫度以及機械刺激。早在20世紀60年代初期，科學家Sdyney Brenner就將線蟲(C．elegans)引入到發(fā)育生物學和神經(jīng)生物學的研究中［1］。隨后，在90年代中期，科學家 John E．Sulston［2－4］利用微分干涉顯微鏡(DIC)繪制線蟲的細胞譜系，揭示了雌雄同體線蟲全部細胞的命運，促進線蟲在單細胞水平上的深入研究。1998 年，Craig Mello 和 Andrew Fire［5］在線蟲上發(fā)現(xiàn)了dsRNA介導的RNA干擾(RNAi)現(xiàn)象，為線蟲基因功能的研究奠定了重要基礎。1998年底，線蟲的全基因組序列在Science上發(fā)表，線蟲成為了第一個完成全基因組測序的多細胞真核生物［6］。目前，線蟲作為模式生物，已經(jīng)被廣泛用于多個領域的生物學研究，包括遺傳學、發(fā)育生物學、神經(jīng)生物學、細胞生物學、衰老調(diào)控機制、性別決定、藥物作用等［7］。本文從藥物作用角度討論了線蟲作為模式生物特點，以及利用線蟲作為模式生物在藥物研究方面的應用。

1 線蟲的構成特點

線蟲是一類多細胞生物，其幼蟲含有556個體細胞和2個原始生殖細胞。發(fā)育成熟的雌雄同體線蟲含有959個體細胞和2000個生殖細胞，而發(fā)育成熟的雄性成蟲僅有1031個體細胞和1000個生殖細胞。盡管線蟲是一種簡單的模式生物，但是它具有精密的結構器官，包括肌肉、表皮、腸、生殖系統(tǒng)、腺體以及由302個(雌雄同體成蟲)或391個(雄蟲)神經(jīng)元組成的神經(jīng)系統(tǒng)。

2 線蟲作為模式生物的優(yōu)勢

線蟲以大腸桿菌(Escherichia coli，E．Coli)OP50為食，既可以養(yǎng)于瓊脂培養(yǎng)板，還可以養(yǎng)于液體培養(yǎng)基［8］。線蟲成蟲體長僅1.3 mm左右，對成長空間的需求較小，96孔板的一個孔內(nèi)即可培養(yǎng)100條線蟲［9］。在實驗室條件下易于大量培養(yǎng)、繁殖。此外，與細菌、細胞一樣，線蟲可以在液氮或－80℃冰箱中長期冷凍保存［1］。線蟲身體透明，在普通顯微鏡下下易于觀察其體內(nèi)結構及生長發(fā)育過程。此外，還可以通過體內(nèi)熒光標記，利用熒光顯微鏡直觀地追蹤某些生物過程，如軸突生長、胚胎發(fā)生、脂肪代謝等［10］。線蟲的生長和繁殖速度很快，其生長發(fā)育速度受生長環(huán)境溫度的調(diào)控。在25℃培養(yǎng)條件下，從蟲卵長至成蟲需要2.5 d。20℃培養(yǎng)條件下，需要3.5 d發(fā)育為成蟲。15℃培養(yǎng)條件下，則需要6 d才能發(fā)育為成蟲。在最適培養(yǎng)溫度(20℃)下，成蟲的繁殖能力最強，通過自體受精，一次可以產(chǎn)生300多個后代［11］。線蟲具有5對常染色體和1對性染色體，遺傳背景簡單。線蟲的全基因組測序早在1998年業(yè)已完成。目前，已建成多個數(shù)據(jù)平臺，如worm base、worm book實現(xiàn)了遺傳信息的共享。2000年，Arhinger實驗室完成了線蟲全基因組的RNAi文庫，使得線蟲成了第一個在全基因組范圍內(nèi)進行功能缺失分析的多細胞生物。

3 人類基因和線蟲基因間的保守性

在線蟲中建立人類疾病的模型的一個重要依據(jù)是藥物靶點在兩個物種之間是否具一定的保守性。通過生物信息學研究，我們發(fā)現(xiàn)60% ～80%的人類基因在線蟲體內(nèi)都具有同源直系物［12］。除了同源基因外，目前還發(fā)現(xiàn)許多重要的信號通路在線蟲和人類中也具有一定的保守性，如細胞增殖相關的RAS 信號［13］、Wnt信號［14］，免疫相關的 TGF-β 信號、Toll信號、MAPK 信號［15－17］。

根據(jù)Ortho Disease數(shù)據(jù)庫的分析結果顯示，在2，466個人類疾病相關基因中，小鼠中有1，354個同源基因，果蠅有724個，線蟲有533個，大腸桿菌中有153個［18］。在眾多模式生物中，選擇大鼠、小鼠、靈長類等作為實驗動物往往導致實驗效率低下、實驗成本昂貴、可操作性有限的局面。選擇細菌、酵母、體外細胞進行實驗又可能造成實驗結果與人類疾病相關性差的結果。相比之下，利用線蟲進行實驗是一個快速的、有效的、經(jīng)濟的、高通量技術。我們可以基于一個完整的生命體進行系統(tǒng)研究，而非僅僅局限于藥物對某個細胞系或某個受體蛋白的作用。

4 線蟲在藥物發(fā)現(xiàn)中的應用

4.1 人類疾病在線蟲中的模型建立

利用線蟲進行藥物篩選的第一步就是建立人類疾病的線蟲模型，包括確定疾病相關基因在線蟲體內(nèi)的同源基因，了解同源基因在線蟲體內(nèi)的相關功能。一般來說，有三種方式可以建立人類疾病的線蟲模型:1)敲除(突變體)、敲低(RNAi)或增強線蟲中人類疾病相關基因的同源直系基因并考察該基因對表型的影響，即建立突變體模型。2)通過藥物或化合物誘導，線蟲中建立一個與疾病相關或相似的生物過程，即化學誘導模型。3)在線蟲中表達人類基因并產(chǎn)生一些疾病相關的表型，即建立轉基因動物模型。

4.2 人類疾病的線蟲模型

糖尿病模型:線蟲體內(nèi)daf-2基因與哺乳動物體內(nèi)的胰島素樣生長因子IGFs受體家族同源，該基因調(diào)控了線蟲的代謝、生長及壽命［19］。DevGen公司通過daf-2基因突變株建立了2型糖尿病藥物高通量篩選的線蟲模型。目前己從insulin信號通路對相關藥物進行篩選研究［20］。

衰老模型:常用的線蟲衰老模型有daf-2突變株、daf-16突變株以及原始野生型N2［21］。daf-2基因突變導致DAF-2受體型酪氨酸激酶結構變異，相比野生型該突變株的壽命更長。daf-16作為一個重要的轉錄因子，促進體內(nèi)壽命相關基因的表達，daf-16的突變導致線蟲的壽命比N2野生株短。利用線蟲模型，高通量的篩選抗衰老藥物已經(jīng)有近30年的歷史，并取得了豐碩的研究成果。

阿爾茲海默癥(AD)模型:將人源β-淀粉樣蛋白轉入線蟲中異源表達，建立AD的轉基因線蟲模型。結果表明，在轉基因模型中可以誘導產(chǎn)生淀粉樣蛋白沉淀物，并引起線蟲麻痹。該轉基因模型可以有效的用于β-淀粉樣蛋白抑制劑的高通量篩選［22］。

帕金森病模型:包括通過異源過表達人α-突觸核蛋白建立轉基因模型［23］和通過神經(jīng)毒素1-甲基-4-苯基吡啶(MPP)建立藥物誘導模型［24］，兩種模型分別導致線蟲神經(jīng)元的損傷和多巴胺能神經(jīng)元的選擇性凋亡。此外還有氧化應激及其金屬離子失紊態(tài)相關模型［25］。

亨廷頓病模型:通過注射人源亨廷頓蛋白N末端基因建立轉基因模型，導致線蟲的神經(jīng)細胞凋亡，并且，隨著時間的延長，神經(jīng)細胞蛋白沉積增多［26］。目前，使用此模型篩選到的光輝霉素和氯化鋰已經(jīng)經(jīng)過FDA批準，成為治療該疾病的有效藥物［12］。

線蟲的抑郁模型:MOD-5是哺乳動物中血清素重吸收轉運體(SERT)的同源直系物，通過抗抑郁藥物氟西汀阻斷MOD-5可以建立線蟲的化學誘變模型。氟西汀作用于MOD-5后，可以增加突觸前5-羥色胺的濃度，刺激線蟲進食行為，并增加排卵量。而在MOD-5突變體中，氟西汀的這種作用消失。通過該模型，確定了抗抑郁藥物氟西汀的作用靶點就是SERT，并且證明線蟲模型也能夠用于抗抑郁藥物的篩選［27］。

抗菌模型:線蟲還經(jīng)常被用于宿主-病原體的研究中。線蟲可以被一些病原體殺死，如假單胞菌、粘質沙雷菌、腸炎沙門菌亞屬、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌等。由于，宿主-編碼的防御系統(tǒng)在進化上是保守的，因此涉及其中的有害機制可以用于研究涉及這些病原體的人類疾?。?8］。

除此之外，近年來線蟲還被應用到多個生理系統(tǒng)疾病的研究中，例如:癌癥及其抗癌藥物，空間障礙及衰老，酒精成癮，空氣微粒體毒性等［29－32］。

5 線蟲在藥物作用研究中的應用

盡管線蟲是一個簡單的模式生物，但是它具有精密完善的系統(tǒng)結構。如圖1［38］所示，藥物作用于線蟲時，首先，藥物需要進入線蟲體內(nèi)(通過皮膚擴散，或通過攝取進入腸腔)。藥物需要為生物體可用的，才能夠穿過腸細胞膜并到達靶組織。到達靶向位置后，藥物需要作用于其初始靶點，并克服胞內(nèi)和組織內(nèi)的自身調(diào)節(jié)，發(fā)揮藥效。換句話說，只有在體內(nèi)具有活性的物質才能在線蟲體內(nèi)引發(fā)反應。因此，利用線蟲進行整體動物實驗，可以用于藥物對其作用靶點機制的研究，以及增加對藥物對多個靶點協(xié)同作用的研究。目前，基于線蟲的藥物作用靶點研究方法主要有以下兩類:

正向遺傳學(forward genetics):正向遺傳學是一個從表型到基因型的基本研究策略。正向遺傳學的基礎是通過誘變劑誘導線蟲DNA的隨機突變，篩選預期表型的突變體，通過單核苷酸多態(tài)性(SNP)等方法對突變基因的染色體進行定位，并獲得突變基因的序列，從而確定表型和基因型的關系。這種研究方法可以檢測突變體對某個藥物/化合物的是否有超敏或脫敏的現(xiàn)象，從而探索藥物的作用機制以及作用靶點?？挂钟羲幬锓魍〉淖饔冒悬c就是利用MOD-5(人類血清素重吸收轉運體的同源基因)突變體對氟西汀作用脫敏的現(xiàn)象，確定MOD-5是氟西汀的一個作用靶點，并由此推斷人類SERT基因可能是氟西汀治療抑郁的重要靶點。

圖1 藥物進入線蟲體內(nèi)的路徑Fig．1 Drug entry route into C．elegans

反向遺傳學(reverse genetics):與正向遺傳學相反，反向遺傳學是從基因型到表型的研究策略。反向遺傳學的基礎是觀察某個基因失活后生物體表型的變化。常用的反向遺傳學方法有:一是根據(jù)研究需求，建立不同基因的突變體［33］。根據(jù)Caenorhabditis Genetics Center(CGC)的記錄，目前CGC已經(jīng)保存并可以提供1萬多種線蟲的突變體，包括有人類疾病基因同源基因的突變體線蟲，以及同一基因的多種突變體。根據(jù)研究的需要，選擇不同的突變體，即可考察該突變基因的功能以及確定藥物的作用靶點。另一類反向遺傳學的研究方法是RNA干擾(RNAi)，RNAi是一個在線蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象，用于降低目標基因的表達。RNAi介導的基因敲除操作簡單，可以通過直接將線蟲浸潤在含有dsRNA的溶液或者用可以產(chǎn)生dsDNA的細菌喂養(yǎng)線蟲。在線蟲中導入RNAi需要至少100 bp長的dsRNA。在哺乳動物系統(tǒng)中，只有短于22個核苷酸的dsRNA(通常成為small interfering RNA，siRNA)分子可以使用，以免引起干擾素反應或非特異性的抑制蛋白質生成。這兩種副反應在線蟲體內(nèi)都是不存在的。線蟲對長鏈dsRNA的兼容性可以通過作用于靶基因的多個位點來提高RNAi的效率。當線蟲暴露于dsRNA后，靶基因的表達很快被降低，導致線蟲出現(xiàn)新的表型。這一過程的發(fā)生需要多少時間，取決于不同的靶基因以及編碼蛋白的周轉率。RNAi可以在線蟲的任意生命周期中被導入，并且可以通過持續(xù)的使用可以產(chǎn)生相關dsRNA的細菌喂養(yǎng)線蟲來將RNAi誘導的表型維持很多代。由于在線蟲上做RNAi實驗操作簡單，并且已經(jīng)有豐富基因組數(shù)據(jù)做支持，這促進了一個新的高通量的方法，即全基因組RNA干擾(genome-wide RNAi)。在藥物作用機制的研究中，我們可以使用線蟲，在完整的生命體中進行藥物靶點的自動化/半自動化高效篩選。

6 線蟲在中藥提取物藥理作用研究中的應用

中藥及其中藥復方制劑以其成分復雜、作用全面等特點而不同于西藥，以“多成分、多靶點”而凸顯自己的優(yōu)勢。同時也正是由于復方提取物的復雜性且只能口服給藥，并進行整體動物實驗，制約了對其作用機制的研究。分子機制研究須依賴于細胞水平的實驗，但中藥提取物體外給藥難以排除非特異性成分的影響，由此而使研究進入到兩難境地。

“血清藥理學”方法就是為了使中藥提取物進行體外實驗而產(chǎn)生的。旨在利用胃腸作為過濾屏障，直接采集口服中藥提取物后的血清進行體外實驗，以此來探討其藥物的作用機制。但是這一技術有兩個不足:一是對血清含藥量不易控制;二是對所含藥物成分不清。如此影響了其后續(xù)機制的深入探討和對研究結果的準確判定。線蟲是獨立的個體，且體內(nèi)結構簡單，易于觀察。因此，在施以中藥提取物的同時，就可以直接檢測體內(nèi)的分子水平的變化。即保證了中藥提取物的復雜特性，同時又利于對其作用的觀察和研究，是一個較為理想的模式生物。例如，我們可以利用分子生物技術構建相關靶標蛋白熒光表達的轉基因線蟲模型，通過其熒光蛋白表達與否可以直接觀察到受試中藥的靶標作用。這是一種較為理想的研究中藥的技術。目前，國內(nèi)以線蟲來觀察研究中藥提取物的工作開展得還十分有限，大多集中在對中藥安全性及其抗衰老延長線蟲壽命等方面［34－36］，關于線蟲在中藥研究中的優(yōu)勢也有一定的探討［37］。未來，關于線蟲在中藥提取物中的研究方法學的考察及其對該技術的特點和規(guī)律的研究等有待于加強。

7 小結

在生物醫(yī)學研究領域，我們對模式生物線蟲的研究已經(jīng)積累了豐富的研究經(jīng)驗，并取得了卓越的科研成果。然而我們也必須認識到線蟲作為實驗動物模型也有一定局限性:首先，線蟲作為一個無脊椎低等生物，我們很難保證在藥物在線蟲模型和人體中具有一致的安全性和有效性。其次，線蟲的身體結構簡單，沒有心臟、呼吸系統(tǒng)、特異免疫系統(tǒng)，因此有一些人類疾病很難在線蟲中建立疾病模型。由于線蟲和人類的種間差距較大，線蟲模型不適用于藥物安全性評價或某些特定疾病的相關研究，但是，這并不代表線蟲模型不能用于藥物研究。事實上，在藥物的早期研究中，線蟲迅速提供一些基礎機制的線索，如某個特定基因的功能或藥物的某個靶點。特別是當確定了某個疾病的分子基礎后，可以針對某一靶點利用線蟲進行藥物的高通量快速篩查。線蟲模型最重要的意義在于，線蟲搭起了體內(nèi)(in vivo)實驗和體外(in vitro)實驗中間的橋梁，在整體動物水平實現(xiàn)了高通量的、可靠的實驗研究。這一點也是中藥提取物研究的最理想之處。

［1］ Brenner S．The genetics of Caenorhabditis elegans［J］．Genetics，1974，77(1):71－94．

［2］ Sulston J．E． NeuronalCellLineagesin the Nematode Caenorhabditis-Elegans［C］．Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology，1983，48:443－452．

［3］ Sulston J．E．，H．R．Horvitz．Post-Embryonic Cell Lineages of Nematode，Caenorhabditis-Elegans［J］．Developmental Biology，1977，56(1):110－156．

［4］ Sulston J．E．，E．Schierenberg，J．G．White，et al．The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans［J］．Dev Biol，1983，100(1):64 －119．

［5］ Fire A．，Xu S．Q．，Montgomery M．K．，et al．Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans［J］．Nature，1998，391(6669):806－811．

［6］ Consortium C．e．S．Genome sequence of the nematode C．elegans:a platform for investigating biology［J］．Science，1998，282(5396):2012－2018．

［7］ Riddle D．L．，Blumenthal T．，Meyer B．J．，et al．C．elegans II［J］．Trends in Cell Biology，1998，8(2):92．

［8］ T．Stiernagle，Maintenance of C．elegans．C．elegans:A practical approach［M］．UK:Oxford University Press，1999.51－67．

［9］ Simonetta S．H．，Golombek D．A．An automated tracking system for Caenorhabditis elegans locomotor behavior and circadian studies application［J］．Journal of neuroscience methods，2007，161(2):273－280．

［10］ Burns A．R．，Kwok T．C．Y．，Howard A．，et al．Highthroughput screening of small molecules for bioactivity and target identification in Caenorhabditis elegans［J］．Nature Protocols，2006，1(4):1906－1914．

［11］ Silverman G．A．，Luke C．J．，Bhatia S．R．，et al．Modeling Molecular and Cellular Aspects of Human Disease Using the Nematode Caenorhabditis elegans［J］． Pediatric Research，2009，65(1):10－18．

［12］ Voisine C．，Varma H．，Walker N．，et al．Identification of potential therapeutic drugs forhuntington＇sdisease using Caenorhabditis elegans［J］．PLoS One，2007，2(6):e504．

［13］ Blume-Jensen P．，Hunter T．Oncogenic kinase signalling［J］．Nature，2001，411(6835):355－365．

［14］ Janssens N．， JanicotM．， PereraT． TheWnt-dependent signaling pathways as target in oncology drug discovery［J］．Investigational New Drugs，2006，24(4):263 －280．

［15］ Millet A．C．M．，Ewbank J．J．Immunity in Caenorhabditis elegans［J］．Current Opinion in Immunology，2004，16(1):4－9．

［16］ Nicholas H．R．，Hodgkin J．Responses to infection and possible recognition strategies in the innate immune system of Caenorhabditis elegans［J］．Molecular Immunology，2004，41(5):479－493．

［17］ Kurz C．L．，Ewbank J．J．Caenorhabditis elegans:An emerging genetic model for the study of innate immunity［J］．Nature Reviews Genetics，2003，4(5):380 －390．

［18］ O ＇Brien K．P．， Westerlund I．， E．L．L． Sonnhammer，OrthoDisease:A database of human disease orthologs［J］．Human Mutation，2004，24(2):112－119．

［19］ Kimura K．D．，Tissenbaum H．A．，Liu Y．X．，et al．daf-2，an insulin receptor-like gene that regulates longevity and diapause in Caenorhabditis elegans［J］．Science，1997，277(5328):942－946．

［20］ O＇Reilly L．P．，Benson J．A．，Cummings E．E．，et al．Worming our way to novel drug discovery with the Caenorhabditis elegans proteostasis network，stress response and insulin-signaling pathways［J］．Expert Opinion on Drug Discovery，2014，9(9):1021－1032．

［21］ Olsen A．，Vantipalli M．C．，Lithgow G．J．Using Caenorhabditis elegans as a Model for Aging and Age-Related Diseases［J］．Understanding and Modulating Aging，2006，1067:120－128．

［22］ Link C． D．， C． elegans models of age-associated neurodegenerative diseases:Lessons from transgenic worm models of Alzheimer’s disease［J］．Experimental gerontology，2006，41(10):1007－1013．

［23］ Lakso M．，Vartiainen S．，Moilanen A．M．，et al．Dopaminergic neuronal loss and motor deficits in Caenorhabditiselegans overexpressing human alpha-synuclein［J］． Journal of Neurochemistry，2003，86(1):165－172．

［24］ Braungart E．，Gerlach M．，Riederer P．，et al．Caenorhabditis elegans MPP+model of Parkinson’s disease for high-throughput drug screenings［J］．Neurodegenerative diseases，2004，1(4 －5):175－183．

［25］ Chege P．M．，McColl G．Caenorhabditis elegans:a model to investigate oxidative stress and metal dyshomeostasis in Parkinson＇s disease［J］．Frontiers in Aging Neuroscience，2014，6．

［26］ Faber P．W．， AlterJ．R．， MacDonaldM．E．， etal．Polyglutamine-mediated dysfunction and apoptotic death of a Caenorhabditis elegans sensory neuron［J］．Proceedings of the National Academy of Sciences，1999，96(1):179 －184．

［27］ Ranganathan R．，Sawin E．R．，Trent C．，et al．Mutations in the Caenorhabditis elegans serotonin reuptake transporter MOD-5 reveal serotonin-dependent and -independent activities of fluoxetine［J］．Journal of Neuroscience，2001，21(16):5871 －5884．

［28］ Sifri C．D．，Begun J．，F(xiàn)．M．Ausubel．The worm has turnedmicrobial virulence modeled in Caenorhabditis elegans［J］．Trends in Microbiology，2005，13(3):119－127．

［29］ Kobetl R．A．，Pan X．P．，Zhang B．H．，et al．Caenorhabditis elegans:A Model System for Anti-Cancer Drug Discovery and Therapeutic Target Identification［J］． Biomolecules ＆Therapeutics，2014，22(5):371 －383．

［30］ Honda Y．，Honda S．，Narici M．，et al．Spaceflight and Ageing:Reflecting on Caenorhabditis elegans in Space［J］．Gerontology，2014，60(2):138－142．

［31］ Zhu G．，Zhang F．，W．Li．Nematodes feel a craving-Using Caenorhabditis elegans as a model to study alcohol addiction［J］．Neuroscience Bulletin，2014，30(4):595－600．

［32］ Choi J．，Tsyusko O．V．，Unrine J．M．，et al．A micro-sized model for the in vivo study of nanoparticle toxicity:what has Caenorhabditis elegans taught us? ［J］． Environmental Chemistry，2014，11(3):227－246．

［33］ Liu L．X．，Spoerke J．M．，Mulligan E．L．，et al．Highthroughput isolation of Caenorhabditis elegans deletion mutants［J］．Genome Research，1999，9(9):859 －867．

［34］ 李貞景，張金陽，王昌祿，等．4種有毒中藥對秀麗隱桿線蟲致死率和產(chǎn)卵數(shù)的影響［J］．毒理學雜志，2013，4:017．

［35］ 肖家軍，陸媚，馬勝利，等．西藏紅景天提取物延長線蟲壽命和抗氧化活性探索［J］．天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2013，25(8):1033－1036．

［36］ 陳中孚，顧惠娟，王玲華，等．三種中藥制劑對大腸桿菌 SOS應答的抑制作用及對線蟲壽命的影響［J］．癌變．畸變．突變，1991，3:5．

［37］ 王香明，汪曉燕，高會麗，等．從分子機制研究抗帕金森病中藥的線蟲模型［J］．中國中藥雜志，2010(5):661－663．

［38］ Kaletta T．，Hengartner M．O．Finding function in novel targets:c．elegance as a model organism［J］．Nature Reviews Drug Discovery．2006，5(5):387 －399．