王穎，陳昶瀧，黃緒瓊，夏建川，張建華

·論著·

TPD52基因與原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者預(yù)后相關(guān)性分析

王穎*，陳昶瀧*，黃緒瓊，夏建川，張建華

目的 探索 TPD52 基因在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及與患者預(yù)后的關(guān)系。

癌，肝細(xì)胞；預(yù)后；腫瘤蛋白質(zhì)類；TPD52

原發(fā)性肝癌，是我國最常見的惡性腫瘤之一，有著起病隱匿、惡性程度高、易復(fù)發(fā)、病死率高等特點(diǎn)［1］。原發(fā)性肝癌中大約 75% 屬于肝細(xì)胞型肝癌（HCC）［2］，其發(fā)生受環(huán)境和遺傳因素共同影響，遺傳因素決定了個體的肝癌易感性，相關(guān)基因的研究對肝癌的診斷和預(yù)后評估起到重要作用。

腫瘤蛋白 D52（tumor protein D52，TPD52），是癌蛋白 D52 家族的成員之一，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、增殖、遷移、侵襲［3-4］、DNA 修復(fù)［5-6］等，且與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有著密切關(guān)系，但其與肝癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系尚不明確。本研究通過對 TPD52 基因在HCC 中的表達(dá)及與臨床參數(shù)、患者預(yù)后之間關(guān)系的分析，為肝癌的診療和預(yù)后評估提供新方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本 收集從 2001-2004年在中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院被確診為 HCC 患者的腫瘤組織石蠟切片標(biāo)本 173 例，所有標(biāo)本經(jīng)常規(guī)病理檢查后確診為肝細(xì)胞癌，并進(jìn)行病理分級。所選取的病例術(shù)前均未接受放療及化療，其中男 138 例，女35 例。同時收集 2012-2015年手術(shù)切除的33 份新鮮腫瘤組織標(biāo)本及其相對應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本，標(biāo)本病例均確診為 HCC。兩組病例一般資料無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。所有患者的臨床分期是根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC）及國際抗癌聯(lián)盟（UICC）推薦的tumor-nodes-metastasis（TNM）分期標(biāo)準(zhǔn)［7］進(jìn)行確定。本研究獲得中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署了知情同意書。

1.1.2 試劑與儀器 Bio-Rad CFX96 型熒光定量PCR 儀為新加坡 Bio-Rad 公司產(chǎn)品；Eclipse80i型高級研究型顯微鏡為日本尼康公司產(chǎn)品；RPMI 1640 培養(yǎng)基購自美國 Gibco 公司；RNAlater 溶液購自美國 Thermo Fisher Scientific 公司；GoScript?逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量 PCR 試劑 SYBR Green master mix 均購自美國 Promega 公司；抗 TPD52抗體購自北京博奧森公司；生物素標(biāo)記二抗GK500705 購自上海 Gene Tech 公司。

1.2 方法

1.2.1 熒光實(shí)時定量 RT-PCR 新鮮組織切下后置于無血清 RPMI 1640 培養(yǎng)基中洗去血漬，剪成約 0.5 cm × 0.5 cm × 0.5 cm 小塊置于 RNAlater溶液中 4 ℃ 過夜，于 -80 ℃ 冰箱保存以備用。取適量組織標(biāo)本充分剪碎并研磨，加氯仿，冰上靜置5 min 后離心取上清，加異丙醇，冰上靜置 10 min后棄上清，加 75% 乙醇重懸沉淀后棄上清，加入無 RNase 水溶解得到 RNA。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將所得 RNA 合成逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 cDNA。已合成的cDNA、熒光定量 PCR 試劑及去離子水分別與TPD52 引物、GAPDH 引物（序列來源于參考文獻(xiàn)［4，8］）形成混合物，并根據(jù)試劑盒說明書設(shè)定擴(kuò)增程序后對混合物進(jìn)行熒光實(shí)時定量 RT-PCR 擴(kuò)增，由此檢測肝癌組織和對于癌旁組織中 TPD52和 GAPDH 的 mRNA 水平。以 GAPDH 的mRNA 水平為內(nèi)參，采用比較循環(huán)閾值（2-ΔΔCt）方法分別計(jì)算肝癌組織和癌旁組織中 TPD52 基因mRNA 的相對表達(dá)水平。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色法 石蠟切片利用免疫組織化學(xué)染色法，檢測 TPD52 蛋白在肝癌組織中的表達(dá)水平。3 μm 連續(xù)切片后采用二甲苯 30 min脫蠟，經(jīng) 100%、95%、90%、80%、75% 梯度酒精水化，以 pH 8.0 的 EDTA 抗原修復(fù)液微波高火修復(fù) 10 min 后轉(zhuǎn)中低火 15 min，自然冷卻后用3% 雙氧水孵育 10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物的活性，正常山羊血清室溫封閉 30 min 后，滴加抗TPD52 抗體（稀釋比例 1∶400）于 4 ℃ 冷庫孵育過夜，次日晾至室溫后 PBS 緩沖液沖洗，滴加相應(yīng)的生物素標(biāo)記二抗孵育 30 min，DAB 顯色，蘇木素淺染細(xì)胞核，1% 鹽酸酒精復(fù)染數(shù)秒，經(jīng) 70%、80%、90%、95%、100% 梯度酒精脫水透明后，中性樹膠封片。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果評定 所有染色結(jié)果由兩位病理醫(yī)生獨(dú)立以盲法觀察確定，以細(xì)胞呈清晰棕色或棕褐色為陽性。高倍鏡（× 400）下隨機(jī)選取 4 個不同視野，計(jì)算細(xì)胞總數(shù)及陽性細(xì)胞數(shù)，按陽性細(xì)胞所占的百分比計(jì)分：陽性細(xì)胞率 ≤ 5%為 0 分，陽性細(xì)胞率 ＞ 5% 且 ≤ 25% 為 1 分，陽性細(xì)胞率 ＞ 25% 且 ≤ 50% 為 2 分，陽性細(xì)胞率 ＞ 50% 為 3 分；同時，根據(jù)染色的強(qiáng)弱程度計(jì)分：陰性染色為 0 分，弱染色為 1 分，中等強(qiáng)度染色為 2 分，強(qiáng)染色為 3 分。最終根據(jù)兩者的乘積確定該組織標(biāo)本的免疫組化評分值：0～1分為陰性，2～3分為弱陽性，4～6分為中度陽性，＞ 6 分為強(qiáng)陽性。按照評分結(jié)果將 TPD52 表達(dá)定義為低表達(dá)組（陰性及弱陽性）及高表達(dá)組（中度陽性及強(qiáng)陽性）。

1.2.4 隨訪 對所選擇病例進(jìn)行隨訪，術(shù)后前2年每 3 個月隨訪一次，第 3～5年每 6 個月隨訪一次，以后每年隨訪一次直至患者死亡或因其他原因失訪。隨訪主要了解患者當(dāng)前是否生存，若患者已死亡，明確其死亡時間和死亡原因是否與肝癌有關(guān)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，腫瘤組織與癌旁組織的 TPD52 mRNA 表達(dá)水平差異采用秩和檢驗(yàn)，TPD52 蛋白表達(dá)水平和臨床指標(biāo)間的關(guān)系采用卡方檢驗(yàn)及 Pearson's 等級相關(guān)分析，TPD52 蛋白表達(dá)水平與患者生存關(guān)系分析采用Kaplan-Meier方法及 log-rank 檢驗(yàn)，雙側(cè)檢驗(yàn)P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TPD52 mRNA 在肝癌組織及配對癌旁組織中的表達(dá)

通過熒光實(shí)時定量 RT-PCR 檢測，發(fā)現(xiàn)肝癌組織中 TPD52 基因 mRNA 表達(dá)水平明顯低于癌旁組織，且 P ＜ 0.001，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1）。

2.2 TPD52 蛋白在肝癌組織中的表達(dá)

免疫組化染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在 173 例肝癌病例中，98 例（56.6%）肝癌組織中的 TPD52 蛋白表達(dá)下調(diào)，75 例（43.4%）肝癌組織中的 TPD52 蛋白表達(dá)上調(diào)。TPD52 陽性染色主要位于細(xì)胞胞漿，呈棕色或棕褐色，主要分布在癌旁、正常組織及TNM 分期較低的肝癌組織中。肝癌組織中 TPD52表達(dá)通常較低，而癌旁的正常組織通常為高表達(dá)（圖2），TNM 分期越高，TPD52 表達(dá)越低（圖3）。

圖2 肝癌組織（A）及癌旁組織（B）TPD52 蛋白的表達(dá)（× 200）Figure 2 TPD52 protein expression levels in tumor （A） and non-tumor （B） tissue （× 200）

圖3 TPD52 在不同 TNM 分期的肝癌組織中的表達(dá)（A：I 期，× 200；B：II 期，× 200；C：III 期，× 200）Figure 3 TPD52 protein expression in tumor tissues according to TNM stages （A： I TNM stage， × 200； B： II TNM stage， × 200； C：III TNM stage， × 200）

2.3 臨床病理特征與 TPD52 蛋白表達(dá)及患者預(yù)后的關(guān)系

根據(jù)免疫組化染色強(qiáng)度評分結(jié)果分為 TPD52高表達(dá)組和低表達(dá)組。卡方檢驗(yàn)表明，TPD52 在肝癌組織中的表達(dá)在患者年齡、性別、HBV 感染與否、腫瘤大小、腫瘤是否多發(fā)、是否肝硬化、AFP 高低、病理分級等中的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但TPD52 高表達(dá)與低的 TNM 分期相關(guān)（P = 0.023）。生存分析表明，腫瘤大小、腫瘤是否多發(fā)、TNM分期與患者 5年生存率相關(guān)（P = 0.002，＜0.001，＜ 0.001），見表1。

2.4 TPD52 表達(dá)與患者預(yù)后相關(guān)性分析

2.4.1 總生存分析 如圖4 所示，173 例患者的1、3、5年總生存率分別為 86.1%、71.4% 和51.9%。TPD52 高表達(dá)組和低表達(dá)組的患者 5年總生存率分別為 64.3% 和 42.2%。TPD52 低表達(dá)組患者的總生存率及無病進(jìn)展生存率均顯著低于TPD52 高表達(dá)組患者（P = 0.003，P = 0.013）。

2.4.2 亞群分析

2.4.2.1 TPD52 的表達(dá)對不同腫瘤大小患者生存預(yù)后的影響 如圖5 所示，腫瘤直徑小于 5 cm患者中，TPD52 高表達(dá)組患者總生存率及無病進(jìn)展生存率均較低表達(dá)組的高，且 P 值均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.015，P = 0.023）。但 TPD52 的表達(dá)對腫瘤大于 5 cm 患者的生存預(yù)后的影響無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4.2.2 TPD52 的表達(dá)對腫瘤單發(fā)或多發(fā)患者生存預(yù)后的影響 如圖6 所示，腫瘤單發(fā)的患者中，TPD52 高表達(dá)組總生存率及無病進(jìn)展生存率均較低表達(dá)組的高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.025，P = 0.047）。而腫瘤多發(fā)的患者中，TPD52 高表達(dá)組與低表達(dá)組間總生存率及無病進(jìn)展生存率均無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.4.2.3 TPD52 的表達(dá)對不同 TNM 分期患者生存預(yù)后的影響 如圖7 所示，TNM 分期為 I～I(xiàn)I 期的患者中，TPD52 高表達(dá)組與低表達(dá)組間的患者總生存率及無病進(jìn)展生存率無明顯差異。但TNM 分期為 III 期的患者中，TPD52 高表達(dá)組的患者總生存率及無病進(jìn)展生存率均高于低表達(dá)組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.018，P = 0.034）。

表1 TPD52 基因表達(dá)水平與肝癌各臨床病理特征的關(guān)系Table 1 Relationship between TPD52 expression and clinicopathological features of HCC patients

圖4 根據(jù) TPD52 表達(dá)水平對 173 例患者進(jìn)行的生存分析（A：總生存率，P = 0.003；B：無病進(jìn)展生存率，P = 0.013）Figure 4 Kaplan-Meier survival curves of the 173 HCC patients according to TPD52 expression （A： Overall survival rate， P = 0.003； B： Disease-free survival rate， P = 0.013）

圖5 TPD52 的表達(dá)對腫瘤 ＜ 5 cm 患者生存預(yù)后的影響（A：總生存率，P = 0.015；B：無病進(jìn)展生存率，P = 0.023）Figure 5 The effect of TPD52 expression on the survival of HCC patients with tumor size ＜ 5 cm （A： Overall survival rate， P = 0.015； B： Disease-free survival rate， P = 0.023）

圖6 TPD52 的表達(dá)對腫瘤單發(fā)患者生存預(yù)后的影響（A：總生存率，P = 0.025；B：無病進(jìn)展生存率，P = 0.047）Figure 6 The effect of TPD52 expression on the survival of HCC patients with single tumor （A： Overall survival rate， P = 0.025； B：Disease-free survival rate， P = 0.047）

圖7 TPD52 的表達(dá)對 TNM 分期 III 期患者生存預(yù)后的影響（A：總生存率，P = 0.018；B：無病進(jìn)展生存率，P = 0.034）Figure 7 The effect of TPD52 expression on the survival of HCC patients with III tumor stage （A： Overall survival rate， P = 0.018；B： Disease-free survival rate， P = 0.034）

3 討論

TPD52 基因位于染色體 8q21 位點(diǎn)，編碼一個長約 200 氨基酸殘基的小親水多肽序列，包含一個大約 50 個氨基酸殘基的典型 Coil-coil 基序結(jié)構(gòu)，N 端和 C 端各有一個可能參與調(diào)節(jié)蛋白穩(wěn)定性的 PEST 序列［9-10］。TPD52 基因除了有著 D52家族蛋白最重要的生理功能，即調(diào)節(jié)膜泡運(yùn)輸和胞外分泌，還與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著特殊關(guān)系。有研究發(fā)現(xiàn)，在小細(xì)胞肺癌［11-12］、卵巢癌［13］、乳腺癌［14］、前列腺癌［15］、胰腺癌［16］、多發(fā)性骨髓瘤［17］、伯基特淋巴瘤［18］以及黑色素瘤［19］中 TPD52 的表達(dá)是上調(diào)的，而在腎細(xì)胞癌、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤以及肺癌中的表達(dá)是下調(diào)的［20］。

本初步研究結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，TPD52 在肝癌組織中的表達(dá)下調(diào)，且 TNM 分期越高的組織中 TPD52 表達(dá)量越低，由此提示TPD52 具有抑癌基因的生物學(xué)特性，與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切有關(guān)。相關(guān)臨床參數(shù)分析表明，TPD52 的表達(dá)、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目以及 TNM 分期和患者5年生存率有關(guān)。根據(jù)生存分析，TPD52 高表達(dá)的肝癌患者其總生存期及無病進(jìn)展生存期更長。為了進(jìn)一步證實(shí)腫瘤大小、腫瘤多發(fā)性和 TNM 分期對患者預(yù)后的影響是否與 TPD52 的表達(dá)有關(guān)，我們將 173 例病例分亞群作生存分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤直徑小于 5 cm、腫瘤單發(fā)或 TNM 分期 III 期的患者的 TPD52 高表達(dá)能明顯延長總生存期及無病進(jìn)展生存期。結(jié)果表明，TPD52 基因的表達(dá)，與肝癌患者的生存密切相關(guān)，提示 TPD52 基因可作為肝癌患者診斷和預(yù)后評估的指標(biāo)。

目前，TPD52 的相關(guān)研究表明，TPD52 是通過激活蛋白激酶 B/Akt 通路來參與前列腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移［21-22］；在肝癌的研究中發(fā)現(xiàn)，TPD52 mRNA 的表達(dá)是下調(diào)的［20］；TPD52 的高表達(dá)能提高子宮內(nèi)膜瘤患者的總生存期和無病進(jìn)展生存期［23］，同時也是卵巢癌患者的一個良性預(yù)后指標(biāo)［24］，這與本研究結(jié)果一致。

綜上所述，TPD52 在肝癌中的表達(dá)水平是下調(diào)的，且 TPD52 高表達(dá)的患者比低表達(dá)的患者有更長的總生存期和無病進(jìn)展生存期，可作為原發(fā)性肝癌的獨(dú)立預(yù)后因素。提示 TPD52 基因可作為肝癌患者診斷和預(yù)后評估的指標(biāo)。但關(guān)于 TPD52 在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的分子作用機(jī)制，仍需更深入的研究去探索，這將為肝癌的靶向治療和預(yù)后評估提供新的方法。

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Methods Real-time quantitative PCR was performed in 33 paired clinical samples （tumor tissues and matched adjacent non-tumor liver tissues） from patients with HCC to determine their TPD52 mRNA levels. The TPD52 expression levels in 173 HCC surgical specimens were examined by immunohistochemistry.

Results TPD52 mRNA expression was significantly lower in the tumor tissues than that in the matched adjacent non-tumor liver tissues （P ＜ 0.001）. In the surgical specimens， TPD52 protein expression was lower in tumor tissue than that in the paraneoplastic tissue， and its protein expression shows significantly negative correlation with the TNM stage of the tumor （P = 0.023）. The overall survival and disease-free survival rates were significantly better in patients with high TPD52 expression when compared with those having low TPD52 expression （P = 0.003 and P = 0.013， respectively）. In subgroup analysis， higher TPD52 expression indicated significantly better overall survival and disease-free survival in patients with tumor ＜ 5cm， single tumor or III TNM stage （P = 0.015，P = 0.025， P = 0.018 and P = 0.023， P = 0.047， P = 0.034， respectively）.

Conclusion Lower TPD52 expression is highly correlated with the development and progression of HCC， and represents an independent prognostic factor for the survival of the patients. TPD52 could be a novel prognostic biomarker and molecular therapy target for HCC.

Analysis of the correlation between TPD52 expression and prognosis of patients with primary hepatocellular carcinoma

WANG Ying， CHEN Chang-long， HUANG Xu-qiong， XIA Jian-chuan， ZHANG Jian-hua

Objective To explore the gene of tumor protein D52 （TPD52） expression and its relationship with prognosis in patients with primary hepatocellular carcinoma （HCC）.

Carcinoma， hepatocellular；Prognosis；Neoplasm proteins；TPD52

s： ZHANG Jian-hua， Email： zhangjh1962@hotmail.com； XIA Jian-chuan， Email： xiajch@sysucc.org.cn

10.3969/j.issn.1673-713X.2015.06.009

510310 廣州，廣東藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院（王穎、黃緒瓊）；510080 廣州，中山大學(xué)腫瘤防治中心華南腫瘤學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（陳昶瀧、夏建川）；510006 廣州中醫(yī)藥大學(xué)公共衛(wèi)生事業(yè)管理教研室（張建華）

張建華，Email：zhangjh1962@hot.mail；夏建川，Email：xiajch@sysucc.org.cn

2015-10-19

*同為第一作者

方法 熒光定量 RT-PCR 檢測 33 對肝癌組織及其對應(yīng)的癌旁組織中 TPD52 mRNA 表達(dá)水平；免疫組化檢測 173 例肝癌石蠟標(biāo)本中 TPD52 蛋白表達(dá)情況。

結(jié)果 肝癌組織中 TPD52 mRNA 表達(dá)水平較癌旁組織低（P ＜ 0.001）；肝癌組織 TPD52 蛋白表達(dá)水平低于癌旁組織，且其表達(dá)水平與 TNM 分期存在負(fù)相關(guān)（P = 0.023）；TPD52 高表達(dá)的患者較低表達(dá)的患者預(yù)后好（P = 0.003，P = 0.013），且能明顯延長腫瘤小于 5 cm、腫瘤單發(fā)或 TNM分期為 III 期的患者的總生存期（P = 0.015，P = 0.025，P = 0.018）和無病進(jìn)展生存期（P = 0.023，P = 0.047，P = 0.034）。結(jié)論 TPD52 低表達(dá)與原發(fā)性肝癌的發(fā)生發(fā)展有高度相關(guān)性，是肝癌的獨(dú)立預(yù)后因素。

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2015, 10(6):507-513

Author Affiliations： College of Public Health， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510310， China （WANG Ying，HUANG Xu-qiong）； State Key Laboratory of Oncology in South China， Sun Yat-Sen University Cancer Center， Guangzhou 510080，China （CHEN Chang-long， XIA Jian-chuan）； Department of Health Service Management， Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou 510006， China （ZHANG Jian-hua）

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2015, 10(6):507-513