朱華英，朱麗，徐玲娣，陳廷美，劉頌平

·論著·

Th17細(xì)胞相關(guān)因子在子癇前期和正常妊娠孕婦外周血和胎盤(pán)中表達(dá)量的對(duì)比

朱華英，朱麗，徐玲娣，陳廷美，劉頌平

目的 通過(guò)對(duì)子癇前期及正常妊娠的孕婦外周血及胎盤(pán)組織中 Th17 細(xì)胞相關(guān)因子 IL-17、IL-21、IL-22、HLA-G 及RORc 表達(dá)量的檢測(cè)以及 miRNA-21 相對(duì)表達(dá)量的比較，探討 Th17 細(xì)胞相關(guān)因子以及 miRNA-21 在子癇前期發(fā)病中的作用。

方法 選取 2012年3月至 2014年5月鎮(zhèn)江婦幼保健院的 40 例孕婦為研究對(duì)象，其中子癇前期孕婦 20 例，正常孕婦 20 例，采用流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)子癇前期組和正常對(duì)照組外周血中 Th17 細(xì)胞的水平，采用實(shí)時(shí)定量 PCR 法檢測(cè)外周血和胎盤(pán)組織中 Th17 細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子 IL-17、IL-21、IL-22、HLA-G、RORc 的表達(dá)量和相對(duì)表達(dá)量，采用實(shí)時(shí)定量 PCR 法檢測(cè)胎盤(pán)組織中 miRNA-21 的相對(duì)表達(dá)量。

結(jié)果 初步證實(shí)子癇前期患者和正常妊娠女性外周血Th17 細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子 IL-17、IL-21、IL-22、HLA-G、RORc 水平之間存在差異，子癇前期患者和正常妊娠女性胎盤(pán)組織中 Th17 細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子 IL-17、IL-21、IL-22、RORc、HLA-G 水平存在差異。⑴子癇前期患者的 IL-17、IL-21、IL-22的相對(duì)表達(dá)量明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。⑵子癇前期組的 HLA-G、RORc 的相對(duì)表達(dá)量明顯低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。⑶子癇前期組的 miRNA-21 的相對(duì)表達(dá)量明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。⑷各項(xiàng)指標(biāo)之間及各檢測(cè)指標(biāo)與臨床指標(biāo)間存在相關(guān)性。

結(jié)論 Th17 細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子 IL-17、IL-21、IL-22、HLA-G、RORc 水平在子癇前期的發(fā)病過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用，通過(guò)對(duì)相關(guān)指標(biāo)的監(jiān)測(cè)可能預(yù)測(cè)子癇前期的發(fā)生和監(jiān)測(cè)病情變化，阻斷這一途徑就有可能有效預(yù)防和治療子癇前期。

子癇前期；Th17 細(xì)胞；實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)

懷孕前血壓正常的孕婦在妊娠 20 周以后出現(xiàn)高血壓、蛋白尿的一類(lèi)免疫系統(tǒng)疾病稱為子癇前期［1］。子癇前期可伴有全身多臟器的損害，嚴(yán)重者出現(xiàn)胎盤(pán)早剝，彌漫性血管內(nèi)凝血，甚至死亡，母嬰健康受到嚴(yán)重影響［2］。在全球范圍內(nèi)，有 5%～14% 的孕婦患有子癇前期。在發(fā)展中國(guó)家中，子癇前期的發(fā)病率也高達(dá) 4%～18%［3］。子癇前期也成為孕產(chǎn)婦和圍生兒發(fā)病及死亡的主要原因之一［4］。有報(bào)道稱 Th17 細(xì)胞在免疫調(diào)控方面具有重要的研究基礎(chǔ)和臨床應(yīng)用價(jià)值［5-6］。同時(shí) miRNA 家族可能在促進(jìn)子癇前期的發(fā)病方面“功不可沒(méi)”［7-8］。但目前子癇前期的發(fā)病機(jī)制尚未闡明。所以本文針對(duì) Th17 細(xì)胞分泌的 IL-17、IL-21、IL-22、RORc 以及 HLA-G 進(jìn)行 PCR 定量檢測(cè)，同時(shí)對(duì) miRNA-21也進(jìn)行了檢測(cè)，希望從這些結(jié)果對(duì)比中找到子癇前期發(fā)病的原因，為未來(lái)子癇前期的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象和材料

選取 2012年3月至 2014年5月鎮(zhèn)江婦幼保健院的 40 例孕婦為研究對(duì)象，其中子癇前期組孕婦 20 例（年齡：28.5 ± 2.2 歲），正常對(duì)照組孕婦 20 例（年齡：27.85 ± 3.0 歲）。兩組孕產(chǎn)婦孕前均無(wú)高血壓、心臟病、腎病、糖尿病、血小板減少等病史。子癇前期確診標(biāo)準(zhǔn)參照《婦產(chǎn)科學(xué)》［9］：BP ≥ 160/110 mmHg（1 mmHg = 0.133 kPa）；尿蛋白 ≥ 2.0 g/24 h 或定性試驗(yàn) ≥（++）；血清肌酐 ＞106μmol/L，除非以前就已有升高；血小板 ＜ 100 × 109/L；毛細(xì)血管病性溶血（LDH 升高）；ALT 或AST 升高；持續(xù)性頭痛或其他大腦或視覺(jué)障礙；持續(xù)性上腹痛。詳細(xì)記錄孕產(chǎn)史、自覺(jué)癥狀、血壓、尿蛋白、胎盤(pán)重量、新生兒體重、Apgar 評(píng)分等情況。兩組孕婦均簽知情同意書(shū)。

表1 一般臨床資料比較Table 1 Comparison of general clinical data

試劑盒（FP401）購(gòu)自日本 Toyobo 公司；Denley dragon Wellscan MK 3 酶標(biāo)儀為芬蘭Thermo 公司產(chǎn)品；TGL-168 型離心機(jī)為上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集

⑴血標(biāo)本采集：產(chǎn)前采兩組產(chǎn)婦的外周肘靜脈血，取 0.5 ml 注入肝素?zé)o菌管中，8 h 內(nèi)送流式細(xì)胞儀檢驗(yàn) Th17 細(xì)胞百分比。產(chǎn)前采兩組產(chǎn)婦外周肘靜脈血置于無(wú)菌 EP 管中，保存于 -80 ℃ 冰箱待 PCR 成批檢測(cè)。

⑵胎盤(pán)采集：胎盤(pán)娩出后避開(kāi)鈣化灶，于胎盤(pán)正中母體面取下胎盤(pán)組織 l cm × l cm × l cm，經(jīng)無(wú)菌生理鹽水反復(fù)漂洗后置于無(wú)菌 EP 管中，保存于-80 ℃ 冰箱待 PCR 成批檢測(cè)。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩組產(chǎn)婦外周血中以IL-17+為特征的 Th17 細(xì)胞所占百分比 將兩組孕婦的外周血抽取 0.5 ml 注入肝素?zé)o菌管中，標(biāo)記 CD8-FITC 單克隆抗體和 CD3-APC 單克隆抗體，濃度稀釋 1∶200，室溫孵育 15 min。PBS 洗滌 2 次。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)出以 IL17+為特征的 Th17 細(xì)胞在外周血中所占百分比。

1.2.3 PCR 技術(shù)檢測(cè)兩組絨毛和蛻膜中目的基因IL-17、IL-21、RORc 及 HLA-G 表達(dá)量 Tiangen Biotech 提取細(xì)胞總 RNA，按說(shuō)明書(shū)操作。逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，于 -20 ℃ 保存。采用 ABI 7500 PCR系統(tǒng)及 SYBRgreen I 染料法進(jìn)行熒光定量 PCR 檢測(cè)，采用 β-actin 作為內(nèi)參照。所用引物由試劑公司設(shè)計(jì)合成，PCR 條件為 95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，61 ℃ 1 min，共 35 個(gè)循環(huán)。

1.2.4 PCR 技術(shù)檢測(cè)兩組胎盤(pán)組織 miRNA-21的相對(duì)表達(dá)量 Tiangen Biotech 提取胎盤(pán)組織總RNA，按說(shuō)明書(shū)操作。逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，于 -20 ℃保存。采用 U6 RNA 作為內(nèi)參照。所用引物由試劑公司設(shè)計(jì)合成。熒光定量 PCR 條件設(shè)置如下：95 ℃ 預(yù)變性 15 min，95 ℃ 變性 15 s，60 ℃ 退火 60 s，進(jìn)行 35 個(gè)循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 臨床一般資料比較

子癇前期組和正常對(duì)照組孕婦的年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05），但兩組孕婦的孕周及新生兒體重差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。一般臨床資料比較見(jiàn)表1。

2.2 外周血中 Th17 細(xì)胞代表因子 IL-17+水平比較

子癇前期組外周血中 IL-17+表達(dá)水平高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.01），且孕周不影響 IL-17+表達(dá)（P ＜ 0.05）（圖1）。

圖1 正常對(duì)照組和子癇前期組外周血中 Th17 細(xì)胞代表因子 IL-17+流式結(jié)果對(duì)比圖（*P ＜ 0.05）Figure 1 Comparison of IL-17+flow cytometry results between the control group and the pre-eclampsia group （*P ＜0.05）

2.3 胎盤(pán)及外周血中 IL-17、IL-21 表達(dá)量的比較

子癇前期組胎盤(pán)和外周血中 IL-17、IL-21 的表達(dá)量明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01）（圖2）。

圖3 正常對(duì)照組和子癇前期組胎盤(pán)組織中 RORc（A）和 HLA-G（B）表達(dá)量對(duì)比檢測(cè)（**P ＜ 0.01）Figure 3 Comparison of the RORc（A） and HLA-G（B） expression levels in the control group and the pre-eclampsia group （**P ＜0.01）

2.4 胎盤(pán)中 RORc 和 HLA-G 的表達(dá)量的比較

胎盤(pán)中，子癇前期組的 RORc 和 HLA-G 的表達(dá)量明顯低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.01）（圖3）。

2.5 外周血中 Th17 細(xì)胞相關(guān)因子相對(duì)表達(dá)水平比較

子癇前期組外周血中 IL-17、IL-21、IL-22的相對(duì)表達(dá)量明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.001）（圖4）。

2.6 胎盤(pán)組織中 Th17 細(xì)胞相關(guān)因子相對(duì)表達(dá)水平比較

子癇前期組胎盤(pán)中 IL-17 和 IL-21 的表達(dá)量明顯高于正常對(duì)照組，而 RORc 和HLA-G 表達(dá)量則低于正常對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.01）（圖5）。

2.7 胎盤(pán)組織中 miRNA-21 相對(duì)表達(dá)水平比較

圖4 正常對(duì)照組和子癇前期組外周血 Th17 相關(guān)因子IL-17、IL-21 及 IL-22 相對(duì)表達(dá)量對(duì)比圖（***P ＜ 0.001）Figure 4 Comparison of the expression levels of Th17-associated cytokines IL-17， IL-21 and IL-22 in peripheral blood （***P ＜ 0.001）

子癇前期組胎盤(pán)中 miRNA-21 相對(duì)表達(dá)量明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.01）（圖6）。

3 討論

Th17 細(xì)胞是一種新型的 CD4+效應(yīng)細(xì)胞，在自身免疫性疾病和機(jī)體防御反應(yīng)中具有重要的意義。在自身免疫性疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，Th17 細(xì)胞在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、炎癥性腸病等自身免疫性疾病中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［10］。妊娠其實(shí)就是母體對(duì)胎兒的免疫耐受調(diào)節(jié)的炎癥反應(yīng)過(guò)程，因此我們大膽推測(cè) Th17 細(xì)胞在子癇前期的發(fā)病過(guò)程中可能發(fā)揮著一定作用。本文研究結(jié)果顯示Th17 細(xì)胞分泌的 IL-17、IL-21、IL-22、RORc 以及 HLA-G 相關(guān)因子在子癇前期組和正常對(duì)照組之間存在明顯的差異。IL-17、IL-21、IL-22 在子癇前期組中表達(dá)量明顯高于正常對(duì)照組，可以看出子癇前期組 IL-17、IL-21、IL-22 釋放量增加。而RORc 和 HLA-G 在子癇前期組中表達(dá)量明顯低于正常對(duì)照組，可以看出子癇前期組 RORc 和HLA-G 釋放被抑制。通過(guò)研究結(jié)果可以提示子癇前期的發(fā)病與 Th17 細(xì)胞釋放的相關(guān)炎性因子有著很大的關(guān)系。

miRNA 家族是一類(lèi)非編碼 RNA，長(zhǎng)約 22 個(gè)核苷酸，通過(guò)與靶基因 mRNA 的 3' 端非翻譯去相互作用，從而調(diào)控靶基因的表達(dá)，進(jìn)而廣泛作用于生長(zhǎng)發(fā)育、腫瘤發(fā)生、衰老凋亡、免疫應(yīng)答等各種生物學(xué)過(guò)程［7］。本文研究結(jié)果顯示，miRNA-21 在子癇前期組和正常對(duì)照組之間存在差異，miRNA-21在子癇前期組中釋放量增加，說(shuō)明 miRNA-21 與子癇前期的發(fā)病呈正相關(guān)，通過(guò)研究結(jié)果提示miRNA-21 參與子癇前期的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

圖6 正常對(duì)照組和子癇前期組胎盤(pán)組織中 miRNA-21 相對(duì)表達(dá)量對(duì)比圖（**P ＜ 0.01）Figure 6 Comparison of the miRNA-21 expression level in placenta tissues in the control group and pre-eclampsia group（**P ＜ 0.01）

本研究通過(guò)比較正常對(duì)照組和子癇前期組各類(lèi)炎癥因子指標(biāo)數(shù)值，我們發(fā)現(xiàn)在子癇前期患者體內(nèi) IL17、IL21 的表達(dá)增加，ROR、HLA-G 的表達(dá)降低，miRNA-21 的表達(dá)增加。這一結(jié)果對(duì)于臨床檢測(cè)具有指導(dǎo)性意義。說(shuō)明子癇前期組的免疫反應(yīng)比正常對(duì)照組要明顯，并且可能由于 HLA-G 的降低，子癇前期組更容易早產(chǎn)。ROR 表達(dá)的降低以及 miRNA-21 表達(dá)的升高說(shuō)明了子癇前期患者體內(nèi)細(xì)胞致瘤性比正常對(duì)照組大大增加。通過(guò)對(duì)相關(guān)指標(biāo)的監(jiān)測(cè)可預(yù)測(cè)子癇前期的發(fā)生和監(jiān)測(cè)病情變化，阻斷這一途徑從而達(dá)到有效預(yù)防和治療子癇前期的目的。早期診斷和早期干預(yù)將極大提高該病患者的生活質(zhì)量，節(jié)約醫(yī)療資源，其社會(huì)經(jīng)濟(jì)效應(yīng)意義重大深遠(yuǎn)。

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Methods This case-control study was conducted on 40 pregnant women. This comprised 20 women with pre-eclampsia and 20 healthy， age-matched pregnant women （controls）. Expression of IL-17， IL-21， RORc， HLA-G and miRNA-21 in placenta and peripheral blood were measured by flow cytometry （FCM）， ELISA and polymerase chain reaction （PCR）.

Results It was confirmed that patients with pre-eclampsia and normal pregnancy women showed different expressions of IL-17，IL-21， RORc and HLA-G associated with Th17 cells in peripheral blood and placenta as follows. （1） Expressions of IL-17 and IL-21 in patients with pre-eclampsia were higher than those in healthy women. The difference was statistically significant （P ＜ 0.05）. （2）Expressions of RORc and HLA-G in patients with pre-eclampsia were lower than those in healthy women. The difference was statistically significant （P ＜ 0.05）. （3） Expression of miRNA-21 in patients with pre-eclampsia was higher than that in healthy women. The difference was statistically significant （P ＜ 0.05）. （4） These data have correlation with clinical indicators. The difference was statistically significant （P ＜ 0.05）.

Conclusion Expressions of IL-17， IL-21， RORc and HLA-G associated with Th17 cells play an important role in pre-eclampsia. Through monitoring relevant indicators， the occurrence of pre-eclampsia might be predicted and monitored for the change of condition. Through early diagnosis and intervention along with safe and effective treatment， the quality of patient lives with pre-eclampsia could be greatly improved， thus saving more medical resources.

Comparison of expression levels of Th17-associated factors in placenta and peripheral blood between women with pre-eclampsia and healthy women

ZHU Hua-ying， ZHU Li， XU Ling-di， CHEN Ting-mei， LIU Song-ping

Objective To study the relationship between Th17 cells and relative factors with pregnancy-induced hypertension disease， we compared the expression of relative factors of Th17 cells in placenta and peripheral blood from women with pre-eclampsia and healthy women.

Pre-eclampsia；Th17 cells；Real-time polymerase chain reaction

XU Ling-di， Email： 25813211928@qq.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.06.012

江蘇省衛(wèi)生廳重大項(xiàng)目（H201249）

212000 鎮(zhèn)江市，江蘇大學(xué)附屬第四人民醫(yī)院（鎮(zhèn)江市婦幼保健院）婦產(chǎn)科（朱華英、徐玲娣、陳廷美、劉頌平）；212013 鎮(zhèn)江市，江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院（朱麗）

徐玲娣，Email：25813211928@qq.com

2015-08-19

www.cmbp.net.cn 中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù), 2015, 10(6):528-532

Author Affiliations： The 4th People′s Hospital Affiliated to Jiangsu University， Jiangsu University Medical College， Zhenjiang 212000， China （ZHU Hua-ying， XU Ling-di， CHEN Ting-mei， LIU Song-ping）； School of Medicine， Jiangsu University， Zhenjiang 212013， China （ZHU Li）

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2015, 10(6):528-532