唐玉林，米子嵐，鐘活權(quán)，江年瓊，

1)深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院，深圳518060;2)深圳市海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點實驗室，深圳518060;3)深圳市微生物基因工程重點實驗室，深圳518060

來自擬南芥的一個脫水應(yīng)答基因(the Arabidopisis thaliana dehydration-responsive gene RD22，AtRD22)的cDNA中有1 179堿基對(base pair，bp)的核苷酸，編碼一個含392個氨基酸殘基的蛋白，該蛋白屬于BURP蛋白家族.BURP蛋白最初是由Hattori等定義的一類在C-端具有保守的BURP結(jié)構(gòu)域的蛋白，其命名取自于4個具有代表性成員:①油菜花粉粒胚胎發(fā)生時表達的一種蛋白(microscope-drived embryo from Brassica napus，BNM2);②蠶豆種子中豐度非貯存蛋白(abundant non-storage seed proteins from Vicia faba，USPs);③擬南芥中的一種受干旱誘導(dǎo)的蛋白(dehydration-responsive protein from Arabidopsis thaliana，RD22)［1］;④番茄果實成熟時表達的多聚半乳糖醛酸酶Ⅰ的β亞基(β-subunit of polygalacturonase isozyme I from Lycopersicon esculentum，PG1β)［2］.BURP 蛋白家族是植物所特有的一類蛋白，已有研究表明，它們在植物的生殖發(fā)育、果實成熟以及植物抵抗生物和非生物脅迫中發(fā)揮重要功能［3-6］.AtRD22蛋白是BURP蛋白家族的典型成員之一，其基本結(jié)構(gòu)如圖1.在AtRD22蛋白的BURP結(jié)構(gòu)域中存在較高比例的半胱氨酸、組氨酸和4個保守的半胱氨酸-組氨酸基序，這些氨基酸可能與二硫鍵的形成有關(guān)，也可能具有與過渡金屬離子結(jié)合的潛力，推測其對蛋白結(jié)構(gòu)的維持和功能的發(fā)揮有重要作用，但目前尚未得到驗證，因此，通過體外表達獲得具有活性的AtRD22蛋白對于研究該蛋白的功能具有重要意義.然而，外源蛋白在大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli)中高水平表達時，新生肽鏈的聚集速率一旦超過蛋白正確折疊的速率就會導(dǎo)致包涵體的形成［7］.如果重組蛋白含有二硫鍵，而在E.coli體內(nèi)，由于還原性的環(huán)境不利于正確的二硫鍵的形成，導(dǎo)致重組蛋白鏈間的錯配，也容易導(dǎo)致包涵體的形成.AtRD22蛋白的氨基酸序列中較高比例的半胱氨酸、組氨酸是與二硫鍵形成有關(guān)的氨基酸殘基，這可能是該蛋白在E.coli中表達時容易形成包涵體的原因之一，而通過蛋白可溶性分析軟件(http://biotech.ou.edu/)預(yù)測該蛋白的可溶性為 0.因此，如何在體外獲得可溶性的AtRD22蛋白是進一步研究該蛋白結(jié)構(gòu)和功能急需解決的技術(shù)瓶頸.

圖1 AtRD22蛋白的基本結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Protein structure diagram of AtRD22

融合標(biāo)簽?zāi)軌蛟诘鞍踪|(zhì)的折疊過程中起作用，從而增加重組蛋白質(zhì)的可溶性表達［8］.pET32a載體是一種原核表達載體，利用該載體在E.coli中表達的融合蛋白含有硫氧原還蛋白A(thioredoxin A，TrxA)標(biāo)簽，有研究認為，TrxA具有提高重組蛋白溶解性的能力［9］.pSUMO載體是由pET28a改造而來的原核表達載體，它是將一段小泛素相關(guān)修飾物(small ubiquitin-related modifier，SUMO)基因插入在pET28a載體的多克隆位點中，編碼一個約100個氨基酸殘基的小分子泛素樣修飾蛋白.利用pSUMO載體在E.coli中表達的融合蛋白含有SUMO融合標(biāo)簽，該標(biāo)簽作為重組蛋白質(zhì)表達的融合標(biāo)簽和分子伴侶，具有抗蛋白酶水解、提高重組蛋白質(zhì)可溶性表達等功能［10-11］.

為了獲得AtRD22蛋白以研究其結(jié)構(gòu)與功能，本研究利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)的方法先從擬南芥總核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)中克隆到了AtRD22全長互補脫氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid，cDNA)，再分別克隆到原核重組表達載體pET32a-RD22及pSUMO-RD22中，轉(zhuǎn)化E.coli進行蛋白表達.通過一系列條件的優(yōu)化，找出獲得可溶性AtRD22蛋白質(zhì)的最佳條件并鑒定了融合蛋白的表達.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株與載體

質(zhì)粒pET32a由本實驗室保存;pSUMO由美國加州大學(xué)陳雪梅院士惠贈;E.coli Top10用于基因克隆;BL21(DE3)為融合蛋白表達宿主.

1.1.2 植物材料

哥倫比亞型(Columbia，Col.)擬南芥.

1.1.3 主要試劑

Trizol試劑(Invitrogen公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、EcoRⅠ、NotⅠ、PremeSTAR、T4 DNA連接酶和DNA分子質(zhì)量標(biāo)記(Takara公司);聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)純化試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和質(zhì)粒小量提取試劑盒(Omega公司);卡那霉素(北京鼎國公司);蛋白分子質(zhì)量標(biāo)記(Fermentas公司);His-tag小鼠單克隆抗體、兔抗小鼠二抗(Abcam公司);WTAB顯色試劑盒(上海生工).

1.2 實驗方法

1.2.1 擬南芥總RNA提取與cDNA制備

取生長周期為1個月左右的擬南芥葉片2～3片(約100 mg)，采用經(jīng)典 Trizol法［12］提取 RNA，并利用PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA.

1.2.2 引物設(shè)計與合成

根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)登錄的AtRD22基因序列，由軟件Primer Premier 5.0分析并設(shè)計聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)引物(表1).

表1 實驗引物匯總表Table1 List of primers

1.2.3 載體構(gòu)建及鑒定

1)pET32a-RD22重組載體的構(gòu)建和鑒定.以擬南芥(Col.)cDNA為模版，以 F1和R1為引物，PCR擴增出AtRD22基因的開放閱讀框，將PCR產(chǎn)物和pET32a空載體用BamHⅠ和SacⅠ雙酶切后用T4連接酶連接，再轉(zhuǎn)化E.coli Top10，之后在含氨芐青霉素(10 mg/L)的LB平板過夜培養(yǎng)后對陽性單克隆依次進行菌落PCR和雙酶切鑒定，最后進行測序驗證.

2)pSUMO-RD22重組載體的構(gòu)建和鑒定.以pET32a-RD22重組載體為模版，F(xiàn)2和R2為引物，擴增AtRD22基因的開放閱讀框，將PCR擴增產(chǎn)物和pSUMO空載體分別用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切后，再用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化E.coli Top 10，之后在含硫酸卡那霉素(10 mg/L)的LB平板培養(yǎng)過夜，對陽性單克隆進行菌液PCR和雙酶切鑒定，最后進行測序驗證.

1.2.4 重組質(zhì)粒的原核可溶性表達條件篩選

將測序成功的重組質(zhì)粒pET32a-RD22和pSUMO-RD22分別轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，挑取單克隆，在37℃ 的LB液體培養(yǎng)基中經(jīng)2次擴大培養(yǎng)，至光密度(optical density，OD)D(600)值約為 0.8時，加入終濃度為 0.3 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-Dithiogalactopyranoside，IPTG)，分別在以下條件下繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，在不同時間點分別測定菌液的D(600)值，并取樣檢測蛋白的表達.pET32a-RD22的誘導(dǎo)條件:37 ℃ 分別誘導(dǎo) 0、0.5、1.0、1.5 和2.0 h;28 ℃ 分別誘導(dǎo) 2.0、4.0 和8.0 h;16 ℃ 分別誘導(dǎo) 6.0、8.0 和12.0 h.pSUMO-RD22的誘導(dǎo)條件:37℃分別誘導(dǎo)1.0、2.0和3.0 h;28℃分別誘導(dǎo) 2.0、4.0 和8.0 h;16 ℃ 分別誘導(dǎo)6.0、8.0和12.0 h.檢測方法:將菌液離心后，根據(jù)菌液的D(600)值加入相應(yīng)體積的平衡緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，200 mmol/L NaCl， pH=8.0)重懸菌體，使樣品的菌體濃度一致，各樣品留取20 μL用于總蛋白檢測，其余樣品進行超聲破碎后離心取上清，獲得各誘導(dǎo)條件下的可溶性蛋白，進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(dodecyl sulfate，sodium salt-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE).

1.2.5 利用蛋白質(zhì)免疫印跡鑒定表達的融合蛋白

SDS-PAGE電泳后，采用濕法轉(zhuǎn)移法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2.0 h后，用鼠抗6×組氨酸抗體4℃ 孵育過夜，然后用洗膜緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，體積分數(shù)為0.05%的Tween20)洗膜3次，每次5 min，加入2 000倍稀釋的兔抗鼠免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)，室溫孵育2.0 h，洗膜緩沖液洗滌3次，每次5 min，最后用W-TAB試劑盒顯色.

1.2.6 質(zhì)譜鑒定表達的目的蛋白

將誘導(dǎo)后的蛋白進行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色脫色后，挖取特異性條帶部分經(jīng)膠內(nèi)酶解［13］后，采用高分辨質(zhì)譜儀 AB SCIEX Triple TOFTM 5600檢測鑒定.

2 結(jié)果與分析

2.1 擬南芥RNA的提取及AtRD22基因的克隆

利用Trizol法提取擬南芥葉RNA后取5 μL進行非甲醛變性核酸電泳，見圖2(a).RNA條帶完整，無拖尾現(xiàn)象，表明該方法獲得的RNA比較完整.提取的RNA利用核酸分析儀測定得到RNA質(zhì)量濃度為 450 ng/μL，D(260)/D(280)=1.85，說明RNA的質(zhì)量濃度可滿足反轉(zhuǎn)錄的要求.將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，以cDNA為模版，F(xiàn)1和R1為引物，PCR擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后可見一條與目的基因片段大小(1 179 bp)相符的特異性條帶，見圖2(b).將該PCR片段與pET32a載體連接后轉(zhuǎn)化E.coli Top10，在LB平板上培養(yǎng)過夜.對陽性單克隆進行菌液PCR和雙酶切鑒定，見圖2(c)和圖2(d)，并經(jīng)測序驗證正確.

以pET32a-RD22為模版，F(xiàn)2和R2為引物擴增出AtRD22基因的開放閱讀框，將擴增產(chǎn)物與pSUMO空載體連接后轉(zhuǎn)入E.coli Top10感受態(tài)細胞中，在LB平板上過夜培養(yǎng)后對陽性單克隆進行菌液PCR和雙酶切鑒定，見圖2(e)和圖2(f)，并經(jīng)測序驗證正確.

圖2 重組表達載體的構(gòu)建及鑒定Fig.2 Construction and identification of recombinant expression vector

2.2 融合蛋白的誘導(dǎo)表達

圖3 轉(zhuǎn)化pET32a-RD22的菌中融合蛋白的誘導(dǎo)表達情況Fig.3 (Color online)The expression of fusion protein using pET32-RD22

為建立適宜的AtRD22蛋白的原核表達條件，研究了誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時間和誘導(dǎo)劑濃度對目標(biāo)蛋白可溶性表達的影響.結(jié)果表明誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時間對目標(biāo)蛋白可溶性表達影響較大，見圖3和圖4(蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量單位:u，1 D=1 u)，而當(dāng)誘導(dǎo)劑濃度分別為0.3、0.5和1.0 mmol/L時，可溶性目標(biāo)蛋白的量幾乎無變化(結(jié)果未顯示)，因此選取0.3 mmol/L作為本實驗中的誘導(dǎo)劑濃度.轉(zhuǎn)化了pET32a-RD22和pSUMO-RD22的重組 E.coli，經(jīng)不同條件培養(yǎng)和誘導(dǎo)后，總蛋白中均分別有與各自目的蛋白分子量大小相等的特異性蛋白出現(xiàn)，且轉(zhuǎn)化了pET32a-RD22的重組菌在被誘導(dǎo)1.5～12.0 h后目的條帶清晰而粗厚，顯示其目的蛋白的表達量較高.但可溶性蛋白中的特異性蛋白的存在情況不同.在誘導(dǎo)溫度為37、28和16℃時，不同誘導(dǎo)時間后的pET32a-RD22重組菌經(jīng)超聲破碎獲得的上清液作為可溶性蛋白，經(jīng)SDS-PAGE后均未見與目的蛋白分子量大小一致的明顯條帶.而pSUMORD22重組菌在不同的溫度和時間下誘導(dǎo)培養(yǎng)后，其表達的可溶性蛋白中均有與目的蛋白分子量大小相等的特異性蛋白條帶出現(xiàn);當(dāng)培養(yǎng)溫度為28℃誘導(dǎo)6.0 h，或16℃誘導(dǎo)8.0 h以上時，可溶性蛋白中的特異性條帶蛋白表達量相對較高，見圖4(b)和圖4(c).

圖4 轉(zhuǎn)化pSUMO-RD22的菌中融合蛋白誘導(dǎo)表達情況Fig.4 (Color online)The expression of fusion protein using pSUMO-RD22

2.3 可溶性蛋白的鑒定

通過對圖4的結(jié)果分析，對轉(zhuǎn)化了 pSUMORD22重組載體的E.coli在優(yōu)化條件下，即在IPTG濃度為0.3 mmol/L時，28℃誘導(dǎo)6 h，進行融合蛋白的表達.分別取總蛋白、包涵體蛋白和可溶性蛋白進行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜進行蛋白質(zhì)免疫印跡(western blot，WB)分析，一抗為小鼠抗His抗體，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗小鼠IgG.結(jié)果如圖5，由圖5可見，在總蛋白及可溶性蛋白中均有一條約60 kD(1 D=1 u)的條帶，見圖5.進一步對該特異性條帶進行質(zhì)譜鑒定，確認該蛋白條帶為擬南芥AtRD22蛋白.證明利用pSUMO-RD22載體成功表達了可溶性的SUMO-RD22融合蛋白.

圖5 利用WB鑒定重組菌蛋白的表達Fig.5 (Color online)Identification of fusion protein using WB

3 討論

利用原核表達系統(tǒng)表達異源蛋白具有簡便、價廉、高效等優(yōu)點，已廣泛用于科學(xué)研究中.但重組的外源蛋白在E.coli中高水平表達時經(jīng)常導(dǎo)致蛋白聚集容易形成不溶的、無活性的包涵體，而包涵體蛋白雖然較易純化，但后續(xù)的復(fù)性等工作繁瑣，且不一定能得到具有功能的蛋白，所以在體外表達可溶性的蛋白將大大簡化進一步的蛋白實驗［7］.

目前，許多融合標(biāo)簽系統(tǒng)已作為實現(xiàn)蛋白可溶性表達和純化常用的方法，但不同的融合標(biāo)簽對于提高不同蛋白溶解性及表達量的能力不同［14］.TrxA是還原蛋白二硫鍵的催化劑，它作為融合標(biāo)簽可以提高蛋白的溶解性［15］.AtRD22蛋白中可能含有較多的二硫鍵，其在原核表達中難以進行可溶性表達的原因之一可能是二硫鍵未能正確折疊，與TrxA融合表達后的AtRD22蛋白的大部分以包涵體形式存在，可溶性目的蛋白的量很少，這可能是由于TrxA未能促進AtRD22蛋白的正確折疊.SUMO作為N-端融合標(biāo)簽，能夠顯著提高融合蛋白的表達量［10］.AtRD22具有親水的外表面，內(nèi)部是一個疏水核心，這種結(jié)構(gòu)可能使它對其他不溶性的蛋白以一個類似去垢劑的物質(zhì)發(fā)揮作用，能夠促進蛋白的正確折疊［16］，提高目標(biāo)蛋白的穩(wěn)定性和可溶性［10］.本研究將pET32a-RD22轉(zhuǎn)化E.coli后表達的融合蛋白在不同的誘導(dǎo)溫度及誘導(dǎo)時間下，融合蛋白的可溶性均很低，而利用pSUMO-RD22轉(zhuǎn)化E.coli表達出的融合蛋白在不同的溫度及誘導(dǎo)時間下，融合蛋白的可溶性均相對提高.由此可知，促溶標(biāo)簽對于提高AtRD22蛋白溶解性的影響較大，SUMO融合標(biāo)簽對AtRD22蛋白的促溶作用明顯優(yōu)于TrxA.利用pSUMO-RD22重組載體可在E.coli中表達出可溶性程度較高的AtRD22融合蛋白.

分析不同誘導(dǎo)溫度及誘導(dǎo)時間對pSUMO-RD22蛋白可溶性表達的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)誘導(dǎo)溫度為37℃時，隨著誘導(dǎo)時間的延長，可溶性目的蛋白的含量在1.0、2.0和3.0 h時沒有明顯改變;當(dāng)誘導(dǎo)溫度為28℃時，可溶性目的蛋白量在誘導(dǎo)4.0和6.0 h時要明顯多于誘導(dǎo)2.0 h時;當(dāng)誘導(dǎo)溫度為16℃時，隨著誘導(dǎo)時間的增加，可溶性目的蛋白量增加，在誘導(dǎo)的8.0和12.0 h都表現(xiàn)為有較高含量的可溶性目的蛋白.當(dāng)誘導(dǎo)溫度為28和16℃時，可溶性目的蛋白量均明顯高于37℃時的獲取量.推測當(dāng)誘導(dǎo)溫度較高時，蛋白的表達速度較快，可能使得蛋白不能夠正確折疊，進而造成蛋白的可溶性降低.這些結(jié)果說明，低溫誘導(dǎo)有利于可溶性AtRD22蛋白的表達和積累，一定的誘導(dǎo)時間對于提高可溶性蛋白的量是有效的.考慮到后續(xù)蛋白大量純化的時間和效率，28℃誘導(dǎo)培養(yǎng)6.0 h將是誘導(dǎo)獲得該蛋白的較為合適的條件.

體外獲得具有活性的AtRD22蛋白將有利于對該蛋白的結(jié)構(gòu)和功能的認識，進而豐富對BURP蛋白家族的了解，而在E.coli中表達出可溶性的AtRD22蛋白則為這一工作奠定了基礎(chǔ).

結(jié) 語

本研究構(gòu)建了擬南芥AtRD22基因的原核表達載體，探索了體外表達可溶性融合蛋白的條件，結(jié)果表明，利用SUMO表達系統(tǒng)在誘導(dǎo)溫度為28℃，誘導(dǎo)6.0 h，或16℃，誘導(dǎo)8.0 h以上時，可在重組菌中表達出相對含量較多的可溶性目的蛋白.

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