李貴龍，王靖，劉昌勝

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重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的制備及成骨活性表征

李貴龍，王靖，劉昌勝

（華東理工大學教育部醫(yī)用生物材料工程研究中心，上海 200237）

骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）是重要的骨誘導生長因子，是提高骨修復材料活性和臨床骨修復效果的有效手段和關(guān)鍵物質(zhì)。由于BMP-2在體內(nèi)含量低，依靠從動物體內(nèi)提取難以滿足臨床需求。本文研究滿足臨床需求的BMP-2的制備方法，并評價其生物活性。采用密碼子優(yōu)化方法，并通過進一步更換其中部分核苷酸編碼，得到優(yōu)化的hBMP-2基因的DNA序列，制備大腸桿菌rhBMP-2菌株，通過發(fā)酵及工藝優(yōu)化，獲得BMP包涵體，經(jīng)分離純化與復性，制備出高純度的rhBMP-2。測定C2C12細胞的堿性磷酸酶（ALP）活性來表征單倍體和二倍體BMP-2的成骨活性，發(fā)現(xiàn)二倍體rhBMP-2的成骨活性明顯高于單倍體rhBMP-2，并且隨著BMP-2濃度增加，堿性磷酸酶活性上升。體內(nèi)動物異位成骨實驗發(fā)現(xiàn)rhBMP-2肌帶植入小鼠體內(nèi)3周后，取出的異位骨顆粒鮮艷飽滿，骨結(jié)構(gòu)完整；HE切片和Masson三色切片都顯示出良好的異位成骨效果。此方法制備的rhBMP-2具有良好的誘導成骨分化能力，可用于骨組織修復，滿足臨床需要。

骨修復；生物醫(yī)學工程；蛋白質(zhì)；蛋白質(zhì)復性；骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2；原核表達

引 言

近年來，因疾病、創(chuàng)傷、人口老齡化等原因?qū)е碌墓菗p傷患者數(shù)量劇增。骨缺損修復主要采用自體骨或同種異體骨移植以及人工骨替換等方法。其中自體骨移植因其良好的骨誘導性和生物相容性，迄今仍是骨修復的“金標準”。但由于來源受限、供骨部位易感染等問題，臨床應(yīng)用受到限制；而異體骨則存在不同程度的免疫排異反應(yīng)及潛在的病源傳播風險。盡管目前已經(jīng)有不少骨修復材料獲得臨床應(yīng)用，但單純材料生物活性普遍不足，嚴重影響了其臨床使用效果。

對骨生長和修復有促進作用的骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）生長因子的發(fā)現(xiàn)為提高骨修復材料的活性提供了有效的手段。BMP屬于轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β超家族成員，于1965年首次被發(fā)現(xiàn)。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)20余種BMP成員[1-2]。其中BMP-2研究最為廣泛，其誘導成骨作用已得到證實，并且已分別獲美國食品和藥物管理局（FDA）和歐洲藥品管理局（EMEA）批準用于臨床，具有廣闊的應(yīng)用前景[3-6]。

BMP是一種疏水性非膠原酸性糖蛋白，存在于動物骨組織中，但含量極低，每千克鮮骨中僅分離出幾微克BMP，且分離過程繁雜，純度低，重復性差，質(zhì)量控制困難，難以滿足臨床需求[7]。利用基因重組技術(shù)不僅可以實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，還可以避免免疫排斥反應(yīng)，具有極佳的發(fā)展前景。目前，BMP-2可以采用真核細胞和原核細胞兩種系統(tǒng)表達。真核細胞表達系統(tǒng)使用哺乳動物細胞，其表達產(chǎn)物可以糖基化，有更好的翻譯后修飾，活性相對較高。目前的國外產(chǎn)品大多采用真核表達體系制備。但真核體系表達量低，因此表達產(chǎn)物回收及純化均困難，導致生產(chǎn)成本很高。目前國外BMP產(chǎn)品的價格十分昂貴，臨床推廣難度很大。與真核表達系統(tǒng)相比，原核細胞表達系統(tǒng)具有表達效率高、對培養(yǎng)環(huán)境耐受性強、易于控制，產(chǎn)物穩(wěn)定、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點[8-15]，更利于臨床推廣。但其主要問題是較難正確加工和折疊形成有活性的蛋白質(zhì)，特別是可重復性的復性和純化的難度很大[16-17]，致使大部分工作停留在實驗室水平，無法實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。

本文通過截取編碼rhBMP-2羧基端氨基酸肽段的rhBMP-2的cDNA制備大腸桿菌rhBMP-2菌株，通過發(fā)酵及工藝優(yōu)化，獲得BMP包涵體，經(jīng)分離純化與復性，制得高純度的rhBMP-2，并在體外細胞實驗和體內(nèi)動物實驗中考察了所制備的rhBMP-2的誘導成骨活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 ①LB培養(yǎng)基配制：10 g·L-1胰蛋白胨，5 g·L-1酵母浸出粉，5 g·L-1NaCl；氨芐青霉素含量為100 μg·ml-1；②包涵體裂解液配制：6 mol·L-1Gu-HCl（鹽酸胍），20 mmol·L-1PBS（磷酸緩沖液），10 mmol·L-1DTT（二硫蘇糖醇）；③包涵體復性液配制：20 mmol·L-1Na2HPO4·12H2O，1.5 mmol·L-1NaH2PO4·2H2O、140 mmol·L-1NaCl、5 mmol·L-1EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）、 1 mmol·L-1谷胱甘肽；④TE緩沖溶液配制： 6 mmol·L-1Tris，10 mmol·L-1EDTA；⑤麻醉劑（3%水合氯醛溶液）；⑥4%中性甲醛固定液；⑦可吸收性明膠海綿（南京金陵藥業(yè)股份有限公司），硝基苯磷酸（PNPP-Na，中國上海生工生物有限公司）。所有試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 實驗動物 C57/BL雄性小鼠，18～20 g，SPF級別，由上海中醫(yī)藥大學科技實驗中心提供。

1.2 rhBMP-2的制備[18]

1.2.1 hBMP-2基因的DNA序列優(yōu)化 根據(jù)大腸桿菌密碼子使用頻率采用密碼子優(yōu)化軟件初步優(yōu)化hBMP-2 的cDNA序列，再根據(jù)經(jīng)驗值計算，進一步更換其中部分核苷酸編碼，得到優(yōu)化的hBMP-2基因的DNA序列。

1.2.2 重組載體的構(gòu)建 全基因合成hBMP-2基因DNA序列，酶切后插入載體pBV220，獲得優(yōu)化的hBMP-2表達質(zhì)粒，經(jīng)酶切和測序驗證插入片段與設(shè)計相符。

1.2.3 工程菌的構(gòu)建、驗證和保存 以常規(guī)氯化鈣法采用分子克隆技術(shù)制備感受態(tài)表達系統(tǒng)。隨后用所得的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株，在抗性平板中挑取單菌落，培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒，酶切測序。挑取重組子，接種于裝有含葡萄糖和抗生素的LB培養(yǎng)液的搖瓶中，在氣浴振蕩器中培養(yǎng)15 h（溫度30℃、轉(zhuǎn)速180 r·min-1），然后冰浴條件下加入無菌甘油，分裝后在-80℃冰箱保存。

1.2.4 工程菌的培養(yǎng) 從含正確表達質(zhì)粒的大腸桿菌抗性平板中挑取單菌落，接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液搖瓶中；在搖床中培養(yǎng)8 h（溫度30℃、轉(zhuǎn)速180 r·min-1），再按體積比為1:10的比例將培養(yǎng)物接種到LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h（條件：pH 7.0±0.2，溫度30℃，轉(zhuǎn)速180 r·min-1）。隨后升溫至42℃進行誘導，繼續(xù)培養(yǎng)6 h。結(jié)束培養(yǎng)，在（4±2）℃溫度下離心分離（轉(zhuǎn)速7500 r·min-1）收集菌體，裂解后，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。

1.2.5 包涵體的提取和洗滌 將收集的菌體，與TE緩沖溶液按1 g:10 ml的比例混合，再按1 g:1 mg的比例與溶菌酶混合，采用高壓均質(zhì)法進行菌體破碎，離心分離（轉(zhuǎn)速10000 r·min-1）并收集沉淀。加入洗滌溶液（1 g沉淀物/20 ml洗滌液），攪拌2 h后，在（4±2）℃下離心分離，收集沉淀物。沉淀物用0.5%曲拉通水溶液洗滌數(shù)次后，加入10 mmol·L-1的Tris（pH 7.5）溶液（1 g沉淀物/20 ml Tris），清洗后離心收集沉淀，得包涵體。

1.2.6 包涵體的裂解、復性 以1g包涵體/10 ml的比例加入裂解液。在（4±2）℃下，攪拌裂解8 h，然后離心[轉(zhuǎn)速10000 r·min-1，溫度（4±2）℃]30 min，棄沉淀，取離心上清液加入含復性助劑的復性液中，稀釋至蛋白含量為0.1 mg·ml-1，復性7 d。

1.2.7 蛋白純化 采用離子交換色譜、親和色譜、分子排阻色譜的方法，按常規(guī)的洗脫方法從復性 液中回收有活性的融合蛋白二倍體。然后在-30～7℃下凍干，得到目標蛋白。具體工藝流程如圖1 所示。

圖1 rhBMP-2制備工藝流程

1.3 堿性磷酸酶（ALP）活性測定

將C2C12細胞以1.2×104個·孔-1的密度接種在96孔板中，培養(yǎng)24 h后，細胞完全貼壁，更換培養(yǎng)基，分別加入2 ml含有不同濃度的單倍體和二倍體BMP-2（0～12 μg·ml-1）的培養(yǎng)基。培養(yǎng)72 h后，去除培養(yǎng)基。在每孔中加入50 μl 1%乙基苯基聚乙二醇溶液（NP-40），室溫下裂解細胞1 h。獲取裂解液，加入0.1 ml 1 mg·ml-1的-硝基苯基磷酸鹽溶液（PNPP-Na，pH9.0）和0.1 mol·L-1甘氨酸、1 mmol·L-1MgCl2·6H2O組成的混合液，置于37℃孵育15 min。孵育結(jié)束后，每孔加入0.1 ml 0.1 mol· L-1NaOH，用酶聯(lián)免疫檢測儀在405 nm 處測定ALP 吸光值。裂解液中總蛋白的含量采用microBCA試劑盒（碧云天生物科技，江蘇，中國）測定。建立BSA蛋白標準曲線并測定 562 nm處的吸光值，計算獲得總蛋白的量。ALP活性結(jié)果由405 nm 處吸光值與相應(yīng)總蛋白含量的比值來表示。

1.4 rhBMP-2異位成骨

將明膠海綿剪裁成1 cm×1 cm×0.5 cm塊狀置于24孔板，滴加50 μg的rhBMP-2；充分吸附后，放入真空冷凍干燥機凍干12 h，取出放-20℃冰箱備用。

體內(nèi)植入實驗在無菌環(huán)境下操作，所用的所有實驗器具事先經(jīng)滅菌處理。將SPF級C57/BL小鼠按0.15～0.2 ml/18～22 g比例腹腔注射水合氯醛麻醉劑。將小鼠固定，右后腿部內(nèi)側(cè)去毛，75%乙醇溶液擦拭表皮消毒。用手術(shù)剪縱向切口約3 mm，將肌袋內(nèi)軟組織分開后植入樣品，手術(shù)線逐層縫合。手術(shù)后的小鼠在無菌環(huán)境下正常飼養(yǎng)。

術(shù)后3周，將實驗小鼠處死。解剖右后腿，從肌袋中取出骨樣組織。附帶周圍少量軟組織一同浸泡在4%福爾馬林溶液中固定24 h，然后在30%甲酸-福爾馬林溶液中脫鈣72 h。脫鈣后的標本經(jīng)洗滌、乙醇法梯度脫水、二甲苯透明處理、浸蠟、包埋、切片等工序后，進行組織染色。本文選用蘇木素-伊紅（HE）和Masson對新生的骨樣組織進行染色。染色后的標本在倒置顯微鏡下觀察骨形成情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 rhBMP-2制備

天然的BMP-2以二聚體形式存在，2個單體間通過二硫鍵結(jié)合。每個BMP-2單體含有114個氨基酸，相對分子質(zhì)量約13×103。本研究中，采用密碼子優(yōu)化方法，并通過進一步更換其中部分核苷酸編碼，經(jīng)合成得到優(yōu)化的hBMP-2基因的DNA序列。構(gòu)建并獲得基因優(yōu)化的表達質(zhì)粒pRB-BMP2-1，其長度為4013 bp；由圖2可以看出，經(jīng)酶切和測序驗證，插入片段與設(shè)計一致。

圖2 rhBMP-2基因優(yōu)化的表達質(zhì)粒

圖3 hBMP-2基因的DNA序列優(yōu)化

本研究采用分子克隆技術(shù)，將優(yōu)化基因克隆入表達載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得表達rhBMP-2的工程菌（圖3）。將rhBMP-2工程菌株進行高密度發(fā)酵和溫度誘導表達。離心分離收集菌體，經(jīng)裂菌、超聲、洗滌等步驟后獲得以包涵體形式存在的BMP-2二聚體。將包涵體變性溶解，經(jīng)離子交換柱色譜、親和色譜、分子排阻色譜后，可獲得高純度的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白（rhBMP-2）。本研究所制備的rhBMP-2的氨基酸肽鏈序列如下：Met Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Glu Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg。

圖4的聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示，對比誘導前的重組菌及不含質(zhì)粒的出發(fā)菌，菌體裂解后在相對分子質(zhì)量13×103處出現(xiàn)清晰條帶，證明表達產(chǎn)生了目標蛋白。經(jīng)非還原電泳SDS-PAGE檢測產(chǎn)品純度超過95%；其二聚體相對分子質(zhì)量約為26×103；經(jīng)HPLC鑒定其純度超過95%，并且N末端與C末端測定均與理論值一致。每批培養(yǎng)物的得率可達5.3 mg·L-1。

圖4 rhBMP-2聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

2.2 rhBMP-2誘導成骨活性

采用以大腸桿菌為宿主細胞的原核表達系統(tǒng)制備rhBMP-2，具有操作簡便、成本低、產(chǎn)量高等優(yōu)點。但其最大問題在于表達產(chǎn)物為不可溶且無生物活性的包涵體，必須經(jīng)過進一步純化以及變性-復性過程才能獲得高純度的活性蛋白。而BMP-2的復雜二聚體結(jié)構(gòu)和強疏水性特點，使得其適用的復性和分離純化方法受限。本研究采用透析法復性。經(jīng)過復性，rhBMP-2的二硫鍵配對成3個分子內(nèi)二硫鍵和1個分子間二硫鍵，與天然BMP-2的二聚體形式一致，從而保證其具有誘導成骨活性。

堿性磷酸酶(ALP)廣泛存在于人體骨骼和肝臟組織中，是成骨樣細胞分化成熟的重要標志之一，其活性高低可反映出細胞成骨轉(zhuǎn)化及礦化能力。一般采用ALP活性作為體外評價細胞早期成骨分化的指標。本研究通過測定C2C12細胞的堿性磷酸酶（ALP）活性來表征單倍體和二倍體BMP-2的成骨活性。由圖5可知，二倍體rhBMP-2的成骨活性明顯高于單倍體rhBMP-2，并且隨著BMP-2濃度增加，堿性磷酸酶活性上升。

圖5 單倍體和二倍體rhBMP-2蛋白的ALP活性比較

將所制備的rhBMP-2負載于醫(yī)用明膠海綿上，植入小鼠肌袋內(nèi)觀察其誘導異位成骨的情況。圖6為植入3周后取出的異位骨標本，肌袋內(nèi)明顯可見形成新生骨樣組織，顆粒飽滿，質(zhì)地堅硬，長度7～10 mm，環(huán)直徑約5 mm，顏色呈血紅色。進一步組織學分析，由圖7（a）、（b）HE染色中看出在橫紋肌組織中出現(xiàn)骨組織，包括骨小梁、紅骨髓和脂肪空泡，并且骨小梁已經(jīng)相互聯(lián)結(jié)，形成穩(wěn)固的骨結(jié)構(gòu)；而由圖7（c）、（d）Masson三色染色圖中可見，新生骨組織中深藍與深紅色相間，深藍色區(qū)域中出現(xiàn)大量骨陷窩和密集排布的骨小梁，中間還有部分的骨髓空腔，四周充滿紅細胞和脂肪細胞，說明骨組織趨于成熟。組織學分析表明，本方法所制備的rhBMP-2具有良好的骨誘導活性。

3 結(jié) 論

rhBMP-2是重要的促進骨修復生長因子，實現(xiàn)規(guī)?；煽刂苽鋵μ岣吲R床治療水平具有重要意義。本文采用優(yōu)化的、適合大腸桿菌表達系統(tǒng)的rhBMP-2的DNA序列，通過發(fā)酵及工藝優(yōu)化，獲得BMP包涵體，經(jīng)分離純化與復性，制得高純度的二倍體rhBMP-2。體外細胞堿性磷酸酶活性檢測及體內(nèi)異位成骨實驗表明，所制備的rhBMP-2具有良好的成骨活性，有望用于骨組織修復，滿足臨床實際需要。

圖6 新生異位骨顆粒

圖7 rhBMP-2誘導異位成骨的HE和三色染色

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Preparation of recombinant human bone morphogenetic protein-2 and investigation of osteogenic activity

LI Guilong, WANG Jing, LIU Changsheng

Engineering Research Center for Biomedical Materials of Ministry of EducationEast China University of Science and TechnologyShanghaiChina

Bone morphogenetic protein-2 (BMP-2), one of the important osteoinductive growth factors, is an effective and crucial cytokine for clinic bone regeneration as well as bioactivity improvement of bone substitute. However, extraction of BMP-2 from animals can hardly meet the clinic requirements due to its very low content. This work studied the preparation of BMP-2 to meet the clinical needs, and evaluated its biological activity. Firstly, DNA sequence of optimized hBMP-2 gene was obtained to prepare rhBMP-2 strains of.using codon optimization method with further replacement of the partial nucleotide coding. Then, through fermentation and process optimization the BMP inclusion body was acquired. After separation, purification and renaturation, rhBMP-2 of high purity was prepared.cell experiments, the activity of alkaline phosphatase (ALP) in C2C12 cells was measured to characterize the osteogenic activity of haploid and diploid BMP-2. It was observed that the osteogenic activity of diploid rhBMP-2 was significantly higher than that of haploid rhBMP-2, and the activity of alkaline phosphatase increased with the increase of the BMP-2 concentration.ectopic bone experiment, after rhBMP-2 was implanted into the muscle of mice for 3 weeks, the ectopic bone granules were bright and fresh, and the bone structure was complete. HE and Masson’s trichrome stainings showed good ectopic bone formation. It can be concluded that the rhBMP-2 prepared using this method can well induce osteogenic differentiation, and can be used for bone tissue repair to meet the clinical needs.

bone regeneration; biomedical engineering; protein; renaturation; bone morphogenetic protein-2; prokaryotic expression

2015-06-04.

Prof. LIU Changsheng, liucs@ecust.edu.cn

10.11949/j.issn.0438-1157.20150825

R 318.08

A

0438—1157（2015）08—3183—06

劉昌勝。

李貴龍（1988—），男，碩士研究生。

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃項目（2012CB933600）。

2015-06-04收到初稿，2015-06-08收到修改稿。

supported by the National Basic Research Program of China (2012CB933600).