王 娟，崔志軍，馬巧亞，王 竹，孫萬森*

（1．西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志編輯部，西安710004；2．陜西省交通醫(yī)院急診科，西安710004）

祛風(fēng)通絡(luò)方對(duì)阿霉素大鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞 VEGF及其受體 FLK-1表達(dá)的影響

王 娟1，崔志軍2，馬巧亞1，王 竹1，孫萬森1*

（1．西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志編輯部，西安710004；2．陜西省交通醫(yī)院急診科，西安710004）

目的 研究祛風(fēng)通絡(luò)方對(duì)阿霉素模型大鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞VEGF及其受體FLK-1表達(dá)的影響。方法 130只SD大鼠抽出30只作為空白對(duì)照組（A組），余下大鼠采用阿霉素給予尾靜脈一次性注射構(gòu)建大鼠腎病模型，造模成功后，隨機(jī)分為模型組（B組，n＝18）、祛風(fēng)通絡(luò)方組（C組，n＝18），祛激組（祛風(fēng)通絡(luò)方和激素共用組，D組，n＝18），激素組（E組，n＝18），苯那普利組（F組，n＝18），構(gòu)建腎小球內(nèi)皮細(xì)胞阿霉素模型，給予相應(yīng)大鼠血清治療，鄰苯三酚紅／鉬酸鹽法檢測(cè)24 h尿蛋白定量；全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清白蛋白（ALB）、血脂（TG）、腎功能BUN、Cr；Western Bloting及RT-PCR檢測(cè)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞VEGF及其受體FLK-1的表達(dá)。結(jié)果

祛風(fēng)通絡(luò)方；VEGF；FLK-1；腎功能

慢性腎臟疾?。–KD）已成為世界范圍內(nèi)亟需解決的健康問題［1］，其患病率在10%左右［2］。中醫(yī)藥治療CKD以“腎病從風(fēng)論治”的理論有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)，值得研究人員進(jìn)一步探討與發(fā)掘。祛風(fēng)通絡(luò)類方藥被諸多腎病臨床學(xué)者應(yīng)用于慢性腎病的治療，取得了確切療效［3-4］。實(shí)驗(yàn)室前期的研究［5-9］證實(shí) ，祛風(fēng)通絡(luò)方能夠降低腎小球腎炎大鼠血清IL-6、IL-8水平，保護(hù)腎功能；抑制腎組織α-SMA的表達(dá)，從而影響腎小球系膜細(xì)胞的重塑，并能延緩腎小球硬化的進(jìn)展等。然而，祛風(fēng)通絡(luò)方對(duì)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞受體信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)知之甚少，本研究將構(gòu)建大鼠腎病模型并于腎小球內(nèi)皮細(xì)胞相結(jié)合，研究祛風(fēng)通絡(luò)方對(duì)VEGF及其受體FLK-1表達(dá)的影響。報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、細(xì)胞、藥物與試劑 健康清潔級(jí)雄性SD大鼠130只，購(gòu)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（合格證號(hào)為陜醫(yī)動(dòng)字第09-005號(hào)）；4周齡H-2KbtsA58轉(zhuǎn)基因小鼠購(gòu)自CharleSRiver公司（USA）。祛風(fēng)通絡(luò)方稀釋液（烏梢蛇15 g，黃芪30 g，青風(fēng)藤20 g，桑寄生30 g，海風(fēng)藤20 g，生地黃20 g）由西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院中醫(yī)科制劑室提供；醋酸強(qiáng)的松片：西安利君制藥有限責(zé)任公司；阿霉素：浙江海正藥業(yè)；苯那普利：北京諾華制藥有限公司；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、VEGF受體（FLK-1）與β-actin-抗：Cell Signaling，USA；Trizol：Gibco，USA；RT-PCR試劑盒：MBI。

1.2 動(dòng)物分組、模型制備與給藥 SD大鼠130只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)抽出30只為空白對(duì)照組（A組），余下100只按6 mg／kg給予尾靜脈一次性注射阿霉素（ADR），制成病理模型，A組給予等容量生理鹽水。3周后腎病模型造模成功，死亡10只。余下90只大鼠隨機(jī)分為5組，每組18只，即模型組（B組）、祛風(fēng)通絡(luò)方治療組（C組），祛激組（祛風(fēng)通絡(luò)方和激素共用組D組），強(qiáng)的松治療組（E組），苯那普利治療組（F組）。造模成功后，各組大鼠灌胃1次／d，另外給予自由飲食。A、B組給予2 mL蒸餾水；C組給予祛風(fēng)通絡(luò)方藥液（含生藥2.1 g／mL）和蒸餾水各1 mL；D組給予強(qiáng)的松藥液（25 mg／kg）和祛風(fēng)通絡(luò)方藥液各1 mL；E組給予強(qiáng)的松藥液和蒸餾水各1 mL；F組給予苯那普利（0.34 mg／kg）和蒸餾水各1 mL。

1.3 腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)、模型制備與給藥 A、B、C、D、E、F組給予相應(yīng)藥物灌胃，1次／d。C、D、E、F 4組大鼠用藥14 d，于末次給藥4 h后，各組隨機(jī)抽取4只，斷頭取血，離心取血清，滅活并過濾后-70℃真空干燥成粉末，-20℃保存?zhèn)溆?。分離H-2Kb-tsA58轉(zhuǎn)基因小鼠的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞 ，于 33℃、IFN-γ（20 U／mL）誘導(dǎo)下培養(yǎng)，獲得無限增殖能力［10］，即永生化溫度敏感小鼠內(nèi)皮細(xì)胞系HSMEC（heat-sensitivemouse endothelium cell）。阿霉素100 μg／mL加入培養(yǎng)的HSMEC，作用24 h。此后分為6組，分別加入A、B、C、D、E、F組的血清凍干粉培養(yǎng)48 h。

1.4 24 h尿蛋白測(cè)定 分別在注射ADR第0、1、2、3周將大鼠置于清潔代謝籠內(nèi)，留取24 h尿液，采用鄰苯三酚紅／鉬酸鹽法檢測(cè)24 h尿蛋白定量。

1.5 血清生化指標(biāo)檢測(cè) 分別在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的第0、3、7周，隨機(jī)選取各組大鼠8只，10%水合氯醛麻醉，分離腹主動(dòng)脈，抗凝管采集5 mL動(dòng)脈血，3 000 r／min離心20 min，收集血清，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清白蛋白（ALB）、血脂（TCH、TG）、腎功能（BUN、Cr）。

1.6 Western Blotting檢測(cè)VEGF、FLK-1蛋白的表達(dá)水平 提取各組細(xì)胞總蛋白，采用Western Blotting法檢測(cè)VEGF、FLK-1蛋白的表達(dá)，用Quantity One軟件測(cè)每條帶光密度值。

1.7 RT-PCR檢測(cè)VEGF、FLK-1 mRNA的表達(dá) 采用Trizol提取細(xì)胞總RNA，以RNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶及引物水浴30 min合成cDNA，95℃5 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，產(chǎn)物作為PCR模板。VEGF引物序列：正鏈引物5′-ACTGGACCCTGGCTTTACTGC-3′，負(fù)鏈引物 5′-TTGGTGAGGTTTGA TCCGCA TG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為310 bp；FLK-1引物序列：正鏈引物5′-CGTCCTCAAAGCATCAGCAT-3′，負(fù)鏈引物 5′-CTACGCCCTTTGATGTGCCA-3′擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為406 bp；內(nèi)參β-actin：引物序列：正鏈引物5′-CTCTGGTCGTACCACTGGCATTG-3′，5′-CCTGCTTGCTGATCCACA TCTGC-3′擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為680 bp。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組之間采用單因素方差分析進(jìn)行比較，以 P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組24 h尿蛋白測(cè)定比較 見表1。

表1 各組24 h尿蛋白測(cè)定比較（±s，n＝30）mg／24h

表1 各組24 h尿蛋白測(cè)定比較（±s，n＝30）mg／24h

注：與對(duì)照組相應(yīng)時(shí)間比較 ，＃P＜0．05，＃＃P＜0．01

組 別 0周 1周 2周 3周對(duì)照組 7．91±2．02 8．11±1．98 8．36±2．31 7．88±2．13模型組 8．01±2．1118．34±6．45＃54．32±12．24＃＃68．62±11．31＃＃

2.2 各組血清生化指標(biāo)檢測(cè)比較 見表2。

表2 各組血清生化指標(biāo)比較（±s，n＝8）

表2 各組血清生化指標(biāo)比較（±s，n＝8）

注：與A組相應(yīng)時(shí)間比較 ，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與B組相應(yīng)時(shí)間比較 ，△P＜0.05，△△P＜0.01

組 別 時(shí)間／周 ALB／（g／L） TCH／（mmol／L） TG／（mmol／L） BUN／（mmol／L） Cr／（μmol／L）A組 0 30．80±1．46 1．95±0．39 2．30±0．91 5．78±1．09 45．30±8．61 3 30．47±0．93 2．00±0．32 2．47±0．95 5．99±0．92 45．13±5．65 7 30．77±1．15 1．98±0．31 2．77±0．57 6．03±0．89 48．43±8．07 B組 0 30．22±1．59 1．99±0．23 2．72±0．88 5．73±0．95 45．05±8．44 3 26．83±1．38＃＃ 6．83±1．38＃＃ 5．62±0．56＃＃ 6．73±1．07 58．49±7．12＃＃7 27．01±1．59＃＃ 6．24±1．11＃＃ 5．73±0．92＃＃ 6．92±0．87 56．68±8．89 C組 7 29．68±1．24△△ 3．98±1．08＃?！鳌?5．51±1．09＃＃ 5．73±0．77 49．61±9．33 D組 7 27．84±1．35＃ 3．78±1．06＃?！鳌?5．18±1．21＃＃ 5．92±0．82 50．95±9．12 E組 7 29．85±1．35△△ 3．18±1．22＃△△ 6．86±0．54＃?！?6．46±1．03 48．77±9．04 F組 7 27．75±2．31＃ 3．36±1．34＃△△ 5．42±1．04＃＃ 6．22±1．04 49．82±8．93

2.3 Western Blotting檢測(cè)VEGF、FLK-1蛋白的表達(dá)水平 見圖1。

圖1 各組VEGF、FLK-1蛋白表達(dá)的比較

2.4 RT-PCR檢測(cè)VEGF及FLK-1 mRNA的表達(dá) 見圖2。

圖2 各組VEGF、FLK-1mRNA表達(dá)的比較

3 討論

蛋白尿是CKD的一個(gè)常見癥狀，也是較難解決的臨床癥狀之一［11］。腎小球?yàn)V過屏障的破壞與蛋白尿的發(fā)生與有著密切的關(guān)聯(lián)［12］，濾過膜由腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜和足細(xì)胞共同構(gòu)成，研究［13］證實(shí)小鼠體內(nèi)VEGF表達(dá)的異常，其濾過膜形成發(fā)生障礙，結(jié)果提示，VEGF的表達(dá)情況可能與濾過膜的形成過程及蛋白尿的發(fā)生有著密切的關(guān)系。另有研究［14］證實(shí)，在維持和調(diào)控腎小球?yàn)V過功能正常運(yùn)行的方面，VEGF及其受體可能起著重要作用，并參與了實(shí)驗(yàn)性非糖尿病動(dòng)物模型腎臟微血管結(jié)構(gòu)的改變。

本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，采用ADR一次性給予大鼠尾靜脈注射，3周后根據(jù)大鼠24 h尿蛋白含量的結(jié)果，提示成功構(gòu)建大鼠腎病模型。本研究巧妙的運(yùn)用給藥后的大鼠血清作為治療ADR損傷的內(nèi)皮細(xì)胞的藥物來源，避免了因直接加藥所帶來的不確定因素。觀察VEGF及其受體FLK-1的表達(dá)，結(jié)果顯示ADR損傷的內(nèi)皮細(xì)胞VEGF、FLK-1蛋白及mRNA的表達(dá)均升高，提示ADR可能導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞通透性的改變，給予相應(yīng)的血清治療后，VEGF、FLK-1蛋白及mRNA的表達(dá)有不同程度的下調(diào)，其中以祛風(fēng)通絡(luò)方及強(qiáng)的松下調(diào)效果顯著。然而，腎上腺皮質(zhì)類激素雖然在治療腎病綜合征方面有顯著的效果，但由于其亦引起各種不良反應(yīng)，在臨床使用中非常謹(jǐn)慎。此外本研究結(jié)果亦表明祛風(fēng)通絡(luò)方在治療大鼠腎病效果方面優(yōu)于血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑苯那普利 ，祛風(fēng)通絡(luò)方聯(lián)合激素治療效果并不理想，其具體機(jī)制還不明確。這些結(jié)果表明，祛風(fēng)通絡(luò)方能夠降低腎病大鼠模型的尿蛋白含量，改善腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的功能，在治療腎病上有著顯著的優(yōu)勢(shì)。

綜上，祛風(fēng)通絡(luò)方能夠下調(diào)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞VEGF及其受體FLK-1的表達(dá)，改善阿霉素大鼠腎病模型的腎功能，值得臨床上進(jìn)一步研究。

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Qufengtongluo recipe on expression of VEGF and its receptor FLK-1in adriamycin-induced rat glomerular endothelial cell

WANG Juan1，CUI Zhijun2，MA Qiaoya1，WANG Zhu1，SUN Wangsen1*
（1．The Newsroom of Chinese Journal of Dermatovenereology，Second Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710004，China；2．Emergency Department，Shanxi Traffic Hospital，Xi'an 710004，China）

Objective To study the effects of qufengtongluo recipe on the expression of VEGF and its receptor FLK-1 in adriamycin-induced rat glomerular endothelial cell．Methods The 30 out of 130 SD rats are used as the control group（A），and the remaining rats are given intravenously adriamycin one-time injecting to construct nephropathy model，and after the model is successfully constructed，rats are randomly divided into model group（B，n＝18），qufengtongluo eecipe group（C group，n＝18），qufeng and hormone group（qufengtongluo recipe and hormones share group，D，n＝18），hormone group（E，n＝18），benazepril group（F，n＝18），to build adriamycin-induced glomerular endothelial cells models，and to give the appropriate serum for treatment，and pyrogallol red／molybdate method is used to detect 24 h urinary protein；automatic biochemical analyzer is used to detect serum albumin（ALB），lipids（total cholesterol，TCH；Triglycerides，TG），renal function（blood urea nitrogen，BUN；serum creatinine，Cr）and RT-PCR；western bloting and RT-PCR are used to detect the expression of VEGF andFLK-1 in the cells．Results Both C，E group can elevate serum ALB，decrease serum TCH，and the differences are significant comparing with group B（P＜0．01）；after glomerular endothelial cells are damaged by ADR，the expression of VEGF and FLK-1proteinand mRNA in group B is higher than that in group A，the difference is significant（P＜0．01），and after adding the appropriate serum lyophilized powder，the expression of VEGF and FLK-1 protein and mRNA in group C，E are down-regulated compared with group B（P＜0．01）．Conclusion Qufengtongluo recipe can decrease expression of VEGF and its receptor FLK-1 in glomerular endothelial cells，and improve renal function in rats with Adriamycininduced nephropathy model．

Qufengtongluo recipe；VEGF；FLK-1；renal function

R285.5

A

2095-6258（2015）05-0897-04

10．13463／j．cnki．cczyy．2015．05．006

2015-02-25）

陜西省科技計(jì)劃項(xiàng)目基金（2004K16-G9）；西安交通大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)自由探索與自主創(chuàng)新類項(xiàng)目（08143035）；西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院院基金重點(diǎn)項(xiàng)目〔YJ（ZD）201203〕。

王 娟（1980-），女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合腎病方向研究。

*通信作者：孫萬森，男，碩士，主任醫(yī)師，電話-15829282087，電子信箱-wangjuan8002＠126．com

C、E組能升高大鼠血清ALB的含量，降低血清TCH的含量，與B組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；腎小球內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)阿霉素?fù)p傷后，B組較A組VEGF、FLK-1蛋白及mRNA的表達(dá)均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），各組加入相應(yīng)血清凍干粉后，C、E組VEGF、FLK-1蛋白表達(dá)均下調(diào)，與B組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論 祛風(fēng)通絡(luò)方能夠下調(diào)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞VEGF及其受體FLK-1的表達(dá)，改善阿霉素大鼠腎病模型的腎功能。