李興華，凌曉曦，張松柏，張德詠,*，劉 勇,*

(1.中南大學研究生院隆平分院， 長沙 410125；2.湖南省植物保護研究所， 長沙 410125)

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湖南省南方水稻黑條矮縮病毒分離物組分S10編碼的ORF序列克隆與分析

李興華1，凌曉曦2，張松柏2，張德詠1,2*，劉 勇1,2*

(1.中南大學研究生院隆平分院， 長沙 410125；2.湖南省植物保護研究所， 長沙 410125)

采用RT-PCR方法擴增并克隆了2013年湖南省水稻上發(fā)生的南方水稻黑條矮縮病毒(Southernriceblack-streakeddwarfvirus，SRBSDV)S10片段的近全長序列，采用生物信息學軟件Mega、RDP和DnaSP分析其編碼的開放閱讀框(open reading fragment，ORF)遺傳多樣性。結果表明：2013年湖南省15個SRBSDV分離物S10編碼的ORF序列同源性在99.5%以上，不同分離物中存在3～30個突變位點，絕大部分的核酸突變?yōu)闊o義突變，沒有發(fā)現可能的重組。在系統發(fā)育樹上，15個分離物聚類為2個分支，其中湖南漢壽的10個分離物和永州的2個分離物(HuNyz12和HuNyz29)與我國浙江分離物聚為1個亞組、湖南永州的其他3個分離物與我國南部的云南、海南等及越南的分離物聚為1個亞組。系統發(fā)育結果表明，SRBSDV隨傳毒介體白背飛虱遷飛從我國南部向北部擴散。

南方水稻黑條矮縮病毒； 湖南分離物； 組分S10； 克隆與分析

南方水稻黑條矮縮病毒(Southernriceblack-streakeddwarfvirus，SRBSDV)是近年來在我國南方稻區(qū)危害非常嚴重的病毒之一，屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)，斐濟病毒屬(Fijivirus)第2組的1個新種[1]。自2009年以來，由SRBSDV侵染引起的南方水稻黑條矮縮病，在我國南方稻區(qū)快速擴展危害，僅2010年，在我國南方稻區(qū)的發(fā)生面積就達到120多萬hm2，稻谷損失達到2.32億kg。湖南省2010年所有稻區(qū)均有SRBSDV危害，發(fā)生面積約53萬hm2，造成嚴重的經濟損失[2]。

SRBSDV由白背飛虱以持續(xù)性傳毒方式進行傳播，主要危害水稻、玉米等禾本科作物[3]。病毒、寄主以及傳毒介體長期的互作過程中，均會發(fā)生相應的適應性改變[4]。研究表明，SRBSDV危害區(qū)域包括熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)，這些地區(qū)的溫度差異大，水稻品種也具有一定差異，這些因素都可能影響傳毒介體和SRBSDV的適應性。SRBSDV的序列分析結果也表明，SRBSDV的組分S1～S6的序列可能存在重組[5]。

然而迄今為止的大多數研究都表明，組分S9和S10的序列中不存在重組[6-8]。僅Li等[9]研究表明，SRBSDV的S10組分中存在重組，且第550位置的密碼子處于正選擇壓力下。組分S10編碼病毒外殼蛋白，該蛋白對于病毒的傳播擴散以及在寄主體內的運輸非常重要，因此，研究組分S10編碼蛋白的遺傳變異，對于了解SRBSDV的進化、適應性具有非常重要的意義。

本研究選擇2013年采集的湖南省水稻主產區(qū)具有典型癥狀或疑似癥狀的水稻樣本，經RT-PCR檢測后，克隆了染病的水稻樣本中SRBSDV的S10近全長序列，分析了S10編碼的ORF序列的遺傳多樣性。

1 材料與方法

1.1 水稻樣品和試劑

水稻樣品于2013年采集自湖南省水稻主產區(qū)，水稻類型包括早稻、中稻和晚稻。采集的水稻樣品包括疑似SRBSDV侵染(38份)和具有典型癥狀(莖稈上沿葉脈有白色瘤狀物)(12份)的水稻，所有樣本保存于-80 ℃。

Trizol試劑、一步法反轉錄試劑盒和PCR反應試劑購自TransGen(北京)。

1.2 總RNA抽提

水稻總RNA抽提采用Trizol法，具體步驟參考說明書。

1.3 水稻樣本RT-PCR檢測

水稻樣本RT-PCR檢測，參考Zhou等的方法[1]，以所提總RNA為模板，采用一步法反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA，具體步驟參考說明書。然后進行PCR擴增(引物S10-F：5′ CGCGTCATCTCAAAACTACAG-3′，S10-R：5′-TTTGTCAGCATCTAAAGCGC-3′)[1]，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。

1.4 SRBSDV S10組分近全長序列克隆

根據GenBank (http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)中SRBSDV S10全序列(JQ692581.1)，采用Oligo7[10]設計3對引物，以RT-PCR檢測結果為陽性的水稻總RNA為模板，擴增目標片段包含SRBSDV S10的ORF及5′和3′部分非編碼區(qū)，引物序列見表1，擴增片段的大小分別為716、719和845 bp。

表1 引物序列

1.5 序列測定與分析

所有PCR產物的序列測定委托上海生工生物工程技術服務有限公司完成，測序獲得的序列利用ntBLAST進行比對(http:∥blast.st-va.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，利用ORFfinder(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)確定S10編碼的ORF。序列聯配、突變位點及系統發(fā)育樹構建采用Mega 4.0軟件[11]。重組分析采用RDP 4軟件[12]，遺傳穩(wěn)定性分析采用DnaSP 5.01軟件[13]。

2 結果與分析

2.1 水稻樣品RT-PCR檢測

2013年采集的水稻樣品(50份)經RT-PCR檢測表明，有24份樣品擴增得到預期目的條帶，其中12份具有典型癥狀的水稻樣本均擴增得到預期目的條帶。測序結果表明，目的條帶與NCBI中其他SRBSDV分離物對應的序列同源性很高(>98%)。

2.2 SRBSDV S10序列克隆

以24份SRBSDV陽性水稻樣品總RNA為模板，利用設計的3對特異性引物，進行RT-PCR擴增，結果表明，設計的3對引物均能擴增出與預期大小一致的單一目的條帶。

24份樣品中有15份樣品經測序成功獲得3個目的條帶的序列，其中S10編碼的ORF序列登錄信息見表2。

表2 SRBSDV陽性樣品S10序列

2.3 SRBSDV S10編碼的ORF序列分析

2.3.1 突變位點分析

序列聯配結果表明，SRBSDV的15個湖南分離物S10 的ORF核酸序列都具有數目不一的突變位點，其中以SRBSDV-HuNhs 4的突變位點最多，有30個位點發(fā)生突變。S10編碼ORF的序列推導蛋白的聯配結果表明，僅有少量核苷酸突變位點，導致其編碼的氨基酸突變。DnaSP軟件分析結果也證實，15個湖南分離物S10 的ORF發(fā)生突變，并不會影響其遺傳穩(wěn)定性(數據未顯示)。

S10 ORF的核酸序列的轉換/顛換率為k1=12.708 (嘌呤)和k2=28.817 (嘧啶)，整體轉換/顛換偏差為R=9.204, 序列變異偏好A/G 或C/T的轉換(表3)。

表3 S10 ORF堿基替換最大可能性分析

2.3.2 重組分析

利用RDP 4軟件的6種算法(RDP、Geneconv、3Seq、SiScan、Bootscan和Chimaera)對湖南15個SRBSDV分離物的S10 ORF進行了重組分析，結果表明，在S10的ORF中沒有檢測到重組現象。

2.3.3 系統發(fā)育分析

S10 ORF的序列同源性分析結果表明，湖南省15個分離物的序列同源性大于99.5%；與海南、湖北、廣西、廣東、江西、浙江、江蘇、安徽、云南、山東和越南分離物的同源性大于99%；與重慶、福建和貴州分離物的序列同源性大于98%。S10 ORF的系統發(fā)育分析結果表明，15個湖南分離物的S10編碼的ORF序列可分為2個亞組，湖南永州的3個分離物聚為亞組Ⅰ，大多數SRBSDV分離物為我國南部的分離物(海南HaiN、云南YN)和越南分離物；湖南漢壽的10個分離物和永州的2個分離物(HuNyz12和HuNyz29)聚為亞組Ⅱ，相對于亞組Ⅰ，該亞組的分離物大多數為我國北方分離物(浙江ZJ)。值得注意的是，在亞組Ⅱ中，還包含湖南永州的2個分離物(HuNyz12和HuNyz29)處于一個相對獨立的分支。

系統發(fā)育分析的地區(qū)劃分以北緯30o為分界線，湖南永州位于南部、漢壽位于北部。位于湖南最南部的永州市3個SRBSDV分離物，與我國南部稻區(qū)的分離物(海南HaiN、云南YN)和越南分離物聚為1個亞組；而位于湖南最北部的漢壽縣的10個SRBSDV分離物和永州的2個分離物(HuNyz12和HuNyz29)聚為亞組Ⅱ，該亞組包含的SRBSDV的分離物大多數為我國北方分離物(浙江ZJ)。該結果表明，SRBSDV S10編碼的ORF的序列具有一定的地域差異。值得注意的是，在亞組Ⅱ中，還包含湖南永州的2個分離物(HuNyz12和HuNyz29),處于一個相對獨立的分支，該結果表明，湖南漢壽和永州的SRBSDV S10編碼的ORF序列存在相關性，這2個分離物可能是聯系亞組Ⅰ和亞組Ⅱ的“橋梁”。

系統發(fā)育樹分析結果還表明，我國北部的SRBSDV分離物絕大多數聚在亞組Ⅱ，僅4個分離物聚在亞組Ⅰ，占亞組Ⅰ的9.7%；而我國南部SRBSDV分離物大部分聚在亞組Ⅰ，有8個聚在亞組Ⅱ，占亞組Ⅱ的29.6%；這表明我國南部的SRBSDV分離物的多樣性高于北部。

圖1 SRBSDV S10 ORF系統發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of SRBSDV S10 ORFs

3 討論

SRBSDV僅由白背飛虱傳播、擴散危害[3]，因此，現有的南方水稻黑條矮縮病毒的分離物有著高同源性和低變異度，揭示了南方水稻黑條矮縮病毒來源單一的特點[14]。湖南省15個SRBSDV分離物的S10 ORF同源性非常高(>99.5%)，與其他研究報道的結果一致，并且這15個分離物與其他省份的SRBSDV的S10 ORF的同源性大于98%，表明湖南省的SRBSDV與其他省份的來源一致。然而，對于南方水稻黑條矮縮病毒的起源地，目前還沒有直接的研究證據。

湖南省15個SRBSDV-S10的ORF高度同源(>99.5%),與我國其他省份和越南分離物的同源性也非常高(>98%)，然而，系統發(fā)育分析表明，湖南省15個SRBSDV-S10的ORF可以分為2個亞組(圖1)，表明SRBSDV在湖南省的傳播擴散過程中，也存在進化壓力[4]。

系統發(fā)育分析結果還表明，湖南省SRBSDV 15個分離物的多樣性，與我國其他地區(qū)SRBSDV的多樣性趨勢一致，均是南部SRBSDV分離物的多樣性高于北部(圖1)。而SRBSDV的傳毒介體白背飛虱，研究表明，也是從東南亞和/或我國南部向北部遷飛[15]，該結果暗示，SRBSDV傳播擴散與傳播介體白背飛虱的遷移類似，也是從我國南部向北部遷移。這與白背飛虱是目前已知的SRBSDV唯一傳毒介體的研究結論一致[3]。

在植物病毒的進化中，突變、重組、重排等發(fā)揮主要的作用，從而使病毒適應寄主、環(huán)境等因素的變化，增強致病性，有利于病毒的擴展危害[4]。對SRBSDV的研究表明，在S1、S2、S4、S5、S6中發(fā)現了重組現象[5]。然而，對絕大多數S10序列的突變、重組等研究表明，S10不存在重組現象[7-8]。僅Li等[9]利用生物學軟件HYPHY發(fā)現SRBSDV的S10組分中存在重組，且第550位置的密碼子處于正選擇壓力下，作者指出，該結論還有待進一步驗證。本研究結論與大多數研究結論一致，表明湖南省分離物S10編碼的ORF遺傳非常穩(wěn)定。然而，湖南省分離物S10編碼的ORF也存在一些位點突變，雖然僅有3～5個位點導致氨基酸殘基突變，但是，該結果暗示，湖南省分離物S10編碼的ORF，在隨白背飛虱遷入湖南后，因寄主、環(huán)境因素等的影響，也存在進化壓力，這種進化是否對SRBSDV的群體產生影響、產生何種影響以及對病害的防控有何啟示尚需進行跟蹤監(jiān)控和進一步的深入研究。

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Sequences cloning and analysis of ORF of fragment S10 in Hunan isolates ofSouthernriceblack-streakeddwarfvirus

Li Xinghua1, Ling Xiaoxi2, Zhang Songbai2, Zhang Deyong1,2, Liu Yong1,2

(1. Longping Branch, Graduate College, Central South University, Changsha 410125, China;2. Hunan Plant Protection Institute, Changsha 410125, China)

The nearly full-length of the genome segment 10 (S10) ofSouthernriceblack-streakeddwarfvirus(SRBSDV) isolates sampled in 2013 in Hunan Province was cloned and sequenced. The identity of 15 isolates of S10 ORF was higher than 99.5%. There were 3-30 mutation positions, nevertheless most of them were nonsense, and there was no putative recombination event in ORF of S10 sequences of 15 isolates. The results of phylogenetic analysis showed ORFs of S10 of 15 isolates were divided into two clusters, 10 isolates of Hanshou County and 2 isolates of Yongzhou County and those isolates of Zhejiang Province in cluster one, and the others 3 isolates of Yongzhou County and those isolates of South of China and Vietnam in cluster two. Phylogenetic analysis showed SRBSDV was transmitted by white back planthopper from Southern to Northern of China.

Southernriceblack-streakeddwarfvirus; Hunan isolates; segment S10; cloning and analysis

2014-07-25

2014-12-16

公益性行業(yè)(農業(yè))科研專項(201003031)

S 435.111; S 434.41

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.02.024

* 通信作者 E-mail: dyzhang78@163.com; haoasliu@163.com