陳金奕，張朝賢*，黃紅娟，魏守輝，劉 延，黃兆峰，陳景超，楊 龍，王 旭

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院雜草鼠害生物學(xué)與治理重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.黑龍江農(nóng)墾科學(xué)院，哈爾濱 150038)

?

研究簡(jiǎn)報(bào)
Research Notes

反枝莧對(duì)咪唑乙煙酸抗性水平及分子機(jī)制

陳金奕1，張朝賢1*，黃紅娟1，魏守輝1，劉 延2，黃兆峰1，陳景超1，楊 龍1，王 旭1

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院雜草鼠害生物學(xué)與治理重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.黑龍江農(nóng)墾科學(xué)院，哈爾濱 150038)

為初步明確大豆田反枝莧對(duì)咪唑乙煙酸的抗藥性水平，并從分子角度對(duì)抗藥性機(jī)制進(jìn)行解釋，以我國四川成都和黑龍江嫩江采集的反枝莧種子為材料，通過瓊脂法檢測(cè)了反枝莧對(duì)咪唑乙煙酸的抗藥性水平，并分別對(duì)R(嫩江抗性種群)和S(成都敏感種群)的乙酰乳酸合成酶(ALS)部分序列進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序。皿內(nèi)生測(cè)結(jié)果表明，成都種群的GI50為11.20，嫩江種群的GI50為52.26，其抗藥性指數(shù)RI為4.67。分子檢測(cè)結(jié)果表明，與S種群相比，R種群反枝莧ALS位于高度保守區(qū)Domain B編碼574位氨基酸的基因發(fā)生突變，TGG突變?yōu)門TG，導(dǎo)致色氨酸被亮氨酸取代。ALS保守區(qū)域氨基酸的替換可能是嫩江反枝莧種群對(duì)咪唑乙煙酸產(chǎn)生抗性的重要原因之一。

反枝莧； 咪唑乙煙酸； 抗藥性； 突變

反枝莧(AmaranthusretroflexusL.),英文名為redroot pigweed，別名為西風(fēng)谷、野米谷等，是我國農(nóng)田、果園常見的一年生莧科闊葉雜草。反枝莧于19世紀(jì)40年代入侵我國，因產(chǎn)籽量大、適應(yīng)性強(qiáng)的特點(diǎn)而廣泛分布，在我國暖溫帶危害面積達(dá)36%[1-3]，在世界多地被列為惡性雜草。咪唑乙煙酸，商品名為普施特，是20世紀(jì)80年代美國氰胺公司開發(fā)的咪唑啉酮類除草劑優(yōu)秀品種, 作用靶標(biāo)為乙酰乳酸合成酶(ALS)，目前廣泛應(yīng)用于大豆田化學(xué)除草。針對(duì)其殘留特點(diǎn)，目前已成功開發(fā)了抗咪唑啉酮類作物如玉米、油菜、小麥、水稻等，擴(kuò)大了該類除草劑的應(yīng)用范圍[4]。乙酰乳酸合成酶，又名乙酰羥酸合成酶，是由細(xì)胞核編碼的葉綠體酶。它是控制植物體內(nèi)合成支鏈氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸)公共途徑的關(guān)鍵酶，為磺酰脲類、咪唑啉酮類等多種高效低毒除草劑的靶標(biāo)酶。

世界范圍內(nèi)已對(duì)ALS抑制劑抗藥性進(jìn)行了很多報(bào)道。目前已發(fā)現(xiàn)的144種ALS抑制劑抗藥性雜草中，共有8個(gè)ALS基因位點(diǎn)突變的發(fā)生經(jīng)證實(shí)與抗藥性產(chǎn)生直接相關(guān)[5-7]。這些位點(diǎn)在擬南芥ALS氨基酸序列中相應(yīng)的位置及表達(dá)的氨基酸分別為第122 位丙氨酸(Ala122)，第197位脯氨酸(Pro197)，第205位丙氨酸(Ala205)，第376位天冬氨酸(Asp376)，第377位精氨酸(Arg377)，第574位色氨酸(Trp574)，第653位絲氨酸(Ser653)和第654位甘氨酸(Gly654)。高等植物ALS氨基酸序列有5個(gè)不連續(xù)的高度保守區(qū)，分別為Domain C、Domain A、Domain D、Domain B 和 Domain E。其中，A122位于Domain C；P197位于Domain A；A205位于Domain D；W574位于Domain B；S653位于Domain E。

國外最早于1980年分別在加拿大、法國、德國和美國的農(nóng)田發(fā)現(xiàn)了抗莠去津的反枝莧。我國于1990年在黑龍江的多個(gè)地塊也發(fā)現(xiàn)了抗莠去津的反枝莧[8]，另外抗氯嘧磺隆的反枝莧也在遼寧省有發(fā)現(xiàn)[9]。但我國反枝莧抗藥性及其機(jī)理尚未明確。本研究旨在初步明確我國黑龍江大豆田反枝莧對(duì)咪唑乙煙酸的抗藥性水平，探索反枝莧的抗藥性分子機(jī)制，為農(nóng)田雜草抗藥性的監(jiān)測(cè)和治理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試草種：采自四川、黑龍江的2個(gè)反枝莧(A.retroflexus)種群(見表1)。

供試藥劑：50 g/L咪唑乙煙酸水劑(巴斯夫歐洲公司)。

表1 反枝莧種群采集地點(diǎn)及用藥史

1.2 抗藥性水平測(cè)定

1.2.1 瓊脂法

種子催芽: 反枝莧種子在200 mg/L的赤霉素溶液中浸泡12 h，打破休眠。浸泡后的種子洗凈晾干。在直徑為90 mm的培養(yǎng)皿中墊雙層濾紙，加入10 mL蒸餾水。播入待測(cè)反枝莧種子，加蓋后放入RXZ-280 c型人工氣候箱中培養(yǎng)，選取整齊露白的種子待測(cè)。催芽條件為光照14 h，黑暗10 h，溫度30 ℃，濕度33%。

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，參照曹坳程[10]的方法，依次取10 mL不同濃度的咪唑乙煙酸藥液與20 mL溫度約65 ℃的瓊脂水溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%)混勻，使混合液中有效成分咪唑乙煙酸的終濃度分別達(dá)到7、14、28、56、112、224 mg/L，使用移液槍吸取10 mL混合液轉(zhuǎn)入3個(gè)培養(yǎng)皿(直徑60 mm)中。以蒸餾水為對(duì)照。待瓊脂冷卻后，各種群選擇整齊露白的反枝莧種子20粒，均勻播入皿內(nèi)。加蓋，使用封口膜封閉。在光照14 h，黑暗10 h，光照強(qiáng)度為10 000 lx，溫度(27±1)℃，濕度(30±7)%的RXZ-280 c型的人工氣候箱中培養(yǎng)5 d后，測(cè)量各皿中20株反枝莧的根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)并記錄。

1.2.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

計(jì)算2種群的芽長(zhǎng)抑制率，公式如下：

芽長(zhǎng)抑制率(%)=(對(duì)照芽長(zhǎng)-處理芽長(zhǎng))/對(duì)照芽長(zhǎng)×100。

使用DPS v 7.05軟件，將芽長(zhǎng)抑制率轉(zhuǎn)化為幾率值，求得毒力回歸方程、生長(zhǎng)抑制中濃度(GI50)、相關(guān)系數(shù)r。并根據(jù)以下公式計(jì)算出抗藥性指數(shù)(RI)：

抗藥性指數(shù)(RI)=抗藥性種群GI50/敏感性種群GI50。

1.3 分子檢測(cè)

1.3.1 試材培養(yǎng)

取成都、嫩江2種群種子催芽(步驟同瓊脂法)后播種。取上口直徑10 cm，高10 cm的塑料盆，填入砂壤土與草炭體積比為2∶1的土壤，每盆均勻播種約30粒種子，覆土1 cm，置于溫室內(nèi)培養(yǎng)。試驗(yàn)期間溫室溫度白天(30±5)℃，夜間為(20±5)℃，相對(duì)濕度(60±5)%。在2～3葉期間苗，每盆定株10株。待葉片長(zhǎng)至4～6葉期，各種群取至少10株單株的幼嫩葉片(0.3 g/株)，經(jīng)消毒處理后，單株包裝，放入-80 ℃冰箱內(nèi)保存，備用。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI的GenBank于2005年提交的反枝莧ALS序列(登錄號(hào)AF363369.1)設(shè)計(jì)4對(duì)引物(表2)，分別包括已經(jīng)報(bào)道并確認(rèn)能夠產(chǎn)生抗性的8個(gè)突變位點(diǎn)。其中，IF/IR擴(kuò)增包括Ala122在內(nèi)的192 bp的片段；ⅡF/ⅡR擴(kuò)增包括Pro197、Ala205兩個(gè)位點(diǎn)在內(nèi)的385 bp的片段；ⅢF/ⅢR擴(kuò)增片段為210 bp，包含Asp376、Arg377兩位點(diǎn)；IVF/IVR擴(kuò)增片段為410 bp，包含Trp574、Ser653、Gly654三個(gè)位點(diǎn)。引物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。用溫度梯度PCR儀(Biometra T-Gradient Thermoblock)確定每對(duì)引物的最佳退火溫度。

表2 擴(kuò)增反枝莧ALS基因的4對(duì)引物

1.3.3 ALS基因片段的克隆

兩種群?jiǎn)沃曛参锶~片分別在液氮中研磨成細(xì)粉，使用Tiangen公司的DNAquick Plant System快捷型植物基因組DNA提取系統(tǒng)提取基因組DNA，兩種群各獲得10株植物的DNA樣品。PCR的25 μL反應(yīng)體系包括：8.5 μL的ddH2O，12.5 μL的2×Pfu PCR MasterMix(Tiangen公司)，2 μL的反枝莧基因組DNA，上下游引物各1 μL(10 μmol/L)。PCR條件設(shè)定為：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s，X ℃退火30 s(X為4對(duì)引物的退火溫度)，72 ℃延伸30 s，共33個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)。對(duì)目的條帶進(jìn)行切膠回收，純化后連接到pMD18-T載體，然后轉(zhuǎn)到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有ampicillin和X-gal/IPTG的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取15個(gè)白色單菌落到含ampicillin的LB培養(yǎng)液中，以200 r/min的速度在37 ℃ 振蕩培養(yǎng)5 h，然后以菌液為模板進(jìn)行轉(zhuǎn)化鑒定。25 μL的PCR體系包括：9.5 μL ddH2O，12.5 μL的2×Pfu PCR MasterMix(Tiangen公司)，1 μL的菌液，上下游引物各1 μL(10 μmol/L)。電泳檢測(cè)后，挑選至少5個(gè)陽性克隆送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，引物為通用引物M13，單向測(cè)序。

1.3.4 生物信息學(xué)分析

用DNAMAN v6軟件對(duì)試驗(yàn)反枝莧種群ALS基因片段的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，尋找8個(gè)突變位點(diǎn)的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 瓊脂法測(cè)定反枝莧對(duì)咪唑乙煙酸的抗藥性水平差異

圖1為瓊脂法中，按照有效成分咪唑乙煙酸濃度遞增順序排列的反枝莧幼苗形態(tài)。由圖可見，隨著藥劑濃度的增加，成都種群(a)在7 mg/L時(shí)根長(zhǎng)即顯著受到抑制；嫩江種群(b)在7 mg/L根長(zhǎng)幾乎沒有變化，當(dāng)藥劑濃度增加到56 mg/L時(shí)，根長(zhǎng)才明顯受到抑制。與抗藥性種群相比，敏感性種群的根長(zhǎng)對(duì)除草劑的反應(yīng)更加敏銳，這與Tal等[11]進(jìn)行的試驗(yàn)中，硬直黑麥草對(duì)禾草酸的種子生測(cè)反應(yīng)結(jié)果一致。

圖1 反枝莧對(duì)咪唑乙煙酸的皿內(nèi)生測(cè)反應(yīng)Fig.1 Response of two Amaranthus retroflexus populations to imazethapyr in seed-bioassay

2個(gè)反枝莧種群對(duì)咪唑乙煙酸的抗藥性水平回歸分析結(jié)果見表3。從表3可看出，線性回歸相關(guān)系數(shù)r均大于0.90，說明隨著咪唑乙煙酸濃度的增加，反枝莧芽長(zhǎng)逐漸縮短的變化規(guī)律符合線性回歸。成都種群的GI50為11.20 mg/L，嫩江種群的GI50為52.26 mg/L?？顾幮灾笖?shù)(RI，resistance index)為4.67。

表3 反枝莧對(duì)咪唑乙煙酸的抗性水平

2.2 反枝莧ALS基因片段的生物學(xué)信息分析

經(jīng)基因組DNA提取、包含8個(gè)突變位點(diǎn)的部分ALS片段的PCR擴(kuò)增、連接轉(zhuǎn)化及鑒定、測(cè)序等步驟，獲得目的片段的核苷酸序列。將各長(zhǎng)度一致片段與擬南芥ALS序列進(jìn)行比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，與S種群相比，R種群的10株單株均在高度保守區(qū)Domain B處發(fā)生了基因突變。TGG突變?yōu)門TG，導(dǎo)致574位的色氨酸被亮氨酸取代。

表4 擬南芥與反枝莧R、S種群ALS基因片段及編碼氨基酸的比較1)

1)加粗字體為574位編碼氨基酸的核苷酸突變情況。

The bold nucleotide bases show the mutations in R populations compared with those inArabidopsis.

3 討論

本試驗(yàn)通過瓊脂法，對(duì)采自四川和黑龍江省2個(gè)反枝莧種群的抗藥性水平進(jìn)行了快速檢測(cè)，結(jié)果表明，與成都種群(S)相比，嫩江種群(R)的抗藥性指數(shù)RI為4.67，已經(jīng)產(chǎn)生了一定程度的抗性。對(duì)咪唑乙煙酸靶標(biāo)酶ALS部分片段進(jìn)行克隆、測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，抗藥性種群——黑龍江嫩江種群的靶標(biāo)酶ALS的高度保守區(qū)域Domain B發(fā)生了基因突變，574位TGG突變?yōu)門TG，導(dǎo)致色氨酸被亮氨酸取代。突變的發(fā)生可能是導(dǎo)致反枝莧對(duì)咪唑乙煙酸產(chǎn)生抗藥的重要原因之一。

皿內(nèi)種子測(cè)定法是常用的農(nóng)田雜草抗藥性檢測(cè)方法，皿內(nèi)介質(zhì)通常有濾紙和瓊脂2種。2007年Yang等采用濾紙法研究日本看麥娘對(duì)高效氟吡甲禾靈的抗性[12]，其結(jié)果與整株植物測(cè)定法趨勢(shì)一致。Tal等[11]在檢測(cè)幾種禾本科雜草對(duì)ACCase抑制劑類除草劑的抗藥性水平試驗(yàn)中，使用了濾紙法。黃媛媛等[9]在檢測(cè)反枝莧對(duì)氯嘧磺隆的抗藥性水平時(shí)采用了瓊脂法。盡管相對(duì)于整株植物測(cè)定法和酶活測(cè)定等方法來說，皿內(nèi)生測(cè)的結(jié)果不夠準(zhǔn)確(具體表現(xiàn)在測(cè)定的抗性指數(shù)值較低)，但其具有試驗(yàn)周期短、占用場(chǎng)地小、節(jié)省人力等優(yōu)點(diǎn)，是快速鑒定抗性種群的方法之一。

雜草對(duì)ALS抑制劑的抗藥性機(jī)制主要有靶標(biāo)位點(diǎn)抗性(TSR，target-site resistance)和非靶標(biāo)位點(diǎn)抗性(NTSR，non-target-site resistance)2種?；诎袠?biāo)位點(diǎn)的ALS抑制劑抗性是由于ALS的編碼基因中單個(gè)氨基酸的取代造成的[13-15]，這種取代在ALS基因內(nèi)部許多位點(diǎn)均有發(fā)生。在過去20年里，在50個(gè)雜草種群中，共發(fā)現(xiàn)8個(gè)突變位點(diǎn)以及26種氨基酸替代方式。迄今為止，在28種抗性雜草中，Trp574位已發(fā)現(xiàn)2種由于突變產(chǎn)生的氨基酸替代方式，分別為亮氨酸和甘氨酸[16]。國外關(guān)于反枝莧抗性機(jī)制已有報(bào)道，McNaughton等發(fā)現(xiàn)Trp574被Leu替換導(dǎo)致反枝莧對(duì)咪唑乙煙酸和噻吩璜隆產(chǎn)生抗性[17]，這2種藥劑與嫩江縣長(zhǎng)期大量使用的藥劑咪唑乙煙酸、氯嘧磺隆分別同屬咪唑啉酮類、磺酰脲類除草劑，本研究的結(jié)果與之相符。

非靶標(biāo)位點(diǎn)的除草劑抗性可能由除草劑代謝機(jī)制的增強(qiáng)引起。對(duì)除草劑的代謝能夠最大程度地減少到達(dá)靶標(biāo)位點(diǎn)的除草劑量，P450解毒酶和GSTs可能參與了這種機(jī)制[18-19]。本次試驗(yàn)沒有對(duì)除草劑代謝進(jìn)行研究，因此不能排除其對(duì)抗性產(chǎn)生的貢獻(xiàn)，這有待后續(xù)研究進(jìn)行證實(shí)。

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Imazethapyr resistance and its molecular resistance mechanism inAmaranthusretroflexusL.

Chen Jinyi1, Zhang Chaoxian1, Huang Hongjuan1, Wei Shouhui1, Liu Yan2，Huang Zhaofeng1，Chen Jingchao1, Yang Long1，Wang Xu1

(1.Institute of Plant Protection, Key Laboratory of Weed and Rodent Biology and Management,Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China; 2. Heilongjiang Academy of Land Reclamation Sciences, Harbin 150038, China)

To evaluate resistance levels ofAmaranthusretroflexusL. to imazethapyr,an ALS inhibitor, seeds from Sichuan and Heilongjiang provinces in China were collected. Agar bioassays demonstrated that the GI50values of resistant(R) and susceptible(S) population were 52.26 and 11.20, respectively, and the resistance index was 4.67. Fragments encoding the ALS were amplified and cloned from S and R population and sequenced subsequently. The result showed that the nucleotide sequence of R population differed from that of the S population with one amino acid substitution of Leu (TTG)for Trp574(TGG) located in the highly conserved region Domain B. The substitution of Leu for Trp574 might be responsible for the resistance to imazethapyr in the R population ofA.retroflexus.

Amaranthusretroflexus; imazethapyr; resistance; mutation

2014-02-24

2014-06-18

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303022)

S 481.4

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.02.023

* 通信作者 E-mail: cxzhang@ippcaas.cn