龐 博，劉秀麗，張金文，王 蒂，張俊蓮

(甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，蘭州 730070)

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實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)
ExperimentalMethod&Technology

馬鈴薯4種病毒多重PCR檢測體系的建立

龐 博，劉秀麗，張金文*，王 蒂，張俊蓮

(甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，蘭州 730070)

我國馬鈴薯病毒主要有馬鈴薯Y病毒(PVY)、馬鈴薯X病毒(PVX)、馬鈴薯S病毒(PVS)、馬鈴薯卷葉病毒(PLRV)，常發(fā)生復(fù)合侵染。根據(jù)GenBank中4種馬鈴薯病毒的外殼蛋白(coat protein，CP)基因全長設(shè)計(jì)引物，通過RT-PCR擴(kuò)增得到4種病毒CP基因全長片段，測序結(jié)果顯示序列同源性96%以上；針對4種病毒CP基因的保守序列分別設(shè)計(jì)引物，在一個(gè)PCR體系中同步對4種病毒進(jìn)行擴(kuò)增，得到421、202、516、330 bp的特異性條帶，優(yōu)化建立了能同步檢測PVY、PVX、PVS和PLRV的多重RT-PCR檢測體系。檢測結(jié)果證明優(yōu)化后的多重RT-PCR體系能在田間樣品中快速、高效地檢測出4種病毒。

分子檢測； 多重RT-PCR； 馬鈴薯病毒

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)是甘肅省除小麥、玉米外的第三大糧食作物[1]。隨著產(chǎn)業(yè)發(fā)展和種植面積擴(kuò)大，馬鈴薯病害逐年加重，特別是病毒病害，其導(dǎo)致品質(zhì)和產(chǎn)量下降甚至引起品種退化[2]。已報(bào)道的馬鈴薯病毒、類病毒達(dá)40多種，其中危害嚴(yán)重的有馬鈴薯X病毒(PVX)、馬鈴薯Y病毒(PVY)、馬鈴薯卷葉病毒(PLRV)、馬鈴薯S病毒(PVS)、馬鈴薯A病毒(PVA)、馬鈴薯M病毒(PVM)及馬鈴薯紡錘塊莖類病毒(PSTVd)等，調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)PVY、PVX、PVS及PLRV通常復(fù)合侵染馬鈴薯[3-5]使其危害加劇，需要可靠、方便、經(jīng)濟(jì)的檢測方法。

馬鈴薯病毒檢測的分子生物學(xué)技術(shù)主要有：RT-PCR檢測技術(shù)[6-7]、指示分子NASBA檢測技術(shù)[8]和核酸雜交檢測技術(shù)[9]三大類，其中RT-PCR技術(shù)具有快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，可進(jìn)行大批量的樣本檢測，克服了指示植物法、血清學(xué)鑒定、電鏡法鑒定以及其他檢測方法中的一些缺點(diǎn)，比如檢測周期長、敏感度低、價(jià)格昂貴、技術(shù)條件要求高、工作量大[10]。常用的單重RT-PCR檢測，在1個(gè)反應(yīng)管中只能擴(kuò)增1種核酸片段，如要檢測復(fù)合侵染樣品中的幾種病毒時(shí)，則需進(jìn)行多次RT-PCR反應(yīng)，操作步驟繁瑣、易造成交叉污染，不能滿足現(xiàn)代檢測的需求。多重PCR是在同一反應(yīng)體系中加入兩對以上特異性引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的PCR反應(yīng)，多重PCR不僅有單重PCR的特異性和靈敏度[11-12]而且更具經(jīng)濟(jì)性[13]?，F(xiàn)在已廣泛應(yīng)用于基因分型和植物病毒的檢測與鑒別。王鳳格等[14]利用多重PCR技術(shù)提高了玉米DNA指紋庫的構(gòu)建效率，鄭軒等[15]應(yīng)用多重PCR技術(shù)開展了對5種煙草病毒的檢測研究，范旭東等[16]建立了葡萄病毒病害的多重PCR同步檢測技術(shù)。本文針對馬鈴薯4種病毒建立了特異、高效的多重PCR檢測體系，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

2012年7月從甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所會川馬鈴薯育種實(shí)驗(yàn)基地隨機(jī)采集可能被病毒感染，有明顯花葉、皺縮、矮化等癥狀的馬鈴薯葉片，按照疑似病毒種類分別裝在潔凈塑料袋中，保存于-70 ℃低溫冰箱。以實(shí)驗(yàn)室保存的脫毒馬鈴薯試管苗作為陰性材料。

植物RNA提取試劑盒購自O(shè)mega公司, RevertAid Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo公司，Universal DNA Purification Kit DNA純化回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，TaqDNA聚合酶、pMD19-T vector、氨芐青霉素、X-gal、IPTG、限制性內(nèi)切酶等均購自TaKaRa(大連)寶生物有限公司，E.coliDH5α菌株為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 引物合成

通過查詢GenBank中馬鈴薯4種病毒(PVX、PVY、PVS 和PLRV)CP基因序列，利用NCBI BLAST分別比對不同國家及地區(qū)已發(fā)表的PVX、PVY、PVS和PLRV的CP基因序列，尋找每種病毒各自的保守片段，利用Primer 6.0和多因素引物特異性評估系統(tǒng)MFEprimer 2.0[17-18]分析引物(表1)，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 多重PCR檢測擴(kuò)增的病毒特異性引物序列

1.3 總RNA提取

采用Omega公司Plant RNA Kit試劑盒提取疑似帶毒馬鈴薯葉片和脫毒馬鈴薯葉片的總RNA作為待測的病毒RNA和陰性對照。提取步驟參照試劑盒說明書。

1.4 cDNA合成

反轉(zhuǎn)錄體系總體積20 μL，其中RNA 5 μL，Oligo(dT)18引物(100 μmol/L)1 μL[19]，隨機(jī)引物(100 μmol/L)1 μL，DEPC H2O 5 μL，先將這12 μL混合后在65 ℃放置5 min，然后冰上放置5 min，再加入5×反應(yīng)緩沖液 4 μL，RNA酶抑制劑(20 U/μL)1 μL，dNTP Mix(2.5 mmol/L each)2 μL，逆轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μL)1 μL。在42 ℃反應(yīng)60 min，70 ℃放置5 min，-20 ℃保存。

1.5 病毒CP全長基因擴(kuò)增體系

PCR反應(yīng)體系(25 μL)：17 μL dd H2O，2.5 μL 10×PCR Buffer(Mg2+Plus)，2 μL dNTP(各2.5 mmol/L)，上游和下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，0.5 μLTaqDNA聚合酶(5 U/μL)和2 μL cDNA模板。PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，退火30 s，溫度分別為：PVYcp 52.3 ℃、PVScp 54 ℃、PVXcp 53.4 ℃、PLRVcp 52.2 ℃，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min。取8 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.6 PCR產(chǎn)物的克隆和測序

PVY、PVS、PVX和PLRV的CP基因全長片段用天根DNA純化提取試劑盒回收純化，然后與pMD19-T vector 4 ℃過夜連接，采用CaCl2法制備E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含Amp(100 mg/L)、X-Gal(20 g/L)和IPTG(50 g/L)的LB平板培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)14～16 h，4 ℃放置2 h后進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑取陽性克隆提取質(zhì)粒，放置-20 ℃保存，質(zhì)粒經(jīng)酶切和PCR驗(yàn)證后送北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行序列測定。

1.7 多重PCR反應(yīng)

將分別含有PVYcp、PVXcp、PVScp和PLRVcp全長序列的質(zhì)?；旌?，作為多重RT-PCR反應(yīng)的模板，將各病毒特異性引物同時(shí)加入一個(gè)反應(yīng)管作為混合引物(表1)。多重PCR反應(yīng)體系(25 μL):19 μL ddH2O，2.5 μL 10 ×PCR buffer(Mg2+Plus)，0.5 μL dNTP(各2.5 mmol/L)，0.5 μL上下游混合引物，0.5 μLTaqDNA聚合酶(5 U/μL)，0.5 μL 二甲基亞砜(DMSO)和1.5 μL混合質(zhì)粒模板。PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù):94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次;最后72 ℃延伸15 min。取8 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分析比較。

1.8 MFEprimer 2.0的使用和多重PCR反應(yīng)體系優(yōu)化

使用在線MFEprimer 2.0評估引物和模板特異性結(jié)合能力[20]，對引物序列可能產(chǎn)生的非特異性擴(kuò)增進(jìn)行預(yù)測并虛擬出多重PCR電泳結(jié)果。多重PCR擴(kuò)增效果的影響因素主要包括反應(yīng)體系和反應(yīng)條件二大類[21]，其中反應(yīng)體系包括引物、緩沖液、模板和TaqDNA 聚合酶、dNTP、輔助劑等，反應(yīng)條件包括退火溫度、循環(huán)數(shù)等。

1.9 田間樣品檢測

對田間樣品進(jìn)行多重RT-PCR 檢測，驗(yàn)證多重RT-PCR 檢測效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒RNA質(zhì)量的檢測結(jié)果

用Plant RNA Kit植物RNA提取試劑盒可從患病葉片上提取到較完整的總RNA，在凝膠中可見28S、18S和5S 3條清晰的條帶，提取的總RNA滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。提取樣品RNA的A260/A280比值在1.7～1.9，表明組織中的蛋白質(zhì)和酚類物質(zhì)基本去除，所提取的RNA純度較理想，可用于后續(xù)研究。

2.2 病毒CP全長基因擴(kuò)增結(jié)果

以PVX、PVY、PVS、PLRV 4 種病毒的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA作為PCR反應(yīng)的模板，分別使用各病毒特異性引物擴(kuò)增得到4種病毒PLRV、PVS、PVX、PVY的CP基因全長片段。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測分別得到大小為628、931、831、858 bp的4條特異性條帶(圖1)。電泳結(jié)果表明，PVX、PVY、PVS、PLRV 4種病毒CP基因全長的擴(kuò)增產(chǎn)物大小與引物設(shè)計(jì)產(chǎn)物大小相同。

圖1 馬鈴薯卷葉病毒、馬鈴薯S病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒的外殼蛋白基因全長片段Fig.1 The amplified full-length CP genes of PLRV, PVS, PVX and PVY

2.3 PCR產(chǎn)物序列分析

割膠回收擴(kuò)增的PVX、PVY、PVS、PLRV 4種病毒CP基因全長片段，與pMD19-T vector進(jìn)行連接，導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒，質(zhì)粒經(jīng)酶切和PCR驗(yàn)證后測序。測序結(jié)果經(jīng)BLAST分析表明所得序列與NCBI參考序列的同源性分別達(dá)到96%、99%、97%、99%，證明了RT-PCR檢測結(jié)果的可靠性。

2.4 建立多重RT-PCR

將含有PVX、PVY、PVS、PLRV 4種病毒CP基因全長的質(zhì)粒按照1∶1∶1∶1比例混合成為PCR模板，并作為陽性對照。針對PVX、PVY、PVS、PLRV的CP保守基因設(shè)計(jì)引物(表1)，經(jīng)單重PCR擴(kuò)增分別得到大小為138、421、516和330 bp的4條特異性條帶。先采用和單重PCR相同的反應(yīng)體系，4對引物按照1∶1∶1∶1比例配成混合引物，25 μL體系中加入1 μL混合引物，采用54 ℃的退火溫度，混合質(zhì)粒作為模板，脫毒馬鈴薯cDNA作為陰性對照。多重PCR結(jié)果顯示陰性對照未擴(kuò)增出條帶，PVX和PVS條帶較弱，PLRV與PVX之間有隱約出現(xiàn)非特異性條帶。

2.5 多重RT-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化

2.5.1 dNTP濃度優(yōu)化

在多重PCR反應(yīng)中，dNTP濃度過高時(shí)PCR的反應(yīng)將會被迅速抑制而且容易出現(xiàn)非特異性條帶。當(dāng)dNTP的濃度過低時(shí)，擴(kuò)增目的片段的產(chǎn)量將會大大降低。在25 μL反應(yīng)體系中dNTP由0.75 μL降低到0.5 μL后，PLRV與PVX條帶之間非特異性條帶消失，25 μL PCR反應(yīng)體系中加入0.5 μL dNTP，dNTP終濃度為0.05 mmol/L時(shí)擴(kuò)增效果最好。

2.5.2 多重PCR反應(yīng)引物優(yōu)化

多重PCR反應(yīng)中引物的設(shè)計(jì)至關(guān)重要，引物的特異性、幾對引物的退火溫度、引物間的配對、各目的片段之間的非特異性擴(kuò)增均影響多重PCR的擴(kuò)增效果。設(shè)計(jì)引物時(shí)應(yīng)考慮:(1)根據(jù)CP基因的高度保守區(qū)設(shè)計(jì)4對引物，引物相互之間及與其他病毒之間均無同源性；(2)各對引物的最佳退火溫度盡量一致，相差最多不超過3 ℃；(3)目的條帶之間大小不要差距過大，彼此差距應(yīng)保持在100 bp之內(nèi)，這樣各目的條帶能有相近的擴(kuò)增效率，并且凝膠電泳易辨別區(qū)分。先用Primer 6.0設(shè)計(jì)搜索引物，然后MFEprimer 2.0分析評價(jià)引物。MFEprimer 2.0是基于多因素(序列相似性、引物3′端穩(wěn)定性、Tm值、自由能、PCR反應(yīng)離子濃度等)的引物特異性評估系統(tǒng)，而且可以通過基于引物與模板的相似性分析來預(yù)測非特異性PCR產(chǎn)物[21]。重新設(shè)計(jì)引物，將PVX擴(kuò)增片段大小由138 bp改為202 bp，在相同的擴(kuò)增條件下4種病毒條帶都很亮，利用模擬電泳圖預(yù)先觀察電泳檢測結(jié)果(圖2)。實(shí)際電泳結(jié)果與模擬電泳結(jié)果一致。

圖2 模擬與實(shí)際擴(kuò)增4種病毒特異性條帶Fig.2 Simulated and actual amplification of four kinds of virus-specific bands

2.5.3 輔助劑

使用一定濃度的輔助劑能夠改進(jìn)多重PCR反應(yīng)的特異性。在多重PCR反應(yīng)中，4%～10%的DMSO可改進(jìn)某些目的片段的擴(kuò)增效率，但同時(shí)也會減少其他目的片段的擴(kuò)增。在PCR反應(yīng)體系中加入1 μL PCR輔助劑DMSO[21-22]，結(jié)果顯示4條擴(kuò)增條帶均變亮，獲得較好的擴(kuò)增效果。

2.6 多重RT-PCR反應(yīng)條件優(yōu)化

反應(yīng)條件包括退火溫度、循環(huán)數(shù)等,劉正斌[13]和王鳳格[14]等人的研究表明在單一PCR擴(kuò)增已經(jīng)成功的條件下，遵循引物組合的一般原則，應(yīng)用與單一PCR完全相同的反應(yīng)條件進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，結(jié)果大部分組合都得到了正常的擴(kuò)增結(jié)果。所以只要選用與穩(wěn)定有效的單一PCR相同的反應(yīng)條件，并遵循引物組合的一般原則，就能夠直接應(yīng)用到多重PCR中去，而不需要進(jìn)行大量繁瑣的優(yōu)化程序。

在多重PCR反應(yīng)中，退火溫度是一個(gè)最重要的調(diào)整因素。在設(shè)計(jì)引物時(shí)就應(yīng)該考慮將各對引物退火溫度控制在一個(gè)相近的范圍內(nèi)，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)PVX退火溫度是55 ℃，PLRV退火溫度是57.5 ℃，PVY退火溫度是56.3 ℃，PVS退火溫度是57 ℃，各引物的退火溫度接近。Henegariu等[23]的研究表明，盡管單個(gè)目的片段能夠在56～60 ℃特異性地?cái)U(kuò)增，但是在多重PCR反應(yīng)中，降低2～4 ℃的退火溫度能夠更好地用于所有目的片段的擴(kuò)增。使用55 ℃作為多重PCR退火溫度，結(jié)果顯示所獲得的目的條帶較好。

循環(huán)內(nèi)延伸時(shí)間為1 min,最后的延伸時(shí)間為15 min擴(kuò)增效果較好，擴(kuò)增產(chǎn)物加尾整齊。循環(huán)次數(shù)30次就能有效獲得特異而清晰的目的條帶。因此，優(yōu)化后反應(yīng)條件最終選擇退火溫度55 ℃，循環(huán)內(nèi)延伸時(shí)間1 min，最后延伸15 min，30次循環(huán)。最終的優(yōu)化結(jié)果見圖3。

2.7 多重PCR檢測體系特異性檢測

選用田間感染馬鈴薯的常見病對建立的多重PCR檢測體系的特異性進(jìn)行驗(yàn)證，提取馬鈴薯環(huán)腐病、馬鈴薯晚疫病、馬鈴薯青枯病、馬鈴薯灰霉病的DNA，以馬鈴薯A病毒和馬鈴薯類病毒RNA作為模板。結(jié)果顯示建立的多重PCR檢測體系在選擇的幾種病害中均未擴(kuò)增出條帶，說明針對馬鈴薯4種病毒的多重PCR檢測體系的特異性較好。

圖3 優(yōu)化后的多重RT-PCRFig.3 Optimized multiplex RT-PCR

2.8 田間樣品檢測

采用優(yōu)化后的多重RT-PCR檢測技術(shù)對田間樣品進(jìn)行檢測，同時(shí)設(shè)置陽性和陰性對照。結(jié)果顯示，陽性對照完整擴(kuò)增出4條條帶，陰性對照脫毒馬鈴薯中未擴(kuò)增出任何條帶，樣品2和樣品6未擴(kuò)增出4種病毒特異性條帶，樣品3、4和5擴(kuò)增出PVS和PVY兩種病毒條帶，樣品7擴(kuò)增出PVY和PLRV兩種病毒條帶(圖4)，表明4份樣品存在復(fù)合病毒侵染。

圖4 多重RT-PCR檢測復(fù)合病毒侵染的馬鈴薯葉片樣品Fig.4 Multiplex RT-PCR detection of complex infection of potato viruses

3 結(jié)論與討論

目前應(yīng)用最廣的病毒檢測法是以病毒抗血清為基礎(chǔ)的酶聯(lián)免疫(ELISA)法。ELISA法比傳統(tǒng)的檢測方法靈敏度提高了許多，但存在假陽性或假陰性現(xiàn)象，也無法區(qū)分因外殼蛋白基因有一定同源性的病毒類型，并且無法檢測含量極少的韌皮部病毒及休眠種薯中的病毒。反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)具有靈敏、快速、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，多重RT-PCR繼承了單重PCR反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)，能同時(shí)在一個(gè)PCR反應(yīng)中擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段，節(jié)省了模板、時(shí)間和費(fèi)用，在檢測由復(fù)合病毒引起的病害時(shí)顯示出其優(yōu)勢。

建立多重RT-PCR體系要比單重RT-PCR復(fù)雜得多，其中至關(guān)重要的原因是引物的設(shè)計(jì)[24]。多重RT-PCR的引物設(shè)計(jì)建議如下：(1)根據(jù)基因的高度保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，引物相互之間及與其他基因之間均無同源性；(2)各對引物的最佳退火溫度盡量一致，相差最多不超過3 ℃；(3)目的條帶之間大小不要差距過大,應(yīng)保持在100 bp左右，這樣各目的條帶能有相近的擴(kuò)增效率，同時(shí)凝膠電泳結(jié)果應(yīng)易辨別區(qū)分；(4)用Primer 6.0設(shè)計(jì)搜索引物，MFEprimer 2.0分析評價(jià)引物并模擬電泳的結(jié)果；(5)選用與穩(wěn)定有效的單一PCR相同的反應(yīng)條件。這樣就能夠直接應(yīng)用到多重PCR中去，不需要進(jìn)行大量繁瑣的優(yōu)化程序。

對吳興泉等[25]提出的多重RT-PCR檢測馬鈴薯病毒中出現(xiàn)假陰性、假陽性、非特異性擴(kuò)增問題，本研究都做了針對性的優(yōu)化，在引物設(shè)計(jì)就已經(jīng)盡可能將已公布的基因序列全部用于保守區(qū)的分析，本試驗(yàn)用混合有4種病毒CP全長基因的質(zhì)粒作為陽性對照，電泳時(shí)能夠直觀地看到陽性檢測結(jié)果，而且避免了因?yàn)樵囼?yàn)操作不當(dāng)或者反應(yīng)試劑問題導(dǎo)致的假陰性。對PCR試驗(yàn)中所出現(xiàn)的假陽性DNA產(chǎn)物也能通過MFEprimer 2.0進(jìn)行分析模擬電泳結(jié)果。本試驗(yàn)建立的多重RT-PCR檢測體系能夠準(zhǔn)確、特異地檢測復(fù)合侵染馬鈴薯的4種病毒，簡化了病毒檢測的工作量，進(jìn)一步降低了成本，對于生產(chǎn)實(shí)踐有著重要的意義。

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Establishment of multiplex PCR for four potato viruses

Pang Bo，Liu Xiuli，Zhang Jinwen，Wang Di，Zhang Junlian

(Gansu Key Laboratory of Crop Improvement & Germplasm Enhancement, College of Agronomy,Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070, China)

Potato virus diseases are mainly caused by complex infection ofPotatovirusY (PVY)，PotatovirusX (PVX)，PotatovirusS (PVS), andPotatoleafrollvirus(PLRV). The primers for PVY, PVX, PVS and PLRV were designed based on the complete sequences of their coat protein (CP) genes and the sequence analysis of amplified fragments, which indicated that the four virus fragments shared at least 96 percent homology with other related viruses. The four pairs of specific primers based on the highly conserved sequences of the CP genes of the four viruses were designed. The target fragment sizes of 421 bp (PVY),202 bp (PVX), 516 bp (PVS) and 330 bp (PLRV) were amplified using multiplex RT-PCR. The optimized multiplex RT-PCR provides a quick and high efficiency method for simultaneous detection of the four viruses from field samples.

molecular detection； multiplex PCR； potato virus

2014-03-02

2014-05-07

國家自然科學(xué)基金(31260343)；甘肅省科技重大專項(xiàng)(1102NKDA025)

S 435.32

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.02.018

* 通信作者 E-mail： jwzhang305@163.com