李 河，周?chē)?guó)英，徐建平

(經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中南林業(yè)科技大學(xué)林學(xué)院，長(zhǎng)沙 410004)

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一種新油茶炭疽病原多基因序列鑒定

李 河，周?chē)?guó)英*，徐建平

(經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中南林業(yè)科技大學(xué)林學(xué)院，長(zhǎng)沙 410004)

從湖南、廣西油茶葉上分離獲得5株能侵染油茶樹(shù)的病原菌。通過(guò)柯赫氏法則證明該病原菌為油茶炭疽病的致病菌。病菌菌落圓形，初期為白色，逐漸變?yōu)闇\灰色；氣生菌絲由白色和灰白色漸變?yōu)樯罨疑q狀；菌落背面中心顏色深，外部顏色淺；菌絲劃傷后在PDA 培養(yǎng)基上能產(chǎn)生橘黃色的分生孢子堆，分生孢子為單胞、直、圓柱狀、無(wú)色、光滑、兩頭鈍圓或一端稍尖，分生孢子大小(11～15)μm×(4～5)μm；菌絲體附著胞不規(guī)則狀，淺褐色，(8～12)μm×(5.5～7)μm。采用形態(tài)學(xué)結(jié)合多基因(核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)、鈣調(diào)蛋白-CAL、3-磷酸甘油醛脫氫酶-GAPDH)系統(tǒng)學(xué)的方法對(duì)它們進(jìn)行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5個(gè)菌株均為暹羅刺盤(pán)孢(Colletotrichumsiamense)。這是國(guó)內(nèi)油茶上C.siamense的首次報(bào)道。

油茶；Colletotrichumsiamense; 炭疽病; 病原菌; 多基因序列

油茶(Camelliaoleifera)是原產(chǎn)于我國(guó)的食用木本油料樹(shù)種。茶油中不飽和脂肪酸含量高，可降低血脂、肝脂，防止血栓形成，對(duì)冠心病和動(dòng)脈粥樣硬化有良好的預(yù)防作用[1]。近幾年，隨著我國(guó)大力發(fā)展油茶產(chǎn)業(yè)，各油茶產(chǎn)區(qū)的炭疽病發(fā)生越來(lái)越嚴(yán)重，造成重大經(jīng)濟(jì)損失[2]。目前，國(guó)內(nèi)學(xué)者認(rèn)為油茶炭疽病是由膠孢炭疽菌(ColletotrichumgloeosporioidesPenz.)引起[3-7]。本研究通過(guò)病原菌分離、致病性測(cè)定，并結(jié)合形態(tài)特征和多基因分子鑒定，發(fā)現(xiàn)炭疽屬的暹羅刺盤(pán)孢(ColletotrichumsiamensePrihastuti,L.Cai & K.D.Hyde)也能引起油茶炭疽病。這是首次在油茶上發(fā)現(xiàn)這種病原菌，研究結(jié)果可對(duì)該病害的防治及抗病育種工作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離與培養(yǎng)

油茶病葉采自湖南省和廣西壯族自治區(qū)。采用常規(guī)分離法，從病葉病健交界處組織進(jìn)行分離，純培養(yǎng)物斜面培養(yǎng)后4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 病原菌形態(tài)學(xué)觀(guān)察

觀(guān)察菌落特征，光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察菌絲及分生孢子形態(tài)特征，并測(cè)量其大小。

1.3 回接試驗(yàn)

采用國(guó)家審定品種‘長(zhǎng)林55號(hào)’油茶活體植株葉，用75%乙醇表面消毒處理，細(xì)針蘸取分離菌株的孢子懸浮液后刺扎油茶葉，以滅菌水處理為對(duì)照(CK)，離體條件下觀(guān)察病害發(fā)生發(fā)展情況，并對(duì)接種后發(fā)病葉進(jìn)行病菌再分離。

1.4 病菌多基因的PCR 擴(kuò)增與序列分析

1.4.1 病原菌DNA 的提取

病原菌DNA 的提取參考夏花等[8]的試驗(yàn)方法。將分離菌株接種到PDA平板上進(jìn)行活化，于28 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)6 d后，用滅菌的藥匙將菌絲刮下，稱(chēng)取0.5 g于研缽中，加入1 mL 裂解液，3/10 體積石英砂，研磨充分后轉(zhuǎn)入1.5 mL EP管中，65 ℃水浴10 min，然后加入600 μL 7.5 mol/L NaCl溶液，冰浴 8 min后13 000 r/min 離心5 min; 取600 μL上清液到一個(gè)新的EP管中，加400 μL 氯仿：異戊醇(24∶1)，混勻; 靜置分層后取500 μL 上清液至另一新EP管，加入0.1倍體積NaAc和2倍體積的無(wú)水乙醇，14 000 g離心8 min 后收集DNA，用70%乙醇洗DNA 2 次; 待乙醇揮發(fā)后，用0.1×TE溶解DNA，-20 ℃保存。

1.4.2 基因選擇及目的片段擴(kuò)增與測(cè)序

參照陳國(guó)慶[9]、楊友聯(lián)[10]的研究結(jié)果，對(duì)所有分離篩選獲得的菌株，選擇核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(GAPDH)和鈣調(diào)蛋白基因(CAL)進(jìn)行擴(kuò)增與測(cè)序。相應(yīng)的PCR擴(kuò)增引物見(jiàn)表1。反應(yīng)體系及條件參見(jiàn)陳國(guó)慶[9]。PCR 產(chǎn)物委托上海鉑尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

表1 試驗(yàn)所用引物和退火溫度

1.4.3 菌株ITS基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

將本試驗(yàn)分離的5個(gè)菌株ITS 序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中炭疽菌ITS序列進(jìn)行比對(duì)，采用MEGA軟件鄰近法(neighbor-joining N-J)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，以自展法(bootstrap)進(jìn)行檢測(cè)，1 000 次循環(huán)。

1.4.4 菌株多基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

將測(cè)序獲得的每個(gè)菌株的3個(gè)基因，經(jīng)過(guò)Clustal W軟件比對(duì)且手工校正后的各個(gè)基因按照ITS-CAL-GAPDH的順序分別首尾相連，并下載GenBank中同時(shí)含有ITS、CAL和GAPDH 3個(gè)基因序列的炭疽屬菌株及模式菌株序列，也按照ITS-CAL-GAPDH的順序首尾相連后進(jìn)行同源性分析，用軟件MEGA 4.0構(gòu)建所有菌株3個(gè)基因組合的N-J系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離及致病性測(cè)定

從湖南、廣西兩省油茶產(chǎn)區(qū)分離、純化獲得形態(tài)特征疑似炭疽病的病原菌5株，回接試驗(yàn)表明，這5株真菌能引起一致的癥狀(圖1)：病葉初期呈褐色斑點(diǎn)，然后逐漸變成黑褐色病斑。對(duì)回接后發(fā)病的病斑組織再次進(jìn)行病原菌分離，獲得與原接種菌株形態(tài)特征一致的菌落和分生孢子；無(wú)菌水(CK)處理未發(fā)現(xiàn)病斑，也未分離到病菌。由此可確定，這5株菌是引起油茶炭疽病的病原菌，它們的地理分布見(jiàn)表2。

圖1 油茶樹(shù)葉片炭疽病病斑

樣品采集地及數(shù)量Sitesandsamplesize菌株編號(hào)Strainno．GenBank登錄號(hào)GenBankaccessionno．ITSCALGAPDHHNTJL8KJ131601KJ132198KJ131800湖南3株HNTJL10KJ131602KJ132199KJ131801HNTJL20KJ131603KJ132200KJ131802廣西2株GXNN3KJ131595KJ132192KJ131794GXNN5KJ131596KJ132193KJ131795

2.2 病菌形態(tài)特征

病菌形態(tài)特征見(jiàn)圖2(只顯示GXNN3菌株，其他菌株形態(tài)特征相同)。5個(gè)菌株在PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)10 d后，菌絲呈等徑輻射生長(zhǎng)，呈地毯狀平鋪，菌落圓形，初期為白色，逐漸變?yōu)闇\灰色；氣生菌絲由白色和灰白色，漸變?yōu)樯罨疑q狀；菌落背面中心顏色深，外部顏色淺；菌絲劃傷后在PDA 培養(yǎng)基上能產(chǎn)生橘黃色的分生孢子堆，分生孢子為單胞，直、圓柱狀、無(wú)色、光滑、兩端鈍圓或一端鈍圓，另一端稍尖，分生孢子大?。?11～15)μm×(4～5)μm(n=50)；菌絲體附著胞淺褐色至深褐色，邊緣不規(guī)則，有時(shí)形成多級(jí)次生附著胞，呈鏈狀，(8～12)μm×(5.5～7)μm(n=30)。在PDA平板培養(yǎng)過(guò)程中未觀(guān)察到有性態(tài)。

圖2 炭疽菌菌株的形態(tài)特征Fig.2 Morphology of the pathogen causing the anthracnose

2.3 菌株rDNA-ITS基因系統(tǒng)發(fā)育分析

5個(gè)菌株的18S rDNA-ITS基因系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果(圖3)顯示，5個(gè)菌株聚為Ⅰ和Ⅱ 2個(gè)分支，分支Ⅰ包括分離自廣西南寧2個(gè)菌株GXNN3、GXNN5和C.tropicale、C.queenslandicum、C.clidemiae、C.ti等4個(gè)種，分支Ⅱ包括湖南分離的3個(gè)菌株(HNTJL8、HNTJL10、HNTJL20)和C.siamense的1個(gè)分離物，另外我們還發(fā)現(xiàn)C.siamense的另外2個(gè)分離物與炭疽屬其他種聚在分支Ⅲ，且系統(tǒng)樹(shù)各分支處大部分自展值都非常低，由此可以看出，ITS基因無(wú)法準(zhǔn)確區(qū)分炭疽屬所有種。

2.4 菌株多基因系統(tǒng)發(fā)育分析

5個(gè)菌株的編號(hào)及每個(gè)基因的GenBank 登錄號(hào)見(jiàn)表2，5個(gè)菌株的ITS-CAL-GAPDH序列與GenBank下載的菌株序列的聚類(lèi)分析結(jié)果(圖4)顯示，5個(gè)分離菌株與所有參與分析的4株C.siamense聚為一支(其中ICMP 18642、ICMP19118為模式菌株)，自展支持率為87%，能夠與炭疽屬其他種區(qū)分開(kāi)，再結(jié)合各菌株的形態(tài)學(xué)特征可以確定所分離到的病原菌為C.siamense。這說(shuō)明，ITS、CAL和GAPDH 3個(gè)基因序列拼接起來(lái)后構(gòu)建的N-J系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)能準(zhǔn)確區(qū)分和鑒定炭疽菌的近緣種。

圖3 依據(jù)ITS序列用N-J方法構(gòu)建的Colletotrichum spp.系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 The N-J phylogenetic tree based on the rDNA-ITS sequences of Colletotrichum spp.

圖4 依據(jù)ITS-CAL-GAPDH 3基因合并序列用N-J法構(gòu)建Colletotrichum spp.系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 The N-J phylogenetic tree based on the ITS-CAL-GAPDH sequences of Colletotrichum spp.

3 討論

炭疽菌中許多種的分生孢子、附著胞都較相似，對(duì)于非專(zhuān)業(yè)分類(lèi)研究者來(lái)說(shuō)，單從分生孢子和附著胞等形態(tài)學(xué)特征，較難進(jìn)行炭疽菌種的鑒定。此外，一些學(xué)者認(rèn)為，僅根據(jù)形態(tài)學(xué)特征來(lái)進(jìn)行炭疽菌種的鑒定與分類(lèi)通常是不適當(dāng)?shù)腫15-16]。隨著分子生物學(xué)手段的運(yùn)用，基于分子標(biāo)記的系統(tǒng)學(xué)方法被引入該屬真菌的分類(lèi)[10-11]。ITS 序列在炭疽菌屬系統(tǒng)學(xué)中的運(yùn)用，為部分物種的鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化分析提供了有力的工具。例如,C.boninense基于形態(tài)特征，最初被鑒定為C.gloeosporioides, 隨后, 利用ITS 序列進(jìn)行系統(tǒng)分析，獨(dú)立為新的分類(lèi)單元[17]。但由于ITS 在該屬系統(tǒng)學(xué)研究中的局限性，如對(duì)多數(shù)近緣種，構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)在一些關(guān)鍵進(jìn)化節(jié)點(diǎn)的支持率較低，不能有效進(jìn)行識(shí)別[18]。Avise和Wollenberg 曾指出利用ITS序列不能有效地用于種的識(shí)別，可能會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)論[19]。本研究中，我們分離的5株病菌的ITS序列與GenBank中的Colletotrichum屬其他種的ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，這5株菌株與該屬其他5個(gè)種聚為2支，且各分支處大部分自展值都非常低，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)無(wú)法區(qū)分它們，表明基于ITS 序列不能進(jìn)行該屬的所有物種識(shí)別。

Taylor 等[21]主張基于多基因譜系識(shí)別生物學(xué)種，并提出了系統(tǒng)學(xué)種(phylogenetic species)的概念，以區(qū)別于過(guò)去的形態(tài)學(xué)種和生物學(xué)種。伴隨著多基因分析方法的引入，提高了炭疽菌屬真菌鑒定的準(zhǔn)確率[9-14, 22-23]。Crouch 等[24]運(yùn)用ITS、Apn2、Mat1/ Apn1 和Sod2 基因進(jìn)行聯(lián)合分析，把形態(tài)上極難區(qū)分識(shí)別的復(fù)合種C.graminicola區(qū)分開(kāi)來(lái)，恢復(fù)C.cereale和C.eleusines為合格種，并引入了6個(gè)新種，同時(shí)該研究發(fā)現(xiàn)，其聚類(lèi)與寄主有關(guān)，分別對(duì)應(yīng)C3 和C4 植物。Weir 等采用形態(tài)學(xué)和多基因譜系方法將膠孢炭疽菌復(fù)合種分成了22 個(gè)種和1 個(gè)亞種[11]。

本研究的病原菌株C.siamense是從我國(guó)2個(gè)不同省份油茶樹(shù)上分離獲得的，它們的形態(tài)特征與楊友聯(lián)[10]、Weir[11]、韓永超[12]和Prihastuti[13]描述的C.siamense的形態(tài)特征吻合。多基因序列構(gòu)建N-J系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，5個(gè)分離菌株與所有C.siamense聚為一支(其中ICMP 18642、ICMP19118為C.siamense模式菌株)，其他分支中，相同種菌株也都以非常高的支持率聚在一起。這表明，ITS、CAL和GAPDH三個(gè)基因聯(lián)合起來(lái)能準(zhǔn)確區(qū)分和鑒定炭疽菌的近緣種。據(jù)報(bào)道C.siamense首次在泰國(guó)咖啡上被發(fā)現(xiàn)，并且可以寄生多種熱帶和亞熱帶植物[13]。在我國(guó)的云南省也發(fā)現(xiàn)該菌，其寄主包括草莓和竹葉蘭等[10,12]。我們首次發(fā)現(xiàn)C.siamense能侵染油茶樹(shù)。從供試樣本來(lái)看，C.siamense采自湖南和廣西兩省(自治區(qū))，其地理分布較廣，說(shuō)明該病菌對(duì)環(huán)境變化的潛在適應(yīng)能力強(qiáng)，容易擴(kuò)展其分布范圍。目前，對(duì)C.siamense的研究?jī)H限于種名的鑒定，而其生物學(xué)、生態(tài)學(xué)、流行病學(xué)、種群遺傳結(jié)構(gòu)和有效的防治措施未見(jiàn)報(bào)道，應(yīng)該進(jìn)一步對(duì)該菌深入研究，這對(duì)控制該病菌引起的油茶炭疽病具有重要意義。

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Pathogen identification of a new anthracnose of Camellia oleifera in China based on multiple-gene sequences

Li He, Zhou Guoying, Xu Jianping

(The Key Laboratory for Non-wood Forest Cultivation and Conservation of Ministry of Education, College of Forestry, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, China)

Five strains of anthracnose pathogen ofCamelliaoleiferawere isolated from two provinces of China. The pathogenicity tests were performed using conidial suspension ofColletotrichumsp. on young and healthy leaves ofC.oleifera, and theColletotrichumsp. isolates were confirmed as the pathogenic fungi. Isolations were transferred onto PDA plates and showed circular colonies. These morphological characteristics of colonies were first white and then turned grey and grey black. The pile of spores was jacinth. Conidia were oblong, single-celled, colorless, (11-15)μm×(4-5)μm in size. Mycelial appressorium was clava-like, brown, smooth-edged and intact, (8-12)μm×(5.5-7)μm in size. We identified these isolates based on morphological characters and phylogenetic analysis of multilocus (ITS, CAL, GAPDH) sequences. The results showed that the pathogen causing anthracnose ofC.oleiferawasC.siamense. This is the first report ofC.siamenseonC.oleiferain China.

Camelliaoleifera;Colletotrichumsiamense; anthracnose; pathogen; multiple-gene sequences

2014-03-21

2014-06-17

國(guó)家自然科學(xué)基金(31100479)

S 435.659

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.02.016

* 通信作者 E-mail：zhouguoying77@163.com