徐希寶, 張 靖, 芮昌輝

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，農(nóng)業(yè)部作物有害生物綜合治理重點實驗室，北京 100193)

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沉默GSTs基因影響棉鈴蟲對甲氧蟲酰肼的敏感性

徐希寶, 張 靖, 芮昌輝*

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，農(nóng)業(yè)部作物有害生物綜合治理重點實驗室，北京 100193)

利用RNAi技術(shù)對GSTs基因進行沉默處理，明確了沉默棉鈴蟲GSTs基因可以影響其對甲氧蟲酰肼的敏感性。結(jié)果表明，通過飼喂siRNA在1 d內(nèi)就可以有效干擾GSTs基因表達(dá)，進而降低了GSTs酶活性；停止飼喂siRNA后，RNA干擾效果并不會立刻消失；沉默GSTs基因后，棉鈴蟲對甲氧蟲酰肼的敏感性顯著提高。

甲氧蟲酰肼； 棉鈴蟲； 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶； RNA干擾； 實時定量PCR

RNA干擾(RNA interference，簡稱RNAi)是指由雙鏈RNA(double strand RNA，dsRNA或small interfering RNA，siRNA)引發(fā)生物體同源序列mRNA降解而最終導(dǎo)致特異性基因轉(zhuǎn)錄后沉默的效應(yīng)[1]。近年來，RNAi通過干擾靶標(biāo)基因表達(dá)，在昆蟲功能基因、害蟲抗藥性機制研究和害蟲防治方面取得了一定成果[2]。

甲氧蟲酰肼(methoxyfenozide)是由羅姆-哈斯公司(Rohm-Hass)研究開發(fā)的一種雙酰肼類昆蟲生長調(diào)節(jié)劑類殺蟲劑，對鱗翅目害蟲均具有高度的選擇殺蟲活性[3]。甲氧蟲酰肼與蛻皮激素(20-羥基蛻皮酮)類似，不同點在于，甲氧蟲酰肼一旦與蛻皮激素受體結(jié)合就很難分離，而持續(xù)誘導(dǎo)蛻皮反應(yīng)，并且昆蟲無法合成新表皮，最終死亡[4-5]。有關(guān)棉鈴蟲對甲氧蟲酰肼的抗藥性機理研究，劉娟等[6]與任龍等[7]的研究表明棉鈴蟲對甲氧蟲酰肼的抗性形成與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)活性提高關(guān)系密切。

研究發(fā)現(xiàn), 與GSTs相關(guān)聯(lián)的多種昆蟲對殺蟲劑抗性的分子機制是GSTs基因表達(dá)量的增加。在埃及伊蚊DDT抗性品系中，存在兩種免疫學(xué)不同的GSTs基因GST-1a和AaGSTD1過量表達(dá)[8]。在岡比亞按蚊DDT抗性品系中AgGSTE2-2基因在mRNA和蛋白水平上都過量表達(dá)[9]。果蠅的DDT抗性種群中DmGSTD1蛋白過量表達(dá)，并且能夠代謝DDT[10]。在褐飛虱擬除蟲菊酯抗性品系中一個Delta類GST基因NlGSTD1的重組蛋白表現(xiàn)出高的過氧化物酶活性，并且抗性品系中NlGSTD1通過基因擴增實現(xiàn)過量表達(dá)[11]。小菜蛾對甲基對硫磷的抗性與一個GST基因(PxGST3)的過表達(dá)有關(guān)[12]。

本試驗選取鱗翅目昆蟲棉鈴蟲為試驗材料，在本實驗室保存的棉鈴蟲對甲氧蟲酰肼抗性種群和同源對照種群，以及抗性機理研究表明其抗藥性與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)活性提高有關(guān)的基礎(chǔ)上[6-7]，設(shè)計了棉鈴蟲GSTs基因的siRNA，通過飼喂的方式誘導(dǎo)靶標(biāo)基因的沉默，研究GSTs基因表達(dá)被干擾后，棉鈴蟲對甲氧蟲酰肼敏感性的變化。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 主要藥劑和試劑

98.2%甲氧蟲酰肼(methoxyfenozide)原藥，美國陶氏益農(nóng)公司；乙二胺四乙酸鈉(EDTA)，北京化工廠；考馬斯亮藍(lán)G-250，上?；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)站; 1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB),中國醫(yī)藥公司北京分公司；還原型谷胱甘肽(GSH),東風(fēng)生化技術(shù)公司；RNeasy Mini Kit 試劑盒購自Qiagen公司；PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)購自 TaKaRa(大連)公司； SsoFastTMEvaGreenSupermix試劑盒購自伯樂公司。其他試劑為國內(nèi)分析純。

1.1.2 主要儀器

核酸濃度測定儀 NanoDrop 2000(Thermo Scientific)；熒光定量PCR儀：Bio-Rad IQ 2，iQ5 optical system software。

1.1.3 供試蟲源

以本實驗室保存的對甲氧蟲酰肼有一定抗性的棉鈴蟲[6](試驗時抗性為12.7倍)為試驗對象，參照范賢林等[13]的方法飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件：溫度(26±1)℃、相對濕度60%～80%、光周期L∥D=16 h∥8 h，光照強度為2 000～3 000 lx。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成

使用RNeasy Mini Kit 試劑盒提取總RNA，具體操作見試劑盒說明書，提取的總RNA保存于-80 ℃冰箱中。使用核酸濃度測定儀 NanoDrop 2000測定總RNA濃度。以反轉(zhuǎn)錄酶PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)合成cDNA第一鏈。

1.2.2 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)中已發(fā)表的棉鈴蟲谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因(GSTd1)的cDNA序列(登錄號：GQ149104.1)，用Primer 5.0設(shè)計上下游特異性引物(Fd1、Rd1)。所有基因的引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。選擇18S rRNA作為定量分析的內(nèi)參基因，根據(jù)GenBank中已發(fā)表的棉鈴蟲18S rRNA序列(登錄號：GenBank: AB620126.1)設(shè)計上下游特異性引物(F18S、R18S)。siRNA引物(Si-S1，Si-A1)由廣州市銳博生物科技有限公司設(shè)計合成，經(jīng)甲基化修飾。相關(guān)引物信息見表1。

表1 基因特異性引物

1.2.3 GST定量擴增及數(shù)據(jù)處理

定量PCR反應(yīng)液參照SsoFastTMEvaGreenSupermix試劑盒說明書配制，其中所有GST基因和內(nèi)參基因18S rRNA基因的引物終濃度均為450 nmol/L；cDNA模板量為對應(yīng)5 ng總RNA的量。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性(酶激活)30 s；95 ℃變性5 s，53 ℃退火延伸10 s, 40個循環(huán)；溶解過程溫度65～95 ℃，61個循環(huán)。

數(shù)據(jù)處理：每處理均為3個重復(fù)，不同處理得到的數(shù)據(jù)經(jīng)內(nèi)參基因均一化處理，以處理前的對照樣品(0 d樣品)為標(biāo)準(zhǔn)，參照文獻[14], 用2-ΔΔCt方法計算相對表達(dá)量。

F目的基因相對表達(dá)量=2-ΔΔCt=

2-[(Ct目的基因-Ct管家基因)試驗組-(Ct目的基因-Ct管家基因)對照組]

2-ΔΔCt表示試驗組目的基因表達(dá)量相對于對照組的變化倍數(shù)。Ct表示在qPCR過程中，各樣品擴增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)數(shù)，取3次加樣重復(fù)相差不超過0.5的Ct值的平均值。

1.2.4 siRNA引物穩(wěn)定性檢測

用配制飼料同源的涼開水稀釋siRNA至4 μmol/L，分裝于5個PCR管中，每管15 μL，然后置于上述棉鈴蟲飼養(yǎng)環(huán)境中，每隔2 d取1管置于-80 ℃冰箱中，5份樣品暴露于上述環(huán)境中的時間分別是0 (CK)、1、3、5 和7 d，取樣結(jié)束后電泳檢測。

1.2.5 siRNA濃度的選擇

將濃度為0.032、0.16、0.8、4 μmol/L的siRNA試劑50 μL與10 g人工飼料充分混合，放入飼養(yǎng)盒中，接入2齡1 d幼蟲，用保鮮膜封口，然后置于上述棉鈴蟲飼養(yǎng)環(huán)境中，飼喂24 h后，置于-80 ℃冰箱中保存。

1.2.6 RNAi作用時間

試蟲RNAi處理方法為：將2齡1 d幼蟲飼喂含siRNA的飼料(10 g中含50 μL 4 μmol/L的siRNA，下述含siRNA飼料未注明濃度時均默認(rèn)為該濃度)1 d后(1 d)，取出幼蟲，再接入不含有siRNA的飼料中飼養(yǎng)，每隔1 d取樣，取3次(2、3、4 d)，置于-80 ℃冰箱中保存,以備測定GSTs基因表達(dá)量。(括號中為結(jié)果中對應(yīng)的時間點)

對照組處理方法：除了飼料都不含siRNA外，其余步驟相同。

1.2.7 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)酶液制備及活性測定

試蟲處理方法與1.2.6相同，分別取2齡1、2和3 d幼蟲測定酶活性。

酶液制備及活性測定：取試蟲4頭，放入玻璃勻漿器中，加入pH 7.8，0.1 moL/L 磷酸緩沖液(含1 mmol/L EDTA)1 mL冰浴勻漿，勻漿液在4 ℃下，10 000 r/min離心20 min，取上清液作為谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶酶液，重復(fù)3次，保存于-20 ℃冰箱備用。酶活力單位測定方法參照Booth等[15]方法略有改變，采用酶標(biāo)儀測定。反應(yīng)體系為72 μL 0.1 mol/L 磷酸緩沖液，80 μL 6 mmol/L GSH，80 μL 1.2 mmol/L CDNB，8 μL 酶液。27 ℃酶促反應(yīng)條件下，測定340 nm波長下每分鐘吸光值變化量，計算酶活力單位。酶液蛋白含量測定方法參照Bradfold[16]的考馬斯亮藍(lán)(G-250)法，反應(yīng)體系為40 μL酶液，200 μL考馬斯亮藍(lán)G250顯色液，對照以蒸餾水替代酶液。在595 nm波長下測定光吸收值，再根據(jù)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算酶液蛋白質(zhì)含量。各處理均重復(fù)測定4次。GSTs比活力(μmol/(mg·min))=酶活力單位/酶液蛋白含量。

1.2.8 毒力測定

RNAi處理組：將2齡1 d幼蟲飼喂含siRNA的飼料1 d后，再進行毒力測定。

對照組：飼喂無siRNA的飼料，毒力測定時蟲齡和大小與RNAi處理組試蟲一致。

毒力測定方法參照殺蟲劑抗性委員會(IRAC)推薦的葉片藥膜法[17]，略有改進，分別測定甲氧蟲酰肼對抗性種群的毒力指數(shù)。以0.05%曲拉通水溶液為溶劑配制5個濃度甲氧蟲酰肼藥液。以0.05%曲拉通水溶液作為對照。將新鮮棉花葉片洗凈晾干，在藥液中浸漬10 s，室溫晾干后放入10孔盒，接入試驗幼蟲。每個處理3次重復(fù)，每個重復(fù)10頭幼蟲。72 h后檢查死亡率，蟲體變小嚴(yán)重發(fā)黑、針刺沒有反應(yīng)或不能協(xié)調(diào)運動的試蟲為死亡。數(shù)據(jù)用DPS軟件處理，得到LC50等。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光定量PCR擴增效率

將反轉(zhuǎn)錄得到的試驗棉鈴蟲cDNA按10倍梯度稀釋，進行實時熒光定量PCR反應(yīng)，各目的基因和內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線和擴增效率見表 2。擴增效率全部介于90%～110%之間，目的基因與內(nèi)參基因擴增效率較為接近，符合要求。

表2 定量PCR擴增的標(biāo)準(zhǔn)曲線和擴增效率

2.2 siRNA的穩(wěn)定性

從圖1可以看出，5條帶亮度沒有明顯變化，說明siRNA沒有發(fā)生明顯的降解，穩(wěn)定性比較好，可以滿足后續(xù)試驗要求。

2.3 siRNA濃度的選擇

從圖2可以看出，濃度為0.032、0.16和0.8 μmol/L時，GSTs基因沒有顯著降低，而濃度為4 μmol/L時，GSTs基因表達(dá)量顯著降低，說明該濃度干擾效果最好。

圖1 siRNA電泳圖Fig.1 The electrophoretogram of siRNAs

圖2 不同siRNA濃度對GSTs基因表達(dá)量的影響Fig.2 Effects of the siRNA concentration on the expression of GSTs genes

2.4 RNAi的作用時間

從圖3可以看出，棉鈴蟲幼蟲在用siRNA處理1 d后，GSTs基因表達(dá)量非常顯著的降低，僅為CK幼蟲的32.8%，再接入無siRNA的飼料，1 d后，表達(dá)量繼續(xù)降低到17.8%，之后2 d，表達(dá)量繼續(xù)維持在較低的水平。而對照試蟲表達(dá)量有一定的上升，RNAi處理后GSTs基因表達(dá)量經(jīng)校正后將更低，說明該siRNA干擾效果較好。

2.5 對GSTs酶比活力的影響

從表3可以看出，在2 d內(nèi)，對照組GSTs酶活力沒有顯著變化；RNAi處理組在處理1 d后，GSTs酶活降低，之后不再繼續(xù)降低。2 d內(nèi)，RNAi處理試蟲的GSTs酶活均低于對照組。說明RNAi影響了GSTs的酶活力。

圖3 RNAi處理后對GSTs基因表達(dá)量的影響Fig.3 Effects of RNAi on the expression of GSTs genes

種群?處理Population?treatment比活力/μmol·(min·mg)-1Specificactivity0d1d2dCK(1．7403±0．0779)a(1．8496±0．0770)aA(1．9761±0．1251)aARNAi(1．7403±0．0779)a(1．4792±0．0484)bB(1．5318±0．0570)bB

1)同行數(shù)據(jù)后不同的小寫字母表示差異顯著；同列數(shù)據(jù)后不同的大寫字母表示差異顯著(Tukey-檢驗，P<0.05)。

Different lowercase letters in the same row denote significant difference (Tukey-test,P<0.05). Different capital letters in the same column denote highly significant difference (Tukey-test,P<0.05).

2.6 棉鈴蟲對甲氧蟲酰肼的敏感性變化

從表4可以看出，經(jīng)RNAi處理后的試蟲較對照試蟲LC50降低了近40%，說明其對甲氧蟲酰肼更加敏感。

表4 棉鈴蟲2齡幼蟲對甲氧蟲酰肼的敏感性

3 討論

要達(dá)到理想的RNAi效果需要的siRNA(或dsRNA)用量并沒有一定的標(biāo)準(zhǔn)，除了與siRNA(或dsRNA)設(shè)計合成的優(yōu)劣有關(guān)外，還與昆蟲種類、攝入方式、試驗齡期、基因結(jié)構(gòu)以及基因所在的組織器官等有關(guān)[18]，因此在研究中要首先確定合適的siRNA用量。本試驗設(shè)計了4個5倍的濃度梯度，確定濃度為4 μmol/L時可以達(dá)到明顯的干擾效果。

昆蟲RNAi的攝入方式多種多樣，如顯微注射(micro-injection)、飼喂(feeding)、浸泡(soaking)、轉(zhuǎn)基因(transgene)和病毒感染(virus infection)等方法。由于飼喂是自然的攝入方式，對昆蟲造成的非目的傷害微小，不影響其他基因的表達(dá)，越來越受到研究者的重視[19]。繼Turner等[20]首次證明RNAi技術(shù)不僅能通過注射也可通過飼喂來實現(xiàn)后，目前該方法已成功應(yīng)用于鱗翅目害蟲棉鈴蟲[21]、蘋淺褐卷蛾(Epiphyaspostvittana)[20]和小菜蛾(Plutellaxylostella)[22]等的RNAi技術(shù)研究。另一方面，GSTs基因在中腸和脂肪體中高水平表達(dá)[23]，所以本研究采用飼喂法具有較大優(yōu)勢，siRNA可以快速到達(dá)作用位點沉默GSTs基因。考慮到昆蟲消化系統(tǒng)解毒代謝能力較強[24]，我們對siRNA進行了甲基化修飾，增強其穩(wěn)定性。本研究將siRNA與人工飼料混合，飼喂2齡初棉鈴蟲幼蟲，飼喂1 d后，GSTs基因表達(dá)量就下降了67%，實現(xiàn)了快速高效地沉默GSTs基因的目的。

微量的siRNA(或dsRNA)在昆蟲體內(nèi)解毒代謝系統(tǒng)的降解和細(xì)胞擴增的稀釋等作用下，依然可以保持?jǐn)?shù)天的RNA干擾作用[22, 25-26]，可能與siRNA的不斷擴增有關(guān)。siRNA可作為一種特殊引物，在RNA依賴RNA聚合酶(RdRp)作用下以靶基因mRNA為模板合成dsRNA，后者可被RNase III(如Dicer)降解形成新的siRNA；新生成的siRNA又可進入上述循環(huán)，如此反復(fù)[27]。

研究發(fā)現(xiàn)，沉默害蟲抗藥性相關(guān)解毒酶基因表達(dá)可以提高其對該殺蟲劑的敏感性。Bautista等研究發(fā)現(xiàn)，小菜蛾幼蟲取食CYP6BG1基因dsRNA 1 d后,CYP6BG1基因表達(dá)量下降了97.7%和98.5%(測定了2次)，微粒體總P450的苯氧基試鹵靈O-脫芐基活性和對硝基苯甲醚O-脫甲基活性均顯著下降，對氯菊酯的敏感性顯著提高，證明小菜蛾對氯菊酯形成抗性與CYP6BG1過量表達(dá)有關(guān)[22]。Mao等研究也發(fā)現(xiàn)沉默CYP6AE14基因表達(dá)量可以提高棉鈴蟲幼蟲對棉酚的敏感性[21]。正常飼養(yǎng)的棉鈴蟲從卵期開始，GSTs活性呈上升趨勢，至6齡最高[28]，本研究對照組棉鈴蟲基因表達(dá)量在4 d內(nèi)有一定的增加，而RNAi處理組顯著降低，并且在轉(zhuǎn)入無siRNA的人工飼料后，3 d內(nèi)依然維持了低水平的表達(dá)量，說明我們成功地沉默了GSTs基因，同時干擾GSTs基因的表達(dá)引起了GSTs酶活性的降低。毒力試驗證明，沉默棉鈴蟲GSTs基因可以提高其對甲氧蟲酰肼的敏感性。

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Effects of silencing GSTs genes on the susceptibility of Helicoverpaarmigerato methoxyfenozide

Xu Xibao, Zhang Jing, Rui Changhui

(Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Integrated Pest Management in Crops, Ministry of Agriculture, Beijing 100193, China)

GSTs genes inHelicoverpaarmigerawere silenced by RNAi technique and the effects of silencing GSTs genes on the susceptibility ofH.armigerato methoxyfenozide were investigated. The results showed that the expression level of GSTs genes markedly reduced from the first day by feeding siRNA, and then the specific activities of GSTs reduced. The effect of silencing would not disappear immediately after stopping feeding siRNA. The susceptibility ofH.armigerato methoxyfenozide increased after GSTs genes being silenced.

methoxyfenozide;Helicoverpaarmigera; glutathioneS-transferase; RNAi; qRT-PCR

2014-03-06

2014-05-19

國家“863”計劃主題項目(2012AA1015027)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201203038)

Q 965.9

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.02.008

* 通信作者 E-mail: chrui@ippcaas.cn