張 歡，劉洪娟，高艷玲，董天宇，趙奎軍，樊 東

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030)

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苜蓿夜蛾hsp90基因cDNA序列的克隆與表達(dá)研究

張 歡，劉洪娟，高艷玲，董天宇，趙奎軍，樊 東*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030)

熱休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)是生物體適應(yīng)外界不良環(huán)境條件的關(guān)鍵蛋白。熱休克蛋白90(HSP90)是HSP家族的重要成員。本試驗(yàn)以苜蓿夜蛾為材料提取蟲體總RNA，利用RT-PCR和RACE技術(shù)，擴(kuò)增得到hsp90基因全長cDNA序列，命名為Hvhsp90(GenBank登錄號(hào)KF636495)。該序列含有2 472個(gè)堿基，包括一個(gè)2 154個(gè)堿基的開放閱讀框，編碼一個(gè)含717個(gè)氨基酸的蛋白，分子量約為82.5 ku，等電點(diǎn)為4.97，且含有5個(gè)標(biāo)簽序列及胞質(zhì)特征序列MEEVD，推導(dǎo)的氨基酸序列與鱗翅目其他昆蟲HSP90相似性85%～99%之間。RT-PCR結(jié)果表明，該基因在苜蓿夜蛾不同發(fā)育時(shí)期和不同組織均有mRNA水平的特異性表達(dá)。該基因在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá), 經(jīng)SDS-PAGE和Western blot檢測結(jié)果表明, HvHSP90能夠高效表達(dá)，并與預(yù)測的融合蛋白分子量相符。

苜蓿夜蛾； 熱休克蛋白90； 克??； 表達(dá)

熱休克蛋白(heat shock proteins，HSP)又稱熱激蛋白(heat stress proteins)，是生物體在應(yīng)激情況下細(xì)胞內(nèi)迅速合成的一類蛋白質(zhì)，其誘導(dǎo)表達(dá)是昆蟲機(jī)體抵抗不良外界環(huán)境的重要形式之一，而且昆蟲體內(nèi)熱休克蛋白的表達(dá)量越高，其抗逆性就越強(qiáng)。除了在高溫及其他不良環(huán)境因子脅迫下，多種應(yīng)激源如重金屬、饑餓、缺氧和缺血等都可以誘導(dǎo)HSP的表達(dá)。HSP編碼序列變異比較低，在生物體內(nèi)普遍存在、具有高度保守性[1]。Ritossa于1962年在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，將黑腹果蠅(DrosophilamelanogasterLinnaeus)幼蟲的飼養(yǎng)溫度由25 ℃提高至30 ℃，30 min后，其唾液腺染色體上出現(xiàn)了特殊的“膨突”[2]。Tissieres于1974 年證實(shí)發(fā)生這種現(xiàn)象的原因是因?yàn)檫@個(gè)過程中產(chǎn)生了一系列分子量為70 ku和26 ku的蛋白質(zhì)[3]，這些蛋白質(zhì)被命名為熱休克蛋白。熱休克蛋白不但廣泛存在于原核、真核生物中，而且還存在于生物體的不同組織和細(xì)胞內(nèi)。依據(jù)分子量的大小分為HSP110、HSP90、HSP70、HSP60和一些小分子熱休克蛋白[4-5]，且不同物種的熱休克蛋白有很高的同源性[6]。熱休克蛋白對(duì)維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著重要作用，目前已成為當(dāng)今世界生命科學(xué)各個(gè)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

HSP90是HSPs家族中重要成員，除具有穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、參與細(xì)胞周期調(diào)控的作用，還在生物體的穩(wěn)態(tài)維持中發(fā)揮重要作用，如應(yīng)激損傷、腫瘤、自身免疫性等[7]。研究發(fā)現(xiàn)，HSP90在蛋白的折疊、蛋白降解和信號(hào)的傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用[8-10]，調(diào)節(jié)微生物體內(nèi)蛋白，保護(hù)細(xì)胞活性，在形成真菌耐藥性的過程中也同樣起著重要的作用[11]。在正?；蛎{迫條件下的各種類型細(xì)胞胞質(zhì)中都有存在，不論是在高等真核細(xì)胞還是在酵母中，HSP90都是和配體轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞周期調(diào)控因子相互作用的，作為陪伴蛋白與變性蛋白結(jié)合，維持它們的折疊狀態(tài)，避免不可逆的損傷[12-17]，還可與蛋白激酶和類固醇激素受體等信號(hào)傳導(dǎo)蛋白相互作用并形成復(fù)合體，使其具有生物活性。在無脅迫條件下，HSP90也是真核生物必不可少的[18]，占細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白的1%～2%[19]，對(duì)細(xì)胞在生理、病理及應(yīng)激條件下的生存發(fā)揮著重要作用[20]。

苜蓿夜蛾[Heliothisviriplaca(Hüfnagel)]屬鱗翅目，夜蛾科，是大豆的重要食葉性昆蟲。目前，對(duì)苜蓿夜蛾的防治主要還是通過噴灑化學(xué)殺蟲劑這種傳統(tǒng)的方法來防除。本研究通過對(duì)苜蓿夜蛾HSP90基因cDNA序列進(jìn)行克隆，獲取基因cDNA全長序列，并研究了該基因在不同組織和發(fā)育階段的表達(dá)情況，將該基因在大腸桿菌原核系統(tǒng)進(jìn)行了成功表達(dá)，為苜蓿夜蛾分子生物學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 昆蟲材料、試劑、質(zhì)粒與菌株

于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)基地大豆田采集苜蓿夜蛾幼蟲，室內(nèi)用新鮮大豆葉喂養(yǎng)到不同蟲態(tài)備用。

RNA提取試劑盒TRIzolReagent為Invitrogen公司產(chǎn)品、反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV Reverse Transcriptase、低熔點(diǎn)瓊脂糖購自Promega公司；DL2 000 DNA Marker、 DNA膠回收試劑盒、克隆載體pMD18-T、Taqplus DNA聚合酶購自TaKaRa公司；受體菌DH5α、BL21和表達(dá)載體pET21b由本實(shí)驗(yàn)室保存。一抗：碧云天生物技術(shù)研究所His-tag抗體；新型一步法快速WB試劑盒(鼠)由生工生物工程(上海)股份有限公司提供；DAB染色試劑盒由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 蟲體總RNA的提取

提取苜蓿夜蛾5齡幼蟲蟲體總RNA，提取方法參照RNA提取試劑盒說明，提取的總RNA放入-80 ℃冰箱中備用。

1.3 利用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆基因cDNA序列

1.3.1 利用RT-PCR克隆部分cDNA序列

對(duì)報(bào)道的兩種昆蟲谷實(shí)夜蛾[Helicoverpazea(Boddie)](GQ389710)和棉鈴蟲[Helicoverpaarmigera(Hübner)](HM593517)的hsp90核苷酸序列進(jìn)行比較分析，設(shè)計(jì)一對(duì)引物hsp90(c)F: 5′-GAA GCG CAA GAA CAA CAT CAA GCT-3′ 和hsp90(c)R：5′-CTG GTC ACG GTT CTC ACC AGT GA-3′。以O(shè)ligo (dt)3site-Ro-Ri primer：5′-ATC GAT GGT CGA CGC ATG CGG ATC CAA AGC TTG AAT TCG AGC TCT TTT TTT TTT TTT TTT TT-3′為引物，所提取的總RNA為底物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以hsp90(c)F和hsp90(c)R擴(kuò)增苜蓿夜蛾cDNA序列的部分片段。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃，30 s；54 ℃，1 min；72 ℃，30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物回收，與pMD18-T vector連接，轉(zhuǎn)化DH5α，菌落在含有氨芐青霉素的平板上進(jìn)行抗性篩選，對(duì)陽性克隆菌株進(jìn)行酶切和PCR鑒定。連接正確的重組子由上海生工生物工程公司進(jìn)行序列測定。

1.3.2 利用5′RACE克隆基因的5′端cDNA序列

利用TaKaRa 5′-Full RACE Kit克隆基因cDNA 5′端序列。根據(jù)已得到的cDNA片段和5′RACE試劑盒中的5′-RACE outer primer和5′-RACE inner primer分別設(shè)計(jì)引物Hvhsp90(5)outer primer： 5′-TCG ACC ACA CCC TTG ATG AAG TT-3′和Hvhsp90(5)inner primer：5′-CGC AGT TGT CCA TGA TGA ACA CCC TGC GG-3′，以引物5′-RACE outer primer 和Hvhsp90(5)outer primer進(jìn)行第1輪PCR。PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃，30 s；54.8 ℃，1 min；72 ℃，1 min 10 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取首次擴(kuò)增產(chǎn)物1 μL，用5′-RACE inner primer、Hvhsp90(5)inner primer引物進(jìn)行第2次PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃，30 s；56.7 ℃，1 min；72 ℃，75 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析。PCR產(chǎn)物回收、與pMD18-T載體連接、轉(zhuǎn)化并測序。

1.3.3 克隆基因的3′端cDNA序列

根據(jù)得到的cDNA保守區(qū)序列設(shè)計(jì)2個(gè)克隆基因3′端的上游引物Hvhsp90(3)outer primer： 5′-CTG GCT GAC TTG CTC CGC TAC CAC ACA TCT G-3′和Hvhsp90(3)inner primer：5′-CCG CAT GAA GGA GAA CCA GAA ACA-3′。利用這2個(gè)引物與3′-RACE outer primer：5′-ATC GAT GGT CGA CGC ATG CGG ATC C-3′和3′-RACE inner primer：5′-GGA TCC AAA GCT TGA ATT CGA GC TCT進(jìn)行3′端cDNA序列克隆。以引物3′-RACE outer primer 和Hvhsp90(3)outer primer進(jìn)行第1輪PCR。PCR 反應(yīng)條件為: 94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃，30 s；67 ℃，1 min；72 ℃，1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取首次擴(kuò)增產(chǎn)物1 μL，用3′-RACE inner primer、Hvhsp90(3)inner primer引物進(jìn)行第2次PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為: 94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃，30 s；58 ℃，1 min；72 ℃，55 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增完成后用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。檢測結(jié)果正確后用凝膠回收試劑盒回收，回收產(chǎn)物與pMD18-T載體連接、轉(zhuǎn)化、篩選、鑒定、序列測定，方法同上。

1.3.4 全長基因的克隆

對(duì)RT-PCR和RACE技術(shù)克隆得到的各個(gè)cDNA序列片段進(jìn)行拼接得到全長cDNA序列，設(shè)計(jì)克隆基因全長序列的引物，一次性克隆獲得全長序列。

1.4 序列分析

用BioXM軟件對(duì)獲得的cDNA序列進(jìn)行翻譯；ExPASy網(wǎng)站(http:∥ca.expasy.org/tools/)的Compute pI/Mw蛋白分析軟件推導(dǎo)氨基酸序列的分子量、等電點(diǎn)；SignalP 4.1 Server進(jìn)行信號(hào)肽的預(yù)測；clustalx、MEGA5.0、boxshade軟件進(jìn)行同源性比較和系統(tǒng)進(jìn)化分析。

1.5 基因mRNA的時(shí)空表達(dá)研究

提取苜蓿夜蛾幼蟲取食期(5齡第2天)、預(yù)蛹期、蛹期第2天的蟲體和5齡第2天的6個(gè)組織(前腸、中腸、后腸、脂肪體、馬氏管、唾腺)的總RNA，3次重復(fù)。提取的RNA用DNA酶處理，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

利用RT-PCR進(jìn)行不同組織和發(fā)育階段表達(dá)的鑒定。擴(kuò)增引物為5′-GAA GCG CAA GAA CAA CAT CAA GCT-3′和5′-CTG GTC ACG GTT CTC ACC AGT GA-3′，PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃，30 s；54 ℃，30 s；72 ℃，28 s，30個(gè)循環(huán)；以β-actin作為對(duì)照，引物為： 5′-CCA ACG GCA TCC ACG AGA CCA-3′和5′-TCG GCG ATA CCA GGG TAC AT-3′，PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃，30 s；52 ℃，30 s；72 ℃，20 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物均經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.6 Hvhsp90基因的原核表達(dá)及重組蛋白的Western blot鑒定

設(shè)計(jì)表達(dá)引物Hvhsp90EcoRI：CCG CTC GAG CGG CCA TGC GCG ACG CAT CGT CAG和 Hvhsp90XhoI：CCG CTC GAG CGG CCA TGC GCG ACG CAT CGT CAG，以cDNA為模板擴(kuò)增Hvhsp90的ORF，得到的目的基因的ORF和原核表達(dá)載體pET-21b(+)分別用EcoRⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切；兩種酶切產(chǎn)物經(jīng)切膠純化后，應(yīng)用T4連接酶重新連接以獲得有基因插入的重組質(zhì)粒，并命名重組質(zhì)粒為hsp90-pET21b。將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞中，活化后涂于加氨芐青霉素平板(Amp 50 μg/mL)，進(jìn)行37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落于加入氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，利用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ酶切并測序鑒定其正確性。次日1∶100接種于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)至A600 nm為0. 6，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，分別在20 ℃和37 ℃下以160 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h后，離心收集菌體，進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

將分離后的蛋白轉(zhuǎn)印PVDF膜85 min， 用4 ℃保存的TBS雜交膜清洗液洗滌2次，每次5 min。洗滌完成后用配制好的封閉液室溫孵育5 min，將膜從封閉液中取出后，浸入蒸餾水中，在水平搖床上以較大轉(zhuǎn)速漂洗2次，每次1 min。將一抗(His-tag抗體)，抗體反應(yīng)液HRP(鼠)及抗體稀釋液混合而成的抗體孵育液加至膜上，于水平搖床上以適當(dāng)速度室溫孵育40 min左右。將膜放入蒸餾水中漂洗30 s，再用洗滌液漂洗3 min，之后再用蒸餾水漂洗30 s。經(jīng)充分洗滌后用DAB染色試劑盒顯色鑒定表達(dá)產(chǎn)物。

2 結(jié)果與分析

2.1 hsp90基因cDNA序列的獲得

利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出苜蓿夜蛾hsp90部分cDNA序列，用BLAST軟件搜索，找到同源性較高的序列均為昆蟲hsp90 cDNA序列，初步斷定這段cDNA序列屬于昆蟲hsp90全長cDNA序列的一部分。利用獲得的序列設(shè)計(jì)克隆基因5′ 和3′ 端的引物，克隆得到基因的5′ 和3′ 端序列，經(jīng)過序列拼接和全長基因測序得到基因包括完整開放讀碼框在內(nèi)的cDNA序列，命名為Hvhsp90。GenBank登錄號(hào)為KF636495。該基因的cDNA序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列見圖1。

2.2 hsp90基因cDNA序列和氨基酸序列分析

苜蓿夜蛾hsp90 cDNA序列含有2 472個(gè)堿基，5′端有1個(gè)151個(gè)堿基的非編碼區(qū)，3′端含有1個(gè)162個(gè)堿基的非編碼區(qū)，包括一個(gè)2 154個(gè)堿基的開放讀碼框，編碼717個(gè)氨基酸組成的多肽，分子量為82.5 ku，多肽的等電點(diǎn)4.97。多肽的13～14位為信號(hào)肽切割位點(diǎn)，在36～55(NKEIFLRELISNSSDALDKIR)、102～110(LGTIAKSGT)、126～141(IGQFGVGFYSCYLVAD)、347～356(IKLYVHRVFI)與372～387(GVVDSEDLPLNISRE)為HSP90家族標(biāo)簽序列，C端保守序列為MEEVD。所獲得的序列符合HSP90家族所特有的氨基酸序列特征[4]，因此確認(rèn)該序列是苜蓿夜蛾hsp90基因完整編碼區(qū)cDNA序列。

2.3 HvHSP90氨基酸序列比對(duì)

Hvhsp90核苷酸序列所推導(dǎo)的HvHSP90與已經(jīng)克隆得到的其他鱗翅目HSP90序列進(jìn)行了比對(duì)。結(jié)果表明，苜蓿夜蛾HSP90與夜蛾科的谷實(shí)夜蛾(H.zea)(GQ389710)、棉鈴蟲(H.armigera)(HM593517)、斜紋夜蛾[Spodopteralitura(Fabricius)](GU230735)、煙實(shí)夜蛾[H.assulta(Guenée)](GU230739)一致性達(dá)到99%，與另外幾種夜蛾科昆蟲甜菜夜蛾[Spodopteraexigua(Hübner)](FJ524853)、甘藍(lán)夜蛾[Mamestrabrassicae(Linnaeus)](AB251894)、東方黏蟲(MythimnaseparataWalker)(GU230737)一致性達(dá)到98%，與其他幾種鱗翅目昆蟲的一致性也在85%以上，如表1。

表1 不同鱗翅目昆蟲HSP90基本特征及與苜蓿夜蛾HSP90氨基酸序列的一致性1)

1)帶*號(hào)的為本研究克隆得到基因的氨基酸序列。

*, the amino acid sequence determined in this study.

圖2 鱗翅目昆蟲HSP90氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.2 Phylogenetic tree based on HSP90 amino acid sequences of lepidopteran insects

對(duì)苜蓿夜蛾HSP90氨基酸序列與已經(jīng)克隆得到的其他鱗翅目HSP90序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，構(gòu)建進(jìn)化樹(圖2)。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，苜蓿夜蛾的熱休克蛋白與同一科的煙實(shí)夜蛾、棉鈴蟲、谷實(shí)夜蛾、斜紋夜蛾關(guān)系較近，繼而與同一目的其他科的關(guān)系較近，但與非鱗翅目昆蟲關(guān)系較遠(yuǎn)(數(shù)據(jù)未列出)。

2.4 苜蓿夜蛾hsp90基因mRNA在不同組織中表達(dá)

組織特異性表達(dá)結(jié)果表明，hsp90在苜蓿夜蛾幼蟲取食期(5齡第2天)、預(yù)蛹期、蛹期(蛹?xì)ば纬傻?天)等不同發(fā)育階段和5齡幼蟲的馬氏管、唾腺、中腸、脂肪體、前腸、后腸等不同組織中均有表達(dá)(圖3)，結(jié)果表明hsp90基因在昆蟲的多個(gè)組織中均表達(dá)。

2.5 HSP90原核表達(dá)和重組蛋白的免疫印跡分析

重組載體hsp90-pET21b轉(zhuǎn)化到宿主菌株BL21，并測序驗(yàn)證與本試驗(yàn)克隆所得Hvhsp90無任何堿基突變后確定為陽性克隆，并在菌株中進(jìn)行異源表達(dá)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后用10%的凝膠進(jìn)行SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)染色檢測結(jié)果顯示，含hsp90-pET21b的菌株表達(dá)出大小約82.5 ku的特異性蛋白條帶(圖4)，與理論大小相符，而未插入目的基因的空質(zhì)粒在相應(yīng)的位置未出現(xiàn)特異性片段的高效表達(dá)。

圖3 苜蓿夜蛾hsp90基因在不同發(fā)育階段與不同組織中的表達(dá)Fig.3 hsp90 expression in different developmental stages and different tissues of Heliothis viriplaca

表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE膠分離，再經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、顯色后，Western blotting結(jié)果表明在82.5 ku左右處有一條明顯的雜交帶出現(xiàn)(圖4)，與目標(biāo)蛋白分子量大小完全吻合，表明該重組質(zhì)?？梢栽谥亟M菌中穩(wěn)定表達(dá)。

圖4 融合蛋白表達(dá)的SDS-PAGE和Western blotting 鑒定結(jié)果分析Fig.4 Analysis of SDS-PAGE and Western blotting of purified recombinant protein

3 討論

昆蟲在自然界中遭受到高溫脅迫或其他誘導(dǎo)等情況時(shí)產(chǎn)生熱休克蛋白，它是當(dāng)今生物抗逆研究的重要內(nèi)容。該序列含有5個(gè)HSP90家族簽名序列和C端保守序列MEEVD。通過與其他鱗翅目昆蟲HSP90蛋白進(jìn)行同源性比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析，可以明顯看出Hvhsp90所編碼的蛋白與夜蛾科的谷實(shí)夜蛾、棉鈴蟲、甜菜夜蛾、甘藍(lán)夜蛾等昆蟲HSP90同源性較高，而與鱗翅目非夜蛾科昆蟲同源性相對(duì)較低。同時(shí)，GenBank上登錄的棉鈴蟲有3條hsp90基因，甜菜夜蛾[21-22]和東方黏蟲中有2條hsp90基因，說明同種昆蟲中存在多種不同類型hsp90基因?？稍诤罄m(xù)的研究中繼續(xù)克隆苜蓿夜蛾的其他hsp90基因，進(jìn)一步完善昆蟲hsp90基因拷貝數(shù)研究。

不同時(shí)期和不同組織的表達(dá)結(jié)果表明，hsp90在苜蓿夜蛾的多個(gè)發(fā)育階段和組織均有表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)HSP90的生物學(xué)功能的重要性。本研究只進(jìn)行了表達(dá)的定性分析，不同發(fā)育階段和組織表達(dá)量的差異、不同組織和不同發(fā)育階段的昆蟲在高溫、低溫下的表達(dá)量的變化以及該基因沉默時(shí)昆蟲對(duì)外界環(huán)境變化的反應(yīng)可進(jìn)一步利用實(shí)時(shí)熒光定量和RNAi技術(shù)進(jìn)行深入研究。

構(gòu)建的原核表達(dá)載體hsp90-pET21b在20 ℃和37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE分離和Western blotting驗(yàn)證，兩個(gè)溫度下該載體均能夠在大腸桿菌中高效表達(dá)出重組的融合蛋白，且均為包涵體蛋白。該表達(dá)系統(tǒng)能否表達(dá)出可溶性蛋白可通過進(jìn)一步的條件優(yōu)化進(jìn)行探討或者利用其他真核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行研究。表達(dá)蛋白的獲得為下一步制備單克隆抗體及其生理功能研究奠定基礎(chǔ)。

相關(guān)研究表明，昆蟲經(jīng)不同溫度處理，體內(nèi)的hsp90表達(dá)量隨溫度的升高明顯升高[23-24]，表明產(chǎn)生hsp90是昆蟲抵御外界不良環(huán)境因子的重要途徑之一?；趆sp90的重要作用，已有應(yīng)用RNAi技術(shù)防治害蟲的報(bào)道，如赤擬谷盜注射dsRNA后，蟲體的繁殖率下降，壽命明顯縮短[25]。本文克隆的全長cDNA序列為進(jìn)一步研究苜蓿夜蛾的溫度耐受能力和相關(guān)分子生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

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cDNA cloning and expression of hsp90 from Heliothis viriplaca

Zhang Huan, Liu Hongjuan, Gao Yanling, Dong Tianyu, Zhao Kuijun, Fan Dong

(College of Agronomy, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Heat shock proteins(HSPs)are key elements of the organism’s adaptive response to adverse environment. HSP90 family is an important member of HSP superfamily. By using RT-PCR and rapid amplification of cDNA ends (RACE) techniques, the full-length HSP90 cDNA sequence was obtained from the marbled clover,Heliothisviriplaca(Hüfnagel) and designated as Hvhsp90 (GenBank accession no. KF636495). The cDNA sequence of Hvhsp90 was 2 472 bp, including an open reading frame of 2 154 bp encoding a polypeptide of 717 amino acids with an estimated molecular mass of 82.5 ku and an estimated isoelectric point of 4.97. The amino acid sequence contained five signature sequences of HSP90 family and a C-terminal cytoplasmic character sequence (MEEVD). Sequence alignment showed that HvHSP90 shared 85%-99% identity with HSP90 sequences reported in other lepidopteran insects. mRNA transcripts were expressed during various developmental stages and in different tissues based on RT-PCR. SDS-PAGE and Western blot results revealed that HvHSP90 was expressed successfully inE.coli. The molecular weight of the expressed protein was consistent with the predicted molecular weight of HvHSP90.

Heliothisviriplaca; heat shock protein 90; cloning; expression

2014-02-24

2014-05-20

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-4)

Q 785

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.02.005

* 通信作者 Tel:0451-55191643；E-mail：dnfd@163.com