段志濤，莊君英(寧波市鎮(zhèn)海區(qū)畜牧獸醫(yī)總站，浙江寧波315202)

SICT與ELISA法在奶牛結(jié)核病檢測中的應(yīng)用試驗(yàn)

段志濤，莊君英
(寧波市鎮(zhèn)海區(qū)畜牧獸醫(yī)總站，浙江寧波315202)

為準(zhǔn)確評估寧波市鎮(zhèn)海區(qū)奶牛結(jié)核病檢測中陽性牛的感染率，對現(xiàn)存奶牛養(yǎng)殖場的184頭奶牛，分別采用SICT與ELISA檢測方法進(jìn)行檢測，對這兩種方法的檢出率、符合率進(jìn)行比較分析。經(jīng)試驗(yàn)，SICT與ELISA兩種檢測方法奶牛結(jié)核病陽性牛的檢出率分別為1.63%(3/184)和0.54%(1/184)，且SICT法的陽性檢測率高于ELISA法，兩種檢測方法的陽性符合率為33.3%(1/3)。

結(jié)核病;變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn);酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn);奶牛

牛結(jié)核病是由牛分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌引起的一種人畜共患慢性傳染病，呈世界性分布，在我國被列為二類動物疫病。結(jié)核病的廣泛傳播與蔓延，對人畜健康和畜牧業(yè)的發(fā)展帶來了嚴(yán)重危害。我國是世界上結(jié)核病感染最重的22個(gè)國家之一［1］。2000年第四次全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告顯示，結(jié)核病的感染率為44.5%［2］。部分研究人員認(rèn)為，肺結(jié)核病人中約有15%的結(jié)核病患者是因飲用結(jié)核病牛的牛奶而發(fā)病的［3］。

目前，我國對奶牛結(jié)核病的檢測主要采用牛型分枝桿菌提純蛋白衍生物(PPD)進(jìn)行單純頸部皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)(SICT)，對檢出的陽性牛進(jìn)行隔離或淘汰。但該方法存在較高的非特異性，在結(jié)核病流行地區(qū)采用該法進(jìn)行牛群普檢，則有利于感染牛的早期檢出。但在結(jié)核病控制或穩(wěn)定地區(qū)，采用該法則不利于結(jié)核病凈化。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測法在奶牛結(jié)核病檢測中則具有方便、快速、高通量、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，其檢測機(jī)理有別于SICT法。

本試驗(yàn)采用SICT與ELISA相結(jié)合的方法，現(xiàn)將試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告如下，供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)在寧波市鎮(zhèn)海區(qū)某奶牛場進(jìn)行，檢測奶牛184頭。

牛分枝桿菌ELISA抗體檢測試劑盒由武漢某生物制品有限公司生產(chǎn)，結(jié)核菌素由哈爾濱某生物疫苗有限公司生產(chǎn)。

1.2 SICT試驗(yàn)

1.2.1 術(shù)前處理 頸側(cè)中部上1/3處剪毛，3月齡內(nèi)犢牛，也可在肩胛部進(jìn)行，直徑約10 cm，用卡尺測量術(shù)部中央皮皺厚度，做好記錄。

1.2.2 檢測方法 75%酒精消毒術(shù)部，不論大小牛只，一律皮內(nèi)注射牛型提純結(jié)核菌素1萬國際單位。即將牛型提純結(jié)核菌素稀釋成每mL含10萬國際單位后，皮內(nèi)注射0.1 mL。凍干菌素應(yīng)當(dāng)天稀釋后當(dāng)天用完。

1.2.3 結(jié)果判定 注射后72 h，仔細(xì)觀察牛頸側(cè)注射部位局部有無熱痛、腫脹等炎性反應(yīng)，若注射部位局部有明顯炎癥反應(yīng)，皮皺厚度增加4 mm及以上者，判為陽性;若注射部位局部炎癥反應(yīng)不明顯，皮皺厚度增加2～4 mm者，判為可疑;注射部位局部無炎癥反應(yīng)，皮皺厚度增加2 mm以下者，判為陰性。可疑牛經(jīng)42 d后重復(fù)上述試驗(yàn)，結(jié)果仍為可疑及以上者，直接判為陽性，否則判定為陰性。

1.3 ELISA試驗(yàn)

1.3.1 待檢血清 待檢牛尾靜脈無菌采血5 mL，45°傾斜4℃過夜，離心采集血清，備用。

1.3.2 檢測方法

1.3.2.1 配液 將20倍濃縮洗滌液用去離子水作20倍稀釋后備用。

1.3.2.2 編號 將樣品與對應(yīng)微孔按序編號，每板設(shè)陰、陽性對照各2孔。

1.3.2.3 加樣 將待檢血清在血清稀釋板中按1∶100稀釋，對照血清在血清稀釋板中按1∶10稀釋，取抗原包被板，每孔加入100μL稀釋樣品。輕輕振勻孔中樣品，置37℃下溫育30 min。

1.3.2.4 洗滌 甩去板孔中溶液，每孔加入稀釋洗滌液200μL，靜置1 min后倒棄，用吸水紙拍干，重復(fù)洗滌5次。每孔加入羊抗牛酶標(biāo)二抗100μL，置37℃下溫育30 min，洗滌5次。

1.3.2.5 顯色 每孔加入顯色劑A 50μL，再加入顯色劑B 50μL，混勻，置室溫(20～25℃)下避光顯色10 min。

1.3.2.6 終止 每孔加入終止液50μL，10 min內(nèi)測定結(jié)果。

1.3.3 結(jié)果判定 酶標(biāo)儀測定各孔OD630nm值。試驗(yàn)成立條件，陽性對照OD630nm值均≥0.70，陰性對照OD630nm值均<0.31。計(jì)算S/P=(樣品OD630nm-陰性對照OD630nm平均值)/(陽性對照OD630nm平均值-陰性對照OD630nm平均值)，如S/P≥0.17，判為陽性;S/P<0.17，判為陰性。

2 結(jié)果與分析

184頭奶牛同時(shí)應(yīng)用SICT法和ELISA法進(jìn)行檢測，結(jié)果見表1。

表1 SICT法和ELISA法檢測(單位:頭)

由表1可見，SICT法檢出陽性牛3頭，陰性牛181頭，陽性檢出率為1.63%(3/184);ELISA法檢出陽性牛 1頭，陰性牛 183頭，陽性檢出率為0.54%(1/184)。兩種檢測方法的檢測結(jié)果表明，該牛場結(jié)核病感染率較低，且SICT法的陽性檢出率高于ELISA法，兩法之間的陽性符合數(shù)為1頭，陽性符合率為33.33%(1/3)。

兩種檢測方法，如果以SICT法作為金標(biāo)準(zhǔn)，3頭陽性牛中，ELISA法的陽性符合數(shù)為1頭，其敏感性為33.33%(1/3);181頭陰性牛中，ELISA法試驗(yàn)檢出的陰性牛為181頭，其特異性為100%(181/ 181)。如果以ELISA法作為金標(biāo)準(zhǔn)，ELISA法183頭陰性牛中，SICT法檢出的陰性牛為181頭，其特異性為98.91%(181/183)。

經(jīng)本次試驗(yàn)檢測，表明兩種方法均具有同等良好特異性，但敏感性SICT法優(yōu)于ELISA法。

3 小結(jié)與討論

一般情況下，我國奶牛結(jié)核病檢測大都采用結(jié)核分枝桿菌對結(jié)核菌素產(chǎn)生一種遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)，進(jìn)行單純牛型PPD試驗(yàn)作為結(jié)核病的檢測標(biāo)準(zhǔn)，這種方法并不十分理想。一是不同廠家生產(chǎn)的PPD產(chǎn)品本身存在質(zhì)量差異;二是SICT檢測方法存在較高的非特異性，很多物理性、化學(xué)性或生物性因素可能影響檢測結(jié)果，如牛白血病病毒、副結(jié)核桿菌、禽型分枝桿菌或非結(jié)核分枝桿菌等微生物感染都可導(dǎo)致假陽性結(jié)果［4］。

寧波市鎮(zhèn)海區(qū)地處沿海，屬經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)，對奶牛結(jié)核病防控十分重視，奶牛結(jié)核病的發(fā)病率較低。單純應(yīng)用SICT法檢測，較高的非特異性將可能淘汰許多非結(jié)核陽性牛，給養(yǎng)殖戶帶來較大經(jīng)濟(jì)損失。因此，在保持傳統(tǒng)的SICT法檢測的同時(shí)，有條件的地區(qū)應(yīng)逐步引進(jìn)采用ELISA檢測法。

SICT法主要檢測細(xì)胞免疫，ELISA則主要檢測體液免疫。當(dāng)結(jié)核分枝桿菌感染動物時(shí)，動物機(jī)體對結(jié)核分枝桿菌的免疫首先是細(xì)胞免疫，其次才是體液免疫［5］。對ELISA法檢測的陽性牛，不論其變態(tài)反應(yīng)為陽性或陰性，都應(yīng)認(rèn)為是活動性結(jié)核，應(yīng)一律淘汰;SICT法檢測為陽性而ELISA法檢測為陰性者，一般為結(jié)核初期、封閉期或非特異反應(yīng)，應(yīng)進(jìn)行隔離飼養(yǎng)或淘汰，并定期加強(qiáng)ELISA檢測。將兩種方法有機(jī)結(jié)合，才能達(dá)到有效凈化與控制奶牛結(jié)核病的目的。

［1］World Health Organization.Global tuberculosis control: key findings from the December 2009 WHO report［J］. Wkly Epidermal Rec，2010，85(9):69-80.

［2］全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組.第四次全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2002，25(1):3-7.

［3］徐廣賢，趙德明.牛分枝桿菌與肺結(jié)核分枝桿菌基因組的比較［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2006，6(7):67-69.

［4］林世平，楊應(yīng)周，譚衛(wèi)國，等.牛鼻腔分泌物非結(jié)核分枝桿菌分離培養(yǎng)物結(jié)果分析［J］.中國熱帶醫(yī)學(xué)，2005，5 (6):1207-1209.

［5］Emmerzaal A，Deleu S.Cattle tuberculosis by Mycobacterium bovine is difficult to detect and to treat ［J］.Veehouderen Diercnarts，2000，14(2):427.

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2014-08-20